CN115820758B - 一种聚谷氨酸发酵液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种聚谷氨酸发酵液及其制备方法和应用，涉及微生物发酵技术领域。该聚谷氨酸发酵液的制备方法包括：向发酵培养基中接种多粘类芽胞杆菌进行发酵，即得聚谷氨酸发酵液。本发明首次使用多粘类芽胞杆菌CICC 10494在适宜培养条件下发酵获得聚谷氨酸发酵液，并通过实验确认了多粘类芽胞杆菌CICC 10494发酵的最优培养基及最优发酵条件。本发明中还发现该聚谷氨酸发酵液可促进高梁生长，为高粱化肥的材料来源提供了一个新途径。

Description

一种聚谷氨酸发酵液及其制备方法和应用

技术领域

本申请涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种聚谷氨酸发酵液及其制备方法和应用。

背景技术

聚谷氨酸(γ-聚谷氨酸，poly-r-glutamic acid，γ-PGA)是一种由微生物合成的天然高聚物，由D型谷氨酸和L型谷氨酸单体按不同比例通过γ-酰胺键连接而成。1937年，Ivanovics 和Bruckner首次从炭疽芽孢杆菌( Bacillus anthracis)荚膜中分离提取得到胞外多肽γ-PGA，后来发现γ-PGA也可以由枯草芽孢杆菌分泌到生长介质中作为发酵的产物。聚谷氨酸是一种绿色新型环保材料，因其具有水溶性、可塑性、高吸附性、生物可降解性等特性，被广泛应用于食品、农业、化妆品、生物医药等行业。

但目前能够高效生产聚谷氨酸的菌株较少，其生产菌株仍有待进一步探索和扩大。

发明内容

本发明的目的是提供一种聚谷氨酸发酵液制备的新方法，首次采用多粘类芽胞杆菌进行发酵制备聚谷氨酸发酵液，为聚谷氨酸发酵液的生产提供了新菌株和新的生产方法。

一方面，本申请提供了一种聚谷氨酸发酵液的制备方法，所述方法包括：向发酵培养基中接种多粘类芽胞杆菌种子液进行发酵，即得聚谷氨酸发酵液；

所述多粘类芽胞杆菌种子液的OD₆₀₀为4-5，接种量为4-6％；

所述发酵，温度为25℃-37℃，通风比为1：（1-2），转速为100-200 rpm，培养时间为36-42 h。

优选的，所述多粘类芽胞杆菌种子液的OD₆₀₀为4.997，接种量为5％。

进一步的，所述多粘类芽胞杆菌为多粘类芽胞杆菌 CICC 10494，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心。

所述多粘类芽胞杆菌CICC 10494购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

目前γ-PGA的生产方法主要是通过微生物发酵，工业上以芽孢杆菌属作为生产菌进行发酵，部分芽孢杆菌可合成γ-PGA并分泌到生长介质中作为发酵的产物，如炭疽芽孢杆菌( Bacillus anthracis)、地衣芽孢杆菌( Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌( Bacillus suhtilis)等均可以合成γ-聚谷氨酸。根据γ-PGA的合成是否需要加入外源谷氨酸，将菌株分为谷氨酸依赖型与非谷氨酸依赖型。与谷氨酸依赖型菌株相比，非谷氨酸依赖型菌株的γ-PGA产量很低且种类较少，所以现在大多利用谷氨酸依赖型菌株发酵生产γ-PGA。这种方法具有培养条件温和，生产周期短，过程易于控制无污染，提取率高等优点，且产出的γ-PGA分子量适宜，因而成为制备γ-PGA的主要途径。

如中国专利文件CN 105420169 A中提供了一种可产聚谷氨酸的芽孢杆菌，但其聚谷氨酸产量最高可达14 g/L，而本申请中，聚谷氨酸发酵液中聚谷氨酸最高含量可达到60.9 g/L。

且，目前市面售卖的聚谷氨酸发酵液根据QBT5189-2017标准需要达到γ-PGA≥50g/L ，本申请发酵液在不经其他工艺辅助的情况下即可直接达到行业规定标准。

进一步的，所述方法还包括种子培养阶段，所述种子培养阶段包括：将多粘类芽胞杆菌接种于种子培养基中，罐压为0.07-0.08 Mpa，温度为30℃-37℃，通风比为1：1，转速为100-200 rpm，培养至OD₆₀₀4-5，获得多粘类芽胞杆菌种子液。

优选的，所述多粘类芽胞杆菌的种子液培养时间为24-48 h；更优选的，36 h。

更优选的，所述种子培养阶段包括：将多粘类芽胞杆菌接种于种子培养基中，罐压为0.07-0.08 Mpa，温度为30℃、通风比为1：1、转速为200 rpm、培养时间36 h，培养至OD₆₀₀为4.997。

其中，OD₆₀₀为多粘类芽胞杆菌CICC 10494种子液在600 nm波长处吸光度的值。

本申请中以OD₆₀₀代表种子液培养阶段中菌体生物量的生长情况，其中OD₆₀₀为4-5时，该多粘类芽胞杆菌的γ-PGA产率较高，均在1 g·（h·L）^-1以上。

接种量是指移入种子液的体积占接种后培养液体积的百分比。

在一种优选的实施方式中，种子培养阶段包括：将多粘类芽胞杆菌 CICC 10494接种于种子培养基中，罐压为0.07-0.08 Mpa，温度为30℃，通风比为1：1，转速为200 rpm，培养36 h，培养至OD₆₀₀4-5时完成种子培养获得种子液。

种子培养基中包括：酵母粉30 g、谷氨酸钠15 g、氯化钠6 g、磷酸二氢钾0.2 g，水1000 mL。

进一步的，所述发酵培养基包括：碳源、酵母粉、磷酸二氢钾、氯化钠、谷氨酸钠、消泡剂。

进一步的，所述碳源选自麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖中的一种或多种。

优选的，所述碳源为麦芽糊精。

进一步的，以质量百分比计，所述发酵培养基包括：3-7％麦芽糊精、1-5％酵母粉、0.01-0.03％磷酸二氢钾、0.4-0.8％氯化钠、2-4％谷氨酸钠、0.03-0.07％消泡剂，余量为水。

优选的，所述发酵培养基包括：5％麦芽糊精、3％酵母粉、0.02％磷酸二氢钾、0.6％氯化钠、3.5％谷氨酸钠、0.05％消泡剂，余量为水。

在一种优选的实施方式中，发酵培养基中包括：酵母粉30 g、谷氨酸钠35 g、氯化钠6 g、磷酸二氢钾0.2 g、麦芽糊精50 g、消泡剂0.5 g，水1000 mL。

所述消泡剂本领域技术人员可根据实际情况自行选择购买，在本申请中选择发酵复合专用消泡剂XP-M-130，购自南京金钥匙生物科技有限公司。

进一步的，所述发酵，温度为30℃，通风比为1：1，转速为100 rpm，培养时间为40h。

优选的，罐压：0.07-0.08 Mpa。

其中，发酵生产中，一般以通风比来表示空气流量，通常以一分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示(V/V·m)。

在一种优选的实施方式中，一种聚谷氨酸发酵液的制备方法包括如下步骤：

步骤一、将多粘类芽胞杆菌 CICC 10494接种于种子培养基中，罐压为0.07-0.08Mpa，温度为30℃，通风比为1：1，转速为200 rpm，培养36 h，培养至OD₆₀₀4-5时完成种子培养获得种子液；

步骤二、将所述种子液以5％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵，罐压为0.07-0.08 Mpa，温度为30℃，通风比为1：1，转速为100 rpm，培养时间为40 h，80℃灭活放罐，即得聚谷氨酸发酵液。

所述多粘类芽胞杆菌 CICC 10494购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

种子培养基中包括：酵母粉30 g、谷氨酸钠15 g、氯化钠6 g、磷酸二氢钾0.2 g，水1000 mL。

发酵培养基中包括：酵母粉30 g、谷氨酸钠35 g、氯化钠6 g、磷酸二氢钾0.2 g、麦芽糊精50 g、消泡剂0.5 g，水1000 mL。

另一方面，本申请还提供了一种上述的方法制备的聚谷氨酸发酵液。

另一方面，本申请还提供了上述的聚谷氨酸发酵液在制备肥料中的应用。

进一步的，所述肥料促进高梁生长发育。

本发明具有如下有益效果：

1、本申请中提供了一种发酵制备聚谷氨酸发酵液的新菌种，即多粘类芽胞杆菌CICC 10494；

2、本申请提供的聚谷氨酸发酵液制备方法，经过实验确认了多粘类芽胞杆菌CICC10494发酵的最优培养基及最优发酵条件，能够高效获得聚谷氨酸发酵液，最高产量可达到60.9 g/L；

3、本申请制备的聚谷氨酸发酵液可促进高梁生长，为高粱化肥的材料来源提供了一个新途径。

具体实施方式

为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

其中，多粘类芽胞杆菌 CICC 10494购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；消泡剂为发酵复合专用消泡剂XP-M-130，购自南京金钥匙生物科技有限公司；谷氨酸含量检测试剂盒由苏州格锐思生物科技有限公司提供；市售肥料为好益多，由山东寿光嘉禾生物科技有限公司提供。

如未特殊说明，在以下实施方式中，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

种子培养基中包括：酵母粉30g、谷氨酸钠15g、氯化钠6g、磷酸二氢钾0.2g，水1000mL。

发酵培养基中包括：酵母粉30g、谷氨酸钠35g、氯化钠6g、磷酸二氢钾0.2g、麦芽糊精50g、消泡剂0.5g，水1000 mL。

本领域技术人员可知，本申请中所述水可根据实际情况选择纯水、超纯水、去离子水等。

实施例1种子培养阶段培养条件优化

本申请中首次发现多粘类芽胞杆菌 CICC 10494可用于制备聚谷氨酸发酵液。

将多粘类芽胞杆菌 CICC 10494接种于种子培养基中，罐压为0.07-0.08 Mpa、通风比为1：1时，考察不同培养温度、不同转速及不同培养时间对多粘类芽胞杆菌生长的影响，本申请以OD₆₀₀代表培养过程中菌体生物量的变化并以下述方法测量γ-PGA产率。

种子培养基中包括：酵母粉30g、谷氨酸钠15g、氯化钠6g、磷酸二氢钾0.2g，水1000mL。

上述培养液经10000 rpm/min离心15 min，取上清液加入4倍体积的95%乙醇适当搅拌，4℃放置24 h后5000 r/min离心5 min取沉淀，沉淀物即为γ-PGA，60℃烘干至恒重后，称重即得γ-PGA的重量，γ-PGA的产量计算如下式所示，具体产量数据如表2所示。

γ-PGA产量(g/L) =产物重量(g) /发酵液体积(L)

γ-PGA产率(g/h·L) =γ-PGA产量(g/L) /时间（h）

表1

将本实施例中所有产物8000 r/min离心后溶于去离子水中进行6 mol/L HCl真空水解，水解24 h后将水解产物使用谷氨酸含量检测试剂盒测定其中谷氨酸，证明了所有产物水解液中均含有谷氨酸，即多粘类芽胞杆菌 CICC 10494具有生成γ-PGA的能力。

由表1结果可见，多粘类芽胞杆菌 CICC 10494在罐压为0.07-0.08 Mpa、温度为30℃、通风比为1：1、转速为200 rpm、培养时间36 h，培养至OD₆₀₀4-5时活力最佳，可获得最佳种子液。

实施例2发酵培养阶段接种量优选实验

使用实施例1中优选条件下培养的种子液进行后续发酵实验。

将所述种子液以不同接种量接种于发酵培养基中进行发酵，罐压为0.07-0.08Mpa、通风比为1：1、温度为30℃、转速为200 rpm、培养时间为48 h后，80℃灭活放罐，即得聚谷氨酸发酵液。

发酵培养基中包括：酵母粉30 g、谷氨酸钠35 g、氯化钠6 g、磷酸二氢钾0.2 g、麦芽糊精50 g、消泡剂0.5 g，水1000 mL。

上述聚谷氨酸发酵液经10000 rpm/min离心15 min，取上清液加入4倍体积的95%乙醇适当搅拌，4℃放置24 h后5000 r/min离心5 min取沉淀，沉淀物即为γ-PGA，60℃烘干至恒重后，称重即得γ-PGA的重量，γ-PGA的产量计算如下式所示，具体产量数据如表2所示。

γ-PGA产量(g/L) =产物重量(g) /发酵液体积(L)

表2

由表2结果可见，在种子液接种量为5％时，发酵培养阶段获得的聚谷氨酸发酵液中γ-PGA含量最多。

实施例3发酵培养阶段碳源筛选实验

在实施例2的优选条件下进行后续发酵实验。

将所述种子液以5％接种量接种于不同发酵培养基中进行发酵，罐压为0.07-0.08Mpa、通风比为1：1、温度为30℃、转速为200 rpm、培养时间为48 h后，80℃灭活放罐，即得聚谷氨酸发酵液，具体产量数据如表3所示。

发酵培养基中包括：酵母粉30 g、谷氨酸钠35 g、氯化钠6 g、磷酸二氢钾0.2 g、碳源50 g、消泡剂0.5 g，水1000 mL。其中碳源选自麦芽糊精、葡萄糖、蔗糖。

表3

由表3结果可见，在发酵培养基中选择麦芽糊精作为碳源最佳。本申请中最优发酵培养基为：酵母粉30 g、谷氨酸钠35 g、氯化钠6 g、磷酸二氢钾0.2 g、麦芽糊精50 g、消泡剂0.5 g，水1000 mL。

实施例4发酵培养阶段培养条件优化

在实施例3的优选条件和优选培养基下进行后续发酵实验。

将所述种子液以5％接种量接种于发酵培养基中进行发酵，罐压为0.07-0.08Mpa、通风比为1：1时，采用不同温度、不同转速、不同培养时间进行培养，培养完成后80℃灭活放罐，即得聚谷氨酸发酵液。采用实施例2中方法测定γ-PGA产量，具体产量数据如表4所示。并且，每隔2 h取样使用粘度计测一次黏度，其中黏度与γ-PGA含量成正比，通过观测黏度变化可以推测发酵液中的γ-PGA含量。

在上述条件下，采用20℃、28℃、30℃、37℃进行发酵，转速为200 rpm、培养时间为48 h。

表4

由表4结果可见，多粘类芽胞杆菌 CICC 10494种子液在罐压为0.07-0.08 Mpa，温度为30℃，通风比为1：1，转速为100 rpm，培养时间为40 h，80℃灭活放罐，即得聚谷氨酸发酵液。

实施例5聚谷氨酸发酵液的制备方法

根据上述实施例1-4优选的条件，一种聚谷氨酸发酵液的制备方法包括如下步骤：

步骤一、将多粘类芽胞杆菌 CICC 10494接种于种子培养基中，罐压为0.07-0.08Mpa，温度为30℃，通风比为1：1，转速为200 rpm，培养36 h，培养至OD₆₀₀4-5时完成种子培养获得种子液；

步骤二、将所述种子液以5％的接种量接种于发酵培养基中进行发酵，罐压为0.07-0.08 Mpa，温度为30℃，通风比为1：1，转速为100 rpm，培养时间为40 h，80℃灭活放罐，即得聚谷氨酸发酵液。

种子培养基中包括：酵母粉30 g、谷氨酸钠15 g、氯化钠6 g、磷酸二氢钾0.2 g，水1000 mL。

发酵培养基中包括：酵母粉30 g、谷氨酸钠35 g、氯化钠6 g、磷酸二氢钾0.2 g、麦芽糊精50 g、消泡剂0.5 g，水1000 mL。

实施例6聚谷氨酸发酵液在植物中的应用

采用同批种植的高梁、玉米和水稻幼苗各20棵，其中10棵为实验组并同时设置10棵为对照组，实验组每隔7天施加等量聚谷氨酸发酵液（10 mL），对照组同时间施加等量市售肥料。连续处理一月，并每7天测量其植株株高和鲜重，最终取平均值，具体测量结果如表5所示。

表5

由表5数据可见，本申请方法制备的聚谷氨酸发酵液对高梁玉米和水稻都有一定的促进生长的作用，其中，对高梁的促生作用最为明显。在连续使用一个月后，其株高可增长38.92％，其鲜重可增长86.25％，而其对照组株高仅增长了10.32％，鲜重仅增长了12.76％。即，本申请方法制备的聚谷氨酸发酵液可以有效促进高梁的生长发育，可作为高梁肥料原材料使用。

以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。

Claims (6)

1.一种聚谷氨酸发酵液的制备方法，其特征在于，所述方法包括：向发酵培养基中接种多粘类芽胞杆菌种子液进行发酵，即得聚谷氨酸发酵液；

所述多粘类芽胞杆菌种子液的OD₆₀₀为4-5，接种量为4-6％；

所述发酵，温度为25℃-37℃，通风比为1：（1-2），转速为100-200 rpm，培养时间为36-42 h；

所述多粘类芽胞杆菌为多粘类芽胞杆菌 CICC 10494，其保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心；

以质量百分比计，所述发酵培养基包括：3-7％麦芽糊精、1-5％酵母粉、0.01-0.03％磷酸二氢钾、0.4-0.8％氯化钠、2-4％谷氨酸钠、0.03-0.07％消泡剂，余量为水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括种子培养阶段，所述种子培养阶段包括：将多粘类芽胞杆菌接种于种子培养基中，罐压为0.07-0.08 Mpa，温度为30℃-37℃，通风比为1：1，转速为100-200 rpm，培养至OD₆₀₀ 4-5，获得多粘类芽胞杆菌种子液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵，温度为30℃，通风比为1：1，转速为100 rpm，培养时间为40 h。

4.一种如权利要求1-3任一所述的方法制备的聚谷氨酸发酵液。

5.如权利要求4所述的聚谷氨酸发酵液在制备肥料中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肥料促进高梁生长发育。