CN105695518A - 一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法 - Google Patents

一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)单宁酶生产菌的培养：黑曲霉B1401的活化及其生产菌孢子悬浮液的制备；(2)固定化细胞的制备：产酶培养基、载体材料的处理和固定化细胞的制备及产酶培养；(3)固定化菌体生物法转化单宁酸制备没食子酸：在经发酵产酶好的固定化菌株溶液中添加单宁酸进行反应，得到没食子酸；(4)固定化菌体生物法重复转化单宁酸制备没食子酸：将步骤(3)中转化好的发酵液进行固定化菌体与发酵液分离，重新在固定化菌体中分批添加与上述相同量的单宁酸，重复步骤(3)对单宁酸溶液进行直接转化后分离之后再转化。

Description

一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的技术。
背景技术
没食子酸(gallicacid，GA)又称倍酸、五倍子酸，为白色或淡黄色针状结晶粉末，化学名称3,4,5-三羟基苯甲酸，分子式为C6H2(OH)3COOH，分子量170.12。
没食子酸是一种重要的精细化工原料，能广泛应用于化工、农业、食品、制药等行业。可合成染料、金属提取剂，可制备性能优良的食品抗氧化剂没食子酸酯；能作为医药中间体，合成重要的医药产品；没食子酸可以用来制造多种燃料、焰火稳定剂、阻燃剂、着色剂和笛音剂，可以作为植物生长调节剂，与维生素C配合强化饵料养鱼，也是紫外线吸收剂、半导体光致抗蚀原料，可配制防锈底漆和铝合金有机涂层，配制水基钻探泥浆用流化剂。用于制革，照相显影剂，检测游离无机酸、二羟基丙酮、生物碱和金属等的分析试剂。
没食子酸制备是采用富含单宁的物质通过对单宁酸分子中酯键的水解而获得。目前，没食子酸的制备方法可分为化学法与生物法，化学法根据所使用的催化剂的不同，可分为酸水解法与碱水解法，生物法又可分为发酵法和酶法。化学法存在副反应多，水解液的色泽较深，没食子酸产品纯度普遍不高，生产过程中产生具有酸高、钠离子含量高、酚类物质多，色度深、不太适合微生物处理的大量废水及脱色活性炭的废渣，对环境污染严重，处理成本高等不足。酶法是利用单宁酶高效、专一、定向水解单宁酸制备没食子酸，但存在需从菌体中分离纯化单宁酶，其酶的生产成本较高，酶作用的反应时间长等不足。发酵法是利用高产单宁酶的生产菌株直接降解没食子单宁制备没食子酸，不用分离纯化单宁酶，但存在培菌时间较长，使整个转化生产周期长，成本高等特点。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：对高产单宁酶的生产菌体进行固定化，利用生物法转化重复单宁酸制备没食子酸的技术，达到减少酶的分离、纯化，实现菌体的多次重复利用，降低了生产成本和污染，简化了工艺，缩短了生物法转化制备没食子酸的周期，产物产率也有较大提高的目的。从而为实现单宁酸生物法转化制备没食子酸的高效、清洁、低成本的规模化生产提供可能。
本发明的技术方案是：一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法，包含以下步骤：(1)单宁酶孢子悬浮液的制备：黑曲霉B1401的活化及其生产菌孢子悬浮液的制备；(2)固定化细胞的制备：产酶培养基配置、载体材料的处理和固定化细胞的制备及其产酶培养；(3)固定化菌体生物法转化单宁酸制备没食子酸：在经培菌产酶好的固定化菌体溶液中添加单宁酸进行反应，得到没食子酸；(4)固定化菌体生物法重复转化单宁酸制备没食子酸：将步骤(3)中转化好的发酵液进行固定化菌体与发酵液分离，重新在固定化菌体中分批添加与上述相同量的单宁酸溶液，重复步骤(3)对单宁酸溶液进行反复转化，再分离之后再转化。
所述的菌种的活化：将黑曲霉B1401转接到察氏斜面培养基后，放入霉菌培养箱中，于30℃条件下培养70～80h。
所述的生产菌孢子悬浮液的制备：将经活化的试管斜面加入生理盐水，充分震荡、稀释后制得孢子悬浮液。
所述的产酶培养基：6％单宁酸，2.5％葡萄糖，1％(NH4)2SO4，0.1％MgSO4·7H2O，0.1％NaNO3，0.1％K2HPO4·3H2O，pH值5.0，其中百分比均为w/v。
所述的载体材料的处理：将丝瓜瓤状的聚酯纤维材料剪成立方块，经盐酸浸泡洗涤,后经氢氧化钠洗涤，最后用蒸馏水彻底洗至中性后，烘干备用。
所述的固定化细胞的制备：取处理后的载体材料，投入经灭菌后产酶培养基中，按体积比2％～2.5％的比例接入生产菌的孢子悬浮液，在转速160～180r/min，温度35℃的条件下进行产酶培养72～84h。
所述的步骤(3)中的反应条件为：将经发酵产酶好的固定化菌株溶液，分批添加总量为18％～20％的单宁酸，反应转速140～160r/min，反应温度35℃，pH维持在4.0～5.0的条件下，反应44～48h。
将转化好的发酵液进行固定化菌体与发酵液分离，重新在固定化菌体中分批添加18％～20％的单宁酸溶液，在140～160r/min，35℃，pH4.0～5.0的条件下，反应44～48h后，再分离后再多次转化。
本发明的有益效果：本发明直接利用固定化菌体中的单宁酶将单宁酸生物法水解重复制备没食子酸的方法。该方法所选用的丝瓜瓤状聚酯纤维作为固定化载体具有韧性好、网状结构稳定、高比表面积，但又不影响好气性丝状真菌培养所需传质及溶氧等优点；采用固定化高产单宁酶菌体细胞，一次性培养生产菌产酶，之后可通过简单的分离固定化细胞及转化液，实现含单宁酶的菌体重复转化单宁酸制备没食子酸的生产，大幅度缩短生产时间，降低生产成本，提高发酵效率。
附图说明
图1为固定化菌体重复多批次转化单宁酸制备没食子酸的产率变化情况图。
具体实施方式
固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的技术，包括以下步骤：
单宁酶孢子悬浮液的制备：
(1)菌种的活化：将黑曲霉B1401转接到察氏斜面活化培养基上，放入霉菌培养箱中，于30℃条件下培养70～80h，备用；
(2)生产菌孢子悬浮液的制备：将经活化的试管斜面加入10ml的生理盐水，充分震荡、稀释后制得108CFU/mL左右的孢子悬浮液，备用。
固定化细胞的制备：
(1)产酶培养基：6％单宁酸(w/v)，2.5％葡萄糖(w/v)，1％(NH4)2SO4(w/v)，0.1％MgSO4·7H2O(w/v)，0.1％NaNO3(w/v)，0.1％K2HPO4·3H2O(w/v)，pH值5.0。其中6％的单宁酸单独灭菌后，再与其它成份混合；
(2)载体材料的处理：将丝瓜瓤状的聚酯纤维材料剪成1cm3的立方块，经1mol/L盐酸浸泡洗涤30min,然后经1mol/L氢氧化钠洗涤30min，最后用蒸馏水彻底洗至中性后，烘干备用；
(3)固定化细胞的制备：取处理后的载体材料，投入经灭菌后产酶培养基中，按2％～2.5％(v/v)的比例接入生产菌的孢子悬浮液，在转速160～180r/min，温度35℃的条件下进行产酶培养72～84h。
固定化菌体生物法转化单宁酸制备没食子酸：
将经发酵产酶好的固定化菌株溶液中，分批添加总量为18％～20％的单宁酸，反应转速140～160r/min，反应温度35℃，pH维持在4.0～5.0的条件下，反应44～48h，没食子酸产率达65％左右。
固定化菌体生物法重复转化单宁酸制备没食子酸：
将上述转化好的发酵液进行固定化菌体与发酵液分离，重新在固定化菌体中分批添加与上述相同量的单宁酸，与上述相同的转化条件下对单宁酸溶液进行转化48h后分离之后再转化。重复转化35批次其转化产率仍保持较好的稳定，维持在65％左右。其多批次转化没食子酸产率见图1。在转化过程中，固定化菌体仍有增长的趋势，并可采用适当分离部分固定化菌体到其他的相同的容器中继续转化，其转化后没食子酸产率也维持在65％左右。

Claims (8)

1.一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法，其特征在于：包含以下步骤：(1)单宁酶孢子悬浮液的制备：黑曲霉B1401的活化及其生产菌孢子悬浮液的制备；(2)固定化细胞的制备：产酶培养基配置、载体材料的处理和固定化细胞的制备及其产酶培养；(3)固定化菌体生物法转化单宁酸制备没食子酸：在经培菌产酶好的固定化菌体溶液中添加单宁酸进行反应，得到没食子酸；(4)固定化菌体生物法重复转化单宁酸制备没食子酸：将步骤(3)中转化好的发酵液进行固定化菌体与发酵液分离，重新在固定化菌体中分批添加与上述相同量的单宁酸溶液，重复步骤(3)对单宁酸溶液进行反复转化，再分离之后再转化。
2.根据权利要求1所述的一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法，其特征在于：所述的菌种的活化：将黑曲霉B1401转接到察氏斜面培养基后，放入霉菌培养箱中，于30℃条件下培养70～80h。
3.根据权利要求1或2所述的一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法，其特征在于：所述的生产菌孢子悬浮液的制备：将经活化的试管斜面加入生理盐水，充分震荡、稀释后制得孢子悬浮液。
4.根据权利要求1所述的一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法，其特征在于：所述的产酶培养基：6％单宁酸，2.5％葡萄糖，1％(NH4)2SO4，0.1％MgSO4·7H2O，0.1％NaNO3，0.1％K2HPO4·3H2O，pH值5.0，其中百分比均为w/v。
5.根据权利要求1所述的一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法，其特征在于：所述的载体材料的处理：将丝瓜瓤状的聚酯纤维材料剪成立方块，经盐酸浸泡洗涤,后经氢氧化钠洗涤，最后用蒸馏水彻底洗至中性后，烘干备用。
6.根据权利要求1或5所述的一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法，其特征在于：所述的固定化细胞的制备：取处理后的载体材料，投入经灭菌后产酶培养基中，按体积比2％～2.5％的比例接入生产菌的孢子悬浮液，在转速160～180r/min，温度35℃的条件下进行产酶培养72～84h。
7.根据权利要求1或6所述的一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法，其特征在于：所述的步骤(3)中的反应条件为：将经发酵产酶好的固定化菌株溶液，分批添加总量为18％～20％的单宁酸，反应转速140～160r/min，反应温度35℃，pH维持在4.0～5.0的条件下，反应44～48h。
8.根据权利要求4所述的一种固定化菌体生物法转化单宁酸重复制备没食子酸的方法，其特征在于：将转化好的发酵液进行固定化菌体与发酵液分离，重新在固定化菌体中分批添加18％～20％的单宁酸溶液，在140～160r/min，35℃，pH4.0～5.0的条件下，反应44～48h后，再分离后再多次转化。
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