CN115058352B - 一种枯草芽孢杆菌及其生产农用γ-聚谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种枯草芽孢杆菌及其生产农用γ‑聚谷氨酸的方法，分类命名为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)SCP0101‑1，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌种保藏编号CGMCC24347，保藏日期为2022年1月19日。同时还公开了一种低成本高效发酵生产γ‑聚谷氨酸的方法。和现有生产γ‑聚谷氨酸技术相比，本发明以玉米芯为原材料，经过水解获得含有木糖和葡萄糖的水解液，使用枯草芽孢杆菌菌株SCP0101‑1主要利用玉米芯水解液中的木糖、葡萄糖，外加味精渣，即可高效地发酵生产γ‑聚谷氨酸，最高可使发酵液中的γ‑聚谷氨酸含量达45g/L，从而提供一种高效廉价的γ‑聚谷氨酸生产方法。本发明所生产的γ‑聚谷氨酸可直接应用在农业领域。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸产生菌以及以农 副产品为原料低成本发酵制备农用γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)主要由芽孢杆菌属细菌 合成的、由谷氨酸通过γ-酰胺键聚合形成的阴离子生物高分子聚合物，具有 极好的吸水性、保水性、生物可降解性、可食用性且无毒副作用等优良的理 化和生物学特性，在医药和化妆品制造、食品加工、蔬菜水果保鲜、海产品 防冻、植物种子保护等领域具有广泛的应用前景。尤其是近年来，众多大田应用试验研究证明γ-PGA对农作物具有良好的保湿抗旱、调节pH值等作用， 还能增加土壤有效磷的含量，提高磷肥和氮肥利用率，对节水、节肥、增效 具有重要的意义，因而受到人们的广泛关注。但由于聚谷氨酸的生产成本高， 这极大的限制了其在农业生产中的广泛应用。
γ-聚谷氨酸的制备主要有化学合成、微生物发酵、酶法转化等方法。其 中微生物发酵具有条件温和、环境污染小、易于扩大生产规模等优势，因而 目前规模化制备γ-聚谷氨酸，通常采用微生物发酵法。工业上以芽孢杆菌属的细菌作为生产菌进行发酵，包括：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉 芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等。根据γ-PGA的 合成是否需要添加外源的谷氨酸，将菌株分为谷氨酸依赖型和非谷氨酸依赖 型菌株。谷氨酸依赖型菌株需要添加外源谷氨酸才能产生γ-PGA，而非谷氨 酸依赖型菌株无需添加外源谷氨酸，即可合成γ-PGA。目前非谷氨酸依赖型 菌株的γ-PGA产量比谷氨酸依赖型菌株要低很多，工业化生产中，通常使用 的是谷氨酸依赖型菌株，这大大的增加了聚谷氨酸的生产成本。
专利申请号：201910305450.4，专利名称：一株贝莱斯芽孢杆菌及其生 产聚谷氨酸的方法。该发明公开了一种γ-聚谷氨酸的合成菌株，分类命名为 贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis PG1-2，保藏单位为中国微生物菌种 保藏中心，保藏编号为CGMCCNo.15718。该发明使用葡萄糖、蔗糖、淀粉和 柠檬酸中的一种或几种的混合物为碳源，以蛋白胨、酵母粉和(NH4)2SO4中的 一种或几种的混合物为氮源，经发酵，聚谷氨酸产量最高达到42.6g/L。
专利申请号：201210371783.5，专利名称：枯草芽孢杆菌高温发酵生产 γ-聚谷氨酸的方法。该发明公开以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)GXA-28，保藏编号为CCTCCNo.2012347的菌株生产γ-聚谷氨酸 的方法，即以廉价的碳氮源，例如糖蜜、无机铵盐，在40-50℃的高温发酵条 件下高效生产γ-聚谷氨酸，产量最高可达30g/L，具有高效、低成本的优点。
专利申请号：201810887277.9，专利名称：一种γ-聚谷氨酸产生菌及高 效合成γ-聚谷氨酸的方法。该发明公开了一种γ-聚谷氨酸产生菌，分类命 名为枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis hzy-1)，已保藏于中国工业微生物 菌种保藏管理中心，菌种保藏编号CCTCC M 2018226，以葡萄糖、蔗糖、麦芽 糖、柠檬酸钠和糖蜜中的任意一种或几种任意比例的组为合碳源，以蛋白胨、酵母粉、酵母膏、玉米浆、尿素、氯化铵、硫酸铵中的任意一种或几种任意 比例为氮源，发酵生产γ-聚谷氨酸，其含量达40-60g/L，从而提供一种高效廉价制备γ-聚谷氨酸的方法。
以上查阅到的专利中，均未见到以玉米芯等富含半纤维素、纤维素的农 副产物为原料，经过预处理后，再以γ-聚谷氨酸产生菌为菌株进行发酵生产 获得γ-聚谷氨酸的专利申请。本发明专利提供了一种能够利用木糖的枯草芽 孢杆菌，并提供了玉米芯等富含木糖的农副产物预处理和发酵生产γ-聚谷氨 酸的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一株能利用木糖的枯草芽孢杆菌，发 酵生产聚谷氨酸的方法。
一株产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌，所述的芽孢杆菌保藏名称为枯草芽 孢杆菌(Bacillus Subtilis)SCP0101-1，于2022年01月19日保藏于中国普 通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.24347。
该菌株从传统发酵食品豆瓣酱中，经过平板培养基初筛，液体发酵复筛， 经检测谷氨酸含量后获得。该菌株16S rDNA序列总长1383bp，具体见序列表 所示。
作为发酵原材料选取木糖含量高的农副产品，例如玉米芯为原料，经过 如下步骤的预处理和酶解：
(1)玉米芯粉预处理
微粉碎后玉米芯与NaOH的料液比1∶20(g/mL)，NaOH浓度1％，置于高压 反应釜中，70℃处理2-3h，以去除木质素，暴露出玉米芯粉的半纤维素和纤 维素，以便有效的进行酶解。纱布过滤，用自来水冲洗滤渣，烘干备用。扫 描电子显微镜观察分显示，碱处理后玉米芯微观表面的孔隙率增加(见图1， 图2)，纤维比表面积增大，可及性提升。
(2)酶解
在磷酸缓冲溶液(pH 5.5)中，加入5％预处理后的玉米芯，加入纤维素酶 (每克底物加40单位的酶)，50℃，150rpm条件下，酶解35-45小时，制备 获得含有木糖和葡萄糖酶解液。
利用玉米芯酶解液进行发酵的步骤如下：
(1)种子培养
种子培养：将经固体平板活化的枯草芽孢杆菌SCP0101-1菌种接种于牛肉 膏蛋白胨液体培养基中，摇床温度30-37℃，转速150-220rpm振荡培养12-18h 至对数生长期中期。
(2)发酵：
将种子液接入含有玉米芯酶解液、味精渣、酵母粉、硫酸镁、氯化钙的 培养液中，接种量2-8％(v/v)，摇瓶装液量100-300mL/1000mL，摇床温度 30-37℃，转速180-220rpm下培养48-72h；或者接入含有玉米芯酶解液、味精 渣、酵母粉、硫酸镁、氯化钙的培养液和水的无菌发酵罐中，接种量5-10％ (v/v)，通气量0.4-2.0vvm，30-37℃下培养48-72h.其中发酵培养基各 组分比例为：玉米芯酶解液(V)：味精渣(g)：酵母粉(g)：硫酸镁：氯化 钙＝100：5：0.5：0.02：0.01。在发酵过程中，使用补料发酵方法进行发酵， 即：在发酵到48小时的时候，补充玉米芯酶解液，有利于提高聚谷氨酸的产 量，聚谷氨酸的产量可达到30g/L(见图5)。经过个成分比例优化以后，γ-聚 谷氨酸含量达45g/L。大大节约了生产成本。
(3)农用γ-聚谷氨酸的提取：
加发酵液用纱布进行过滤，滤液用离心机离心，得到上清液，即可作为 聚谷氨酸含量为4％-5％的产物；
(4)包装：
加入山梨酸、苯甲酸、或者丙酸，作为防腐剂，分装产品。
优选的，微粉碎后玉米芯与NaOH的料液比1∶20(g/mL)，NaOH浓度1％；
优选的，微粉碎后玉米芯与NaOH混合液置于高压反应釜中，70℃处理 2-3h，以去除木质素，暴露出玉米芯粉的半纤维素和纤维素，以便有效的进 行酶解。电子显微镜观察显示，碱处理后玉米芯微观表面的孔隙率增加，纤 维比表面积增大，可及性提升。
优选的，在磷酸缓冲溶液(pH 5.5)中，加入4-6％预处理后的玉米芯，加 入纤维素酶(每克底物加40单位的酶)，50℃，150rpm条件下，酶解35-45 小时，获得含有木糖和葡萄糖酶解液。
优选的，所述种子培养基由以下重量份原料组成(g/L):酵母提取物5， 胰蛋白胨10，NaCl 10。
优选的，所述种子培养基调节pH为7-7.5。
将种子液接入含有玉米芯酶解液、味精渣、酵母粉、硫酸镁、氯化钙的 培养液中，接种量2-8％(v/v)，摇瓶装液量100-300mL/1000mL，摇床温度 30-37℃，转速180-220rpm下培养48-72h；或者接入含有玉米芯酶解液、味精 渣、酵母粉、硫酸镁、氯化钙的培养液和水的无菌发酵罐中，接种量5-10％ (v/v)，通气量0.4-2.0vvm，30-37℃下培养48-72h.其中发酵培养基个组 分比例为：玉米芯酶解液(V)：味精渣(g)：酵母粉(g)：硫酸镁：氯化钙 ＝100：5：0.5：0.02：0.01。在发酵过程中，使用补料发酵方法进行发酵， 即：在发酵到48小时的时候，补充玉米芯酶解液，有利于提高聚谷氨酸的产 量，聚谷氨酸的产量可达到30g/L(见图5)。经过各成分比例优化以后，γ-聚 谷氨酸含量达45g/L。大大节约了生产成本。
优选的，所述的发酵培养基由以下重量份原料组成：
玉米芯酶解液中、味精渣、酵母粉、硫酸镁、氯化钙，其体积重量比为： 100：5：0.5：0.02：0.01。
优选的，所述成分混匀后，通入热蒸汽灭菌。
优选的，所述发酵过程中，枯草芽孢杆菌活化的种子液接种量为5-10％。
优选的，所述的农用γ-聚谷氨酸的提取，加发酵液用纱布进行过滤，滤 液用离心机离心，得到上清液，即可作为聚谷氨酸含量为4％-5％的产物；
优选的，上述产品加入山梨酸、苯甲酸、或者丙酸，作为防腐剂，分装 即可作为产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：利用低成本的玉米芯为原料， 经过碱预处理，处于木质素，在经过酶解得到木糖和葡萄糖的酶解液，直接 在加入一定量的味精渣、酵母粉、硫酸镁、氯化钙，构成发酵的营养物质， 接种种子液进行发酵，就可以合成聚谷氨酸。无需添加其他碳源物质，有效 的降低生产成本。
附图说明
图1为本发明预处理前的玉米芯示意图1；
图2为本发明预处理前的玉米芯示意图2；
图3为本发明处理后的玉米芯悬浊液示意图；
图4为本发明不同浓度纤维素酶对木糖和葡萄糖含量的影响示意图；
图5为本发明分批培养和补料培养单糖的消耗、菌体生物量和聚谷氨酸 产量变化示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部 的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性 劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-5，本发明提供的一种技术方案，均以枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)SCP0101-1为发酵菌种，其于2022年01月19日保藏于中国普通 微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.24347。
实施例一：
(1)玉米芯粉预处理
微粉碎后玉米芯与NaOH的料液比1∶25(g/mL)，NaOH浓度1.5％，置于 高压反应釜中，70℃处理3h，经纱布过滤，用自来水冲洗滤渣，烘干备用。
(2)酶解
在磷酸缓冲溶液(pH 5.5)中，加入8％预处理后的玉米芯，加入纤维素酶 (每克底物加40单位的酶)，50℃，150rpm条件下，酶解45小时，制备 获得含有木糖和葡萄糖酶解液。
(3)种子培养
将经固体平板活化的枯草芽孢杆菌SCP0101-1菌种接种于牛肉膏蛋白胨 液体培养基中，摇床温度30-37℃，转速150-220rpm振荡培养12-18h至对 数生长期中期。所述种子培养基由以下重量份原料组成(g/L):酵母提取物5， 胰蛋白胨10，NaCl 10，pH为7。
(4)发酵：
将种子液接入含有玉米芯酶解液、味精渣、酵母粉、硫酸镁、氯化钙的 培养液中，接种量8％(v/v)，摇瓶装液量200mL/1000mL，摇床温度37℃， 转速220rpm下培养72h；其中发酵培养基个组分比例为：玉米芯酶解液(V)： 味精渣(g)：酵母粉(g)：硫酸镁：氯化钙＝100：5：0.5：0.02：0.01。在 发酵过程中，使用补料发酵方法进行发酵，即：在发酵到48小时的时候，补 充玉米芯酶解液，有利于提高聚谷氨酸的产量，聚谷氨酸的产量可达到 32g/L(见图5)。
(3)农用γ-聚谷氨酸的提取：
加发酵液用纱布进行过滤，滤液用离心机离心，得到上清液，即可作为 聚谷氨酸含量为3.2％的产物；
(4)包装：
加入山梨酸、苯甲酸、或者丙酸，作为防腐剂，分装产品。
实施例二：
(1)玉米芯粉预处理
微粉碎后玉米芯与NaOH的料液比1∶20(g/mL)，NaOH浓度1％，置于高 压反应釜中，70℃处理2.5h，经纱布过滤，用自来水冲洗滤渣，烘干备用。
(2)酶解
在磷酸缓冲溶液(pH 5.5)中，加入8％预处理后的玉米芯，加入纤维素酶 (每克底物加40单位的酶)，50℃，150rpm条件下，酶解50小时，制备 获得含有木糖和葡萄糖酶解液。
(3)种子培养
将经固体平板活化的枯草芽孢杆菌SCP0101-1菌种接种于牛肉膏蛋白胨 液体培养基中，摇床温度35℃，转速220rpm振荡培养12-18h至对数生长期 中期。所述种子培养基由以下重量份原料组成(g/L):酵母提取物5，胰蛋白 胨10，NaCl 10，pH为7。
(4)发酵：
将种子液接入含有玉米芯酶解液、味精渣、酵母粉、硫酸镁、氯化钙的 培养液中，接种量10％(v/v)，摇瓶装液量250mL/1000mL，摇床温度35℃， 转速200rpm下培养64h；其中发酵培养基个组分比例为：玉米芯酶解液(V)： 味精渣(g)：酵母粉(g)：硫酸镁：氯化钙＝100：5：0.5：0.02：0.01。在 发酵过程中，使用补料发酵方法进行发酵，即：在发酵到64小时的时候，补 充玉米芯酶解液，有利于提高聚谷氨酸的产量，聚谷氨酸的产量可达到 40g/L(见图5)。
(3)农用γ-聚谷氨酸的提取：
加发酵液用纱布进行过滤，滤液用离心机离心，得到上清液，即可作为 聚谷氨酸含量为3.2％的产物；
(4)包装：
加入山梨酸、苯甲酸、或者丙酸，作为防腐剂，分装产品。
实施例三：
(1)玉米芯粉预处理
微粉碎后玉米芯与NaOH的料液比1∶20(g/mL)，NaOH浓度1％，置于高 压反应釜中，70℃处理2.5h，经纱布过滤，用自来水冲洗滤渣，烘干备用。
(2)酶解
在磷酸缓冲溶液(pH 5.5)中，加入8％预处理后的玉米芯，加入纤维素酶 (每克底物加40单位的酶)，50℃，150rpm条件下，酶解50小时，制备 获得含有木糖和葡萄糖酶解液。
(3)种子培养
将经固体平板活化的枯草芽孢杆菌SCP0101-1菌种接种于牛肉膏蛋白胨 液体培养基中，摇床温度35℃，转速220rpm振荡培养12-18h至对数生长期 中期。所述种子培养基由以下重量份原料组成(g/L):酵母提取物5，胰蛋白 胨10，NaCl 10，pH为7。
(4)发酵：
将种子液接入含有玉米芯酶解液、味精渣、酵母粉、硫酸镁、氯化钙的 培养液和水的无菌发酵罐中，接种量10％(v/v)，通气量1.0vvm，37℃下 培养72h。其中发酵培养基个组分比例为：玉米芯酶解液(V)：味精渣(g)： 酵母粉(g)：硫酸镁：氯化钙＝100：5：0.5：0.02：0.01。在发酵过程中，使 用补料发酵方法进行发酵，即：在发酵到48小时的时候，补充玉米芯酶解液， 有利于提高聚谷氨酸的产量，聚谷氨酸的产量可达到42g/L。
(5)农用γ-聚谷氨酸的提取：
加发酵液用纱布进行过滤，滤液用离心机离心，得到上清液，即可作为 聚谷氨酸含量为3.2％的产物；
(6)包装：
加入山梨酸、苯甲酸、或者丙酸，作为防腐剂，分装产品。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人 员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其 中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何 修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川师范大学
<120> 一种枯草芽孢杆菌及其生产农用γ-聚谷氨酸的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 0
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Claims (2)
1.一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述的芽孢杆菌保藏名称为枯草芽孢杆菌(BacillusSubtilis)SCP0101-1，于2022年01月19日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.24347。
2.一种使用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌SCP0101-1发酵生产γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：玉米芯粉预处理
微粉碎后玉米芯与NaOH的料液比1∶20g/mL，NaOH浓度1％，置于高压反应釜中，70℃处理2-3h，以去除木质素；纱布过滤，用自来水冲洗滤渣，烘干备用；
步骤二：酶解
在pH5.5的磷酸缓冲溶液中，加入适量的预处理后的玉米芯，加入一定量的纤维素酶，50℃，150rpm条件下，酶解35-45小时，制备获得含有木糖和葡萄糖酶解液；
步骤三：种子培养
种子培养：将经固体平板活化的枯草芽孢杆菌SCP0101-1菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，摇床温度30-37℃，转速150-220rpm振荡培养12-18h至对数生长期中期；
步骤四：发酵
将种子液接入含有玉米芯酶解液、味精渣、酵母粉、硫酸镁、氯化钙的培养液中，接种量2-8％v/v，摇瓶装液量100-300mL/1000mL，摇床温度30-37℃，转速180-220rpm下培养48-72h；或者接入含有玉米芯酶解液、味精渣、酵母粉、硫酸镁、氯化钙的培养液和水的无菌发酵罐中，接种量5-10％v/v，通气量0.4-2.0vvm，30-37℃下培养48-72h；在发酵过程中，使用补料发酵方法进行发酵；
步骤五：农用γ-聚谷氨酸的提取：
发酵液用纱布进行过滤，滤液用离心机离心，得到上清液；
步骤六：包装：
加入山梨酸、苯甲酸、或者丙酸，作为防腐剂；分装产品。
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