CN107674854B - 一种固氮鞘氨醇单胞菌以及在制备结冷胶中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物发酵，特别是指一种固氮鞘氨醇单胞菌以及在制备结冷胶中的应用。包括将固氮鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas azotifigens)CGMCC No.14239接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中；调节培养液的pH及温度，进行通气搅拌发酵；当培养液粘度不再增长或发酵周期≤50小时发酵结束等工艺步骤，本发明解决了现有技术存在的结冷胶白度低、需要后续脱色处理、工艺收率低技术问题，具有所制备的结冷胶产品白度好、工艺收率高等优点。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵，特别是指一种固氮鞘氨醇单胞菌以及在制备结冷胶中的应用。
背景技术
结冷胶是继黄原胶之后的又一新型微生物胞外多糖，其凝胶性能比黄原胶更为优越。结冷胶是由四个糖分子依次为D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、L-鼠李糖通过糖苷键连接而成的高分子糖类化合物。结冷胶为类白色粉末，无臭无味，无特殊滋味和气味。耐热、耐酸性能良好，对酶的稳定性亦高。不溶于非极性有机溶剂，也不溶于冷水，但略加搅拌即分散于水中，加热即溶解成透明的溶液，冷却后形成透明且坚实的凝胶。传统的生产工艺是由伊乐假单胞菌(Pseudomonas elodea)在中性条件下，在以葡萄糖为碳源，硝酸铵等为氮源结合无机盐制成培养基，发酵在无菌条件下严格控制通气量、搅拌、温度和pH，发酵完成后，发酵液经预处理、脱水处理、醇溶、絮凝、脱水和压榨、干燥、粉碎等工序得到结冷胶产品。
《食品安全国家标准食品添加剂结冷胶》(GB25535-2010)对结冷胶的性能指标进行了限定，其中包括感官指标、理化指标及微生物指标等，其中感官指标要求结冷胶为类白色粉末，并限定了检测方法。
就申请人了解的范围而言，国内结冷胶生产厂家的生产规模小、生产的结冷胶规格较少，工业化生产中依然存在如下问题：一是发酵收率低，一般不超过20g/L。二是发酵产物颜色黄，后提取需对物料进行有机溶剂洗脱物料或加脱色剂处理来保证产品的白度，直接导致生产成本较高及后续处理工艺的复杂化；如果产品颜色呈黄色，在添加使用时影响应用物质的颜色，上述现有工艺存在的缺陷在一定程度上限制了国内结冷胶行业的发展。
申请人检索到的专利文献及存在的问题包括：
1、得率低，申请号为200410064546.X的发明专利申请中公开了一种微生物多糖结冷胶的制备方法，发酵终了结冷胶粗多糖浓度为1.5-1.6g/100ml；申请号为200610068788.5的发明专利申请中公开了一株高产结冷胶的少动鞘氨醇单胞菌及其应用，其中结冷胶粗多糖浓度为16-18g/L；申请号为201210218820.9的发明专利申请中公开了一种结冷胶高效生产菌株及其应用，得率为25.9g/L；
2、发酵液黄色，申请号为200610068788.5的发明专利申请中公开了一株高产结冷胶的少动鞘氨醇单胞菌及其应用，申请号为201210218820.9的发明专利申请中公开了一种结冷胶高效生产菌株及其应用。上述现有技术中由于发酵液为黄色，因此工艺中需用乙醇冲洗脱色(结冷胶)，生产成本高，同，是乙醇的使用影响了生产中安全性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种固氮鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas azotifi gens)JhW170601，其保藏编号为CGMCC No.14239，该菌种具有良好的产结冷胶能力，采用上述菌种并结合优化后的发酵工艺能够有效提高结冷胶产率，并使所制备的结冷胶色泽在符合现有国标的基础上相较现有工艺制备的产品明显改善。
本发明的整体技术构思是：
固氮鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas azotifigens)JhW170601，其保藏编号为CGMCCNo.14239
所述的固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601在制取结冷胶中的应用。
本发明中的固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601申请人已于2017年6月13日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，该保藏单位的简称为CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.14239。
本发明的具体技术特征还有：
本发明中的固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601由申请人自河北省衡水市衡水湖湿地采样分离纯化后得到，其16S rRNA序列如下：
CAACGCCTTCGGGTGAACCCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCTGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGCCTTCATGCTCTCGAGTTGCAGAGAACAATCCGAACTGAGACAAGTTTTGGAGATTAGCTCACCCTCGCGGGATTGCTGCCCACTGTACTTGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCGCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTATCACCGGCGGTTACTTTAAAGTACCCAACTTAATGATGGTAACTAAAGTCGAGGGTTGCGCTCGtTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTGTAGGTCCCCGAAGGGAAGAAAGGCATCTCTGCCAGTCGTCCTACCATGTCAAACGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCAGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGATAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCCAAGTGCCAAGCACCCGGACAGCTAGTTATCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAATACCAGTCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTCACCTCTCCTGGATTCAAGCGATGCAGTCTCAAAGGCAGTTCTGGAGTTGAGCTCCAGGCTTTCACCTCTGACTTACAAAGCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAACAACGCTAGCCCCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGGGCTTATTCTCCCGGTACAGTCATTATCTTCCCGGGTAAAAGAGCTTTACAaCCcTAAGgcCTTCATCACTCACGCGGCATTGCTGGATCAGgCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTAAGGATCGTCGCCTTGGTGCGCCTTTACCACACCAACTAGCTAATCCTACGCGGGCTCATCTCAGGGCGATAAATCTTTGGTCTTTCGACATCATCCGGTATTAGCACCCCTTTCGGGGAGTTATTCCGAACCCCAAGGCAGATTCCCACGCGTTACGCACCCGTGCGCCACTAGACC。
固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601细胞形态和理化实验结果如下：
应用本发明中的固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601在制取结冷胶时优选采用如下工艺步骤：
A、将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中；
B、控制发酵培养基的pH及温度，进行通气发酵制备发酵液；
C、当发酵液粘度不再增长或发酵周期≤50小时发酵结束；
D、对步骤C中制成的发酵液进行提取得到结冷胶。
因上述后提取步骤属于现有常规技术，申请人在此对其中涉及的工艺过程及工艺参数不再赘述。
由于结冷胶制备过程中随着发酵周期的增长发酵液粘度越来越高，发酵热散发慢，因此本发明在发酵过程温度控制采用阶梯控制，前期温度高有利于菌种生长，而后期发酵温度低有利于终产物的生成；优选的技术方案是，所述的步骤B中温度控制条件为发酵开始至30小时内为32℃-36℃，30小时后至发酵结束为28℃-30℃。
为降低发酵液的粘度，以利于发酵液散热及热交换，更为优选的技术方案是，所述的步骤B中通过向发酵液中补充无菌水进行温度控制。
为便于菌体的生长及结冷胶的生成，同时提高结冷胶的技术指标，优选的技术方案是，所述的步骤B中pH为中性或弱碱性。
更为优选的技术方案是，步骤B中pH调节采用质量百分比浓度为5％-10％氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
所述的步骤A、B中发酵培养基优选采用由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖3％-3.5％；鱼蛋白胨0.1％-0.2％；磷酸氢二钾0.05％-0.15％；磷酸二氢钾0.1％-0.2％；无水硫酸镁0.05％-0.08％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
为便于工业化发酵的进行，优选的技术方案是，所述的步骤A中将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601经过扩大培养后，按照种子液：发酵培养基＝8％-12％的接种量将种子液接种于灭菌后的发酵培养基中。
步骤B中通气发酵优选的工艺条件如下：
10小时内：温度32℃-36℃，压力0.03MPa-0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.2vvm-0.3vvm；
11-20小时：温度32℃-36℃，压力0.03MPa-0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.3vvm-0.4vvm；
21-30小时：温度32℃-36℃，压力0.03MPa-0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.4vvm-0.5vvm；21-25小时补入发酵液质量百分含量为1.0％-1.5％的无菌水；
31-40小时：温度28℃-30℃，压力0.03MPa-0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.4vvm-0.5vvm；31-35小时补入发酵液质量百分含量为0.6％-0.8％的无菌水；
41小时-放罐：温度28℃-30℃，压力0.03MPa-0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.5vvm-0.6vvm；41小时补入发酵液质量百分含量为0.5％-0.6％的无菌水。
扩大培养优选的工艺条件如下：
所述的扩大培养包括：
(1)将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601接种于摇瓶种子培养基制成摇瓶种子；
(2)将摇瓶种子经扩大培养后制成种子液；
(3)按种子液：发酵培养基＝8％-12％的接种量，将制成的种子液接入灭菌后的发酵培养基中进行通气发酵。
扩大培养中各步骤优选的技术方案如下：
所述的步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为32℃-36℃、转速为180-220转/分钟，培养周期为10-12小时；摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1％-1.5％；鱼蛋白胨0.1％-0.2％；磷酸氢二钾0.05％-0.15％；磷酸二氢钾质量0.1％-0.2％；无水硫酸镁0.05％-0.08％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
所述的步骤(2)中的扩大培养依次包括一级种子的制备、二级种子的制备，其中种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：蔗糖1％-1.5％；鱼蛋白胨0.1％-0.2％；磷酸氢二钾0.05％-0.15％；磷酸二氢钾质量0.1％-0.2％；无水硫酸镁0.05％-0.08％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
接种量为8％-12％，培养温度32℃-36℃，通风量0.3vvm-0.5vvm，培养周期20h-24h。
申请人对利用本发明的方法所制备的结冷胶进行了如下实验：
一、收率
由于现有国标及行业技术规范中未对收率的检测方法进行限定，申请人借鉴行业中对于收率测定的常规方法，具体如下：
1、所用仪器
恒温箱、分析天平(0.001g)；
2、检测方法
将发酵液倒入一定体积的小烧杯中，用玻璃棒搅拌使其无气泡，用玻璃棒把表面抹平，把杯子外的发酵液清洗干净。发酵液用90％-95％的乙醇提取、沉降、过滤布挤干，将其撕碎后全部彻底移入到培养皿中，然后放入105℃烘箱中烘至恒重(约4小时)，拿出称重。
收率＝称样克数/体积×100％
二、色泽
参照《食品安全国家标准食品添加剂结冷胶》(GB25535-2010)的感官要求的相关规定进行，申请人为对利用本发明的方法所制备的结冷胶发酵液的白度进行量化，采用北京康光光学仪器有限公司生产的全自动白度计WSD-3C对其进行了检测。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
1、本发明公开了一种固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601，该菌种具有高产结冷胶的能力，采用上述菌种并结合优化后的发酵工艺结冷胶制备的结冷胶具有相比现有工艺更高的收率，收率最高可达29.5-30.0g/L。
2、采用本发明的方法制备的结冷胶发酵液，经申请人检测其白度达到30％以上，相比现有工艺所制备的黄色发酵液有明显改善。可以省去后提取过程中的脱色步骤即可满足国标要求，降低了生产成本并缩短了生产周期。所制备的产品符合国标对于结冷胶的感官要求。
3、发酵工程中根据生产特点，采用分段对温度进行控制并补充无菌水降低发酵液的粘度，在利于发酵液散热且有利于菌种生长的同时，便于结冷胶的生成。
4、采用氢氧化钠或氢氧化钾溶液调整发酵液的pH，有利于结冷胶性能指标的提高。
本发明中的菌种已于2017年6月13日提交位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，该保藏单位简称CGMCC。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范围。
实施例1
本实施例中的菌种如前述。
应用固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601在制取结冷胶时采用如下工艺步骤：
A、将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中；
B、控制发酵培养基的pH及温度，进行通气发酵制备发酵液；
C、当发酵液粘度不再增长或发酵周期≤50小时发酵结束；
D、对步骤C中制成的发酵液进行提取得到结冷胶。
因上述后提取步骤属于现有常规技术，申请人在此对其中涉及的工艺过程及工艺参数不再赘述。
所述的步骤B中温度控制条件为发酵开始至30小时内为32℃-36℃，30小时后至发酵结束为28℃-30℃。
所述的步骤B中通过向发酵液中补充无菌水进行温度控制。
所述的步骤B中pH为中性或弱碱性。步骤B中pH调节采用质量百分比浓度为5％-10％氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
所述的步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖3％；鱼蛋白胨0.1％；磷酸氢二钾0.05％；磷酸二氢钾0.1％；无水硫酸镁0.05％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
所述的步骤A中将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601经过扩大培养后，按照种子液：发酵培养基＝8％的接种量将种子液接种于灭菌后的发酵培养基中。
步骤B中通气发酵工艺条件如下：
10小时内：温度32℃，压力0.03MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.2vvm；
11-20小时：温度32℃，压力0.03MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.3vvm；
21-30小时：温度32℃，压力0.03MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.4vvm；21-25小时补入发酵液质量百分含量为1.0％-1.5％的无菌水；
31-40小时：温度28℃，压力0.03MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.4vvm；31-35小时补入发酵液质量百分含量为0.6％-0.8％的无菌水；
41小时-放罐：温度28℃，压力0.03MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.5vvm；41小时补入发酵液质量百分含量为0.5％-0.6％的无菌水。
所述的扩大培养包括：
(1)将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601接种于摇瓶种子培养基制成摇瓶种子；
(2)将摇瓶种子经扩大培养后制成种子液；
(3)按种子液：发酵培养基＝8％的接种量，将制成的种子液接入灭菌后的发酵培养基中进行通气发酵。
所述的步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为32℃-36℃、转速为180-220转/分钟，培养周期为10-12小时；摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1％；鱼蛋白胨0.1％；磷酸氢二钾0.05％；磷酸二氢钾质量0.1％；无水硫酸镁0.05％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
所述的步骤(2)中的扩大培养依次包括一级种子的制备、二级种子的制备，其中种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1％；鱼蛋白胨0.1％；磷酸氢二钾0.05％；磷酸二氢钾质量0.1％；无水硫酸镁0.05％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
接种量为8％，培养温度32℃-36℃，通风量0.3vvm-0.5vvm，培养周期20h-24h。
实施例2
步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖3.5％；鱼蛋白胨0.2％；磷酸氢二钾0.15％；磷酸二氢钾0.2％；无水硫酸镁0.08％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
所述的步骤A中将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601经过扩大培养后，按照种子液：发酵培养基＝12％的接种量将种子液接种于灭菌后的发酵培养基中。
步骤B中通气发酵工艺条件如下：
10小时内：温度36℃，压力0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.3vvm；
11-20小时：温度36℃，压力0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.4vvm；
21-30小时：温度36℃，压力0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.5vvm；21-25小时补入发酵液质量百分含量为1.0％-1.5％的无菌水；
31-40小时：温度30℃，压力0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.5vvm；31-35小时补入发酵液质量百分含量为0.6％-0.8％的无菌水；
41小时-放罐：温度30℃，压力0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.6vvm；41小时补入发酵液质量百分含量为0.6％的无菌水。
摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.5％；鱼蛋白胨0.2％；磷酸氢二钾0.15％；磷酸二氢钾质量0.2％；无水硫酸镁0.08％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.5％；鱼蛋白胨0.2％；磷酸氢二钾0.15％；磷酸二氢钾质量0.2％；无水硫酸镁0.08％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
接种量为12％，培养温度36℃，通风量0.3vvm-0.5vvm，培养周期20h-24h。
其余内容与实施例1相同。
实施例3
步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖3.2％；鱼蛋白胨0.15％；磷酸氢二钾0.13％；磷酸二氢钾0.15％；无水硫酸镁0.07％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
所述的步骤A中将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601经过扩大培养后，按照种子液：发酵培养基＝10％的接种量将种子液接种于灭菌后的发酵培养基中。
步骤B中通气发酵工艺条件如下：
10小时内：温度34℃，压力0.04MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.25vvm；
11-20小时：温度34℃，压力0.04MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.35vvm；
21-30小时：温度34℃，压力0.04MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.45vvm；21-25小时补入发酵液质量百分含量为1.0％-1.5％的无菌水；
31-40小时：温度29℃，压力0.04MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.45vvm；31-35小时补入发酵液质量百分含量为0.6％-0.8％的无菌水；
41小时-放罐：温度29℃，压力0.04MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.55vvm；41小时补入发酵液质量百分含量为0.5％-0.6％的无菌水。
摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.3％；鱼蛋白胨0.15％；磷酸氢二钾0.1％；磷酸二氢钾质量0.15％；无水硫酸镁0.07％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.3％；鱼蛋白胨0.15％；磷酸氢二钾0.1％；磷酸二氢钾质量0.15％；无水硫酸镁0.07％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
接种量为10％，培养温度34℃，通风量0.3vvm-0.5vvm，培养周期20h-24h。
其余内容与实施例1相同。
实施例4
步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖3.1％；鱼蛋白胨0.13％；磷酸氢二钾0.08％；磷酸二氢钾0.13％；无水硫酸镁0.06％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
所述的步骤A中将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601经过扩大培养后，按照种子液：发酵培养基＝9％的接种量将种子液接种于灭菌后的发酵培养基中。
步骤B中通气发酵工艺条件如下：
10小时内：温度33℃，压力0.035MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.22vvm；
11-20小时：温度33℃，压力0.035MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.35vvm；
21-30小时：温度33℃，压力0.035MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.43vvm；21-25小时补入发酵液质量百分含量为1.0％-1.5％的无菌水；
31-40小时：温度29℃，压力0.035MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.43vvm；31-35小时补入发酵液质量百分含量为0.6％-0.8％的无菌水；
41小时-放罐：温度30℃，压力0.035MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.5vvm；41小时补入发酵液质量百分含量为0.5％-0.6％的无菌水。
摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.2％；鱼蛋白胨0.13％；磷酸氢二钾0.08％；磷酸二氢钾质量0.12％；无水硫酸镁0.06％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.2％；鱼蛋白胨0.13％；磷酸氢二钾0.08％；磷酸二氢钾质量0.13％；无水硫酸镁0.06％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
接种量为9％，培养温度33℃，通风量0.3vvm-0.5vvm，培养周期20h-24h。
其余内容与实施例1相同。
实施例5
步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖3.2％；鱼蛋白胨0.18％；磷酸氢二钾0.12％；磷酸二氢钾0.18％；无水硫酸镁0.07％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
所述的步骤A中将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601经过扩大培养后，按照种子液：发酵培养基＝11％的接种量将种子液接种于灭菌后的发酵培养基中。
步骤B中通气发酵优选的工艺条件如下：
10小时内：温度35℃，压力0.045MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.28vvm；
11-20小时：温度35℃，压力0.045MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.38vvm；
21-30小时：温度35℃，压力0.045MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.48vvm；21-25小时补入发酵液质量百分含量为1.0％-1.5％的无菌水；
31-40小时：温度29℃，压力0.045MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.48vvm；31-35小时补入发酵液质量百分含量为0.6％-0.8％的无菌水；
41小时-放罐：温度29℃，压力0.045MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.58vvm；41小时补入发酵液质量百分含量为0.5％-0.6％的无菌水。
摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.4％；鱼蛋白胨0.18％；磷酸氢二钾0.12％；磷酸二氢钾质量0.18％；无水硫酸镁0.07％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1.3％；鱼蛋白胨0.18％；磷酸氢二钾0.13％；磷酸二氢钾质量0.18％；无水硫酸镁0.07％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
接种量为11％，培养温度35℃，通风量0.3vvm-0.5vvm，培养周期20h-24h。
其余内容与实施例1相同。
上述实施例中所制备发酵液的色泽及白度指标如表一。
表一
| 色泽 | 白度 | |
| 实施例1制备的产品 | 白色 | 30 |
| 实施例2制备的产品 | 白色 | 33 |
| 实施例3制备的产品 | 白色 | 31 |
| 实施例4制备的产品 | 白色 | 32 |
| 实施例5制备的产品 | 白色 | 34 |
上述实施例中的收率如表二。
表二
| 收率 | |
| 实施例1 | 29.5g/L |
| 实施例2 | 29.6g/L |
| 实施例3 | 29.8g/L |
| 实施例4 | 29.8g/L |
| 实施例5 | 30.0g/L |
序列表
<110> 河北沣川生物科技有限公司
<120> 一种固氮鞘氨醇单胞菌以及在制备结冷胶中的应用
<130> 《食品安全国家标准 食品添加剂结冷胶》（GB25535-2010）；200410064546.X；200610068788.5；200610068788.5；201210218820.9
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1307
<212> DNA
<213> Sphingomonas sp.
<400> 1
caacgccttc gggtgaaccc aactcccatg gtgtgacggg cggtgtgtac aaggcctggg 60
aacgtattca ccgcggcatg ctgatccgcg attactagcg attccgcctt catgctctcg 120
agttgcagag aacaatccga actgagacaa gttttggaga ttagctcacc ctcgcgggat 180
tgctgcccac tgtacttgcc attgtagcac gtgtgtagcc cagcgcgtaa gggccatgag 240
gacttgacgt catccccacc ttcctccggc ttatcaccgg cggttacttt aaagtaccca 300
acttaatgat ggtaactaaa gtcgagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct 360
cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc acctgtgtgt aggtccccga agggaagaaa 420
ggcatctctg ccagtcgtcc taccatgtca aacgctggta aggttctgcg cgttgcttcg 480
aattaaacca catgctccac cgcttgtgca ggcccccgtc aattcctttg agttttaacc 540
ttgcggccgt actccccagg cggataactt aatgcgttag ctgcgccacc caagtgccaa 600
gcacccggac agctagttat catcgtttac ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt 660
ttgctcccca cgctttcgca cctcagcgtc aataccagtc cagtgagccg ccttcgccac 720
tggtgttctt ccgaatatct acgaatttca cctctacact cggaattcca ctcacctctc 780
ctggattcaa gcgatgcagt ctcaaaggca gttctggagt tgagctccag gctttcacct 840
ctgacttaca aagccgccta cgtgcgcttt acgcccagta attccgaaca acgctagccc 900
cctccgtatt accgcggctg ctggcacgga gttagccggg gcttattctc ccggtacagt 960
cattatcttc ccgggtaaaa gagctttaca accctaaggc cttcatcact cacgcggcat 1020
tgctggatca ggctttcgcc cattgtccaa tattccccac tgctgcctcc cgtaggagtc 1080
tgggccgtgt ctcagtccca gtgtggctga tcatcctctc agaccagcta aggatcgtcg 1140
ccttggtgcg cctttaccac accaactagc taatcctacg cgggctcatc tcagggcgat 1200
aaatctttgg tctttcgaca tcatccggta ttagcacccc tttcggggag ttattccgaa 1260
ccccaaggca gattcccacg cgttacgcac ccgtgcgcca ctagacc 1307
Claims (14)
1.一种固氮鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas azotifigens)JhW170601，其保藏编号为CGMCC No.14239。
2.根据权利要求1所述的固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601，其特征在于其16SrRNA序列如下：
CAACGCCTTCGGGTGAACCCAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCTGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGCCTTCATGCTCTCGAGTTGCAGAGAACAATCCGAACTGAGACAAGTTTTGGAGATTAGCTCACCCTCGCGGGATTGCTGCCCACTGTACTTGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGCGCGTAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGCTTATCACCGGCGGTTACTTTAAAGTACCCAACTTAATGATGGTAACTAAAGTCGAGGGTTGCGCTCGtTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTGTAGGTCCCCGAAGGGAAGAAAGGCATCTCTGCCAGTCGTCCTACCATGTCAAACGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCAGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGATAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACCCAAGTGCCAAGCACCCGGACAGCTAGTTATCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAATACCAGTCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTCACCTCTCCTGGATTCAAGCGATGCAGTCTCAAAGGCAGTTCTGGAGTTGAGCTCCAGGCTTTCACCTCTGACTTACAAAGCCGCCTACGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGAACAACGCTAGCCCCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGGGCTTATTCTCCCGGTACAGTCATTATCTTCCCGGGTAAAAGAGCTTTACAaCCcTAAGgcCTTCATCACTCACGCGGCATTGCTGGATCAGgCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTAAGGATCGTCGCCTTGGTGCGCCTTTACCACACCAACTAGCTAATCCTACGCGGGCTCATCTCAGGGCGATAAATCTTTGGTCTTTCGACATCATCCGGTATTAGCACCCCTTTCGGGGAGTTATTCCGAACCCCAAGGCAGATTCCCACGCGTTACGCACCCGTGCGCCACTAGACC。
3.根据权利要求1或2所述的固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601在制取结冷胶中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于包括如下工艺步骤：
A、将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601接种到灭菌后且含有碳源、氮源及必要营养物质的发酵培养基中；
B、控制发酵培养基的pH及温度，进行通气发酵制备发酵液；
C、当发酵液粘度不再增长或发酵周期≤50小时发酵结束；
D、对步骤C中制成的发酵液进行提取得到结冷胶。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的步骤B中温度控制条件为发酵开始至30小时内为32℃-36℃，30小时后至发酵结束为28℃-30℃。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述的步骤B中通过向发酵液中补充无菌水进行温度控制。
7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的步骤B中pH为中性或弱碱性。
8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的步骤B中pH调节采用质量百分比浓度为5％-10％氢氧化钠或氢氧化钾溶液。
9.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的步骤A、B中发酵培养基由如下质量百分含量的原料组成：
蔗糖3％-3.5％；鱼蛋白胨0.1％-0.2％；磷酸氢二钾0.05％-0.15％；磷酸二氢钾0.1％-0.2％；无水硫酸镁0.05％-0.08％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
10.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的步骤A中将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601经过扩大培养后，按照种子液：发酵培养基＝8％-12％的接种量将种子液接种于灭菌后的发酵培养基中。
11.根据权利要求4-10中任一项所述的应用，其特征在于步骤B中通气发酵的条件如下：
10小时内：温度32℃-36℃，压力0.03MPa-0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.2vvm-0.3vvm；
11-20小时：温度32℃-36℃，压力0.03MPa-0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.3vvm-0.4vvm；
21-30小时：温度32℃-36℃，压力0.03MPa-0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.4vvm-0.5vvm；21-25小时补入发酵液质量百分含量为1.0％-1.5％的无菌水；
31-40小时：温度28℃-30℃，压力0.03MPa-0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.4vvm-0.5vvm；31-35小时补入发酵液质量百分含量为0.6％-0.8％的无菌水；
41小时-放罐：温度28℃-30℃，压力0.03MPa-0.05MPa，pH＝7.0-7.5，通风量0.5vvm-0.6vvm；41小时补入发酵液质量百分含量为0.5％-0.6％的无菌水。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于所述的扩大培养包括：
(1)将固氮鞘氨醇单胞菌JhW170601接种于摇瓶种子培养基制成摇瓶种子；
(2)将摇瓶种子经扩大培养后制成种子液；
(3)按种子液：发酵培养基＝8％-12％的接种量，将制成的种子液接入灭菌后的发酵培养基中进行通气发酵。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述的步骤(1)中制备摇瓶种子的工艺条件是：挑取一环斜面菌种接入灭菌后的摇瓶种子培养基中，经振荡培养制成摇瓶种子，培养温度为32℃-36℃、转速为180-220转/分钟，培养周期为10-12小时；摇瓶种子培养基由如下质量百分含量的组份组成：
蔗糖1％-1.5％；鱼蛋白胨0.1％-0.2％；磷酸氢二钾0.05％-0.15％；磷酸二氢钾质量0.1％-0.2％；无水硫酸镁0.05％-0.08％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述的步骤(2)中的扩大培养依次包括一级种子的制备、二级种子的制备，其中种子培养液由如下质量百分含量的组份组成：蔗糖1％-1.5％；鱼蛋白胨0.1％-0.2％；磷酸氢二钾0.05％-0.15％；磷酸二氢钾质量0.1％-0.2％；无水硫酸镁0.05％-0.08％；余量为无菌水；pH＝7.5-8.0；
接种量为8％-12％，培养温度32℃-36℃，通风量0.3vvm-0.5vvm，培养周期20h-24h。
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| 产结冷胶的黄色素缺陷型抗药性鞘氨醇单胞菌WZ013发酵条件优化;魏春等;《中国食品学报》;20130228;第13卷(第2期);第101-107页 * |
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