CN113174415B - 一种提高细菌纤维素产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高细菌纤维素产量的方法，属于生物材料技术领域。其步骤为：向甘油中加入氮源、磷酸氢二盐、醪糟、壳聚糖和水，混合制成培养基，并调节pH值，高温灭菌，冷却后，接种生产菌株，恒温需氧静置培养结束后，取出生产的细菌纤维素膜，洗涤，脱色处理，再洗涤，干燥，即得膜状细菌纤维素。本发明的方法，通过将木醋杆菌模式培养基中的葡萄糖替换为甘油，碳酸钙替换成磷酸氢二盐，新加入食品醪糟和可溶性壳聚糖，并对培养基成分的配比进行优化，结果显著提高了细菌纤维素的产量。本发明方法可大幅度降低细菌纤维素的生产成本，有效促进细菌纤维素的产业化应用和推广，在细菌纤维素生产技术领域，具有推广应用价值。

Description

一种提高细菌纤维素产量的方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种提高细菌纤维素产量的方法。
背景技术
细菌纤维素是某类微生物经生物合成所分泌的纤维素类物质的统称。作为一种新型生物材料，细菌纤维素以其独特的材料性能受到广泛关注。细菌纤维素具有高纯度、超微化、优良的透水透气性、良好的生物相容性、可靠的生物降解性以及生物合成过程的可调控性，在医疗器械领域、食品添加剂领域、造纸领域、纺织领域以及环保领域均具有广阔的应用前景。通过微生物发酵工程获取细菌纤维素是一个复杂的、系统的生物学过程，期间受多种因素的影响，如培养基组份、配比、培养温度、培养方式和条件等，其中，培养基的组成和配比是关键因素之一。有关培育木醋杆菌生物合成细菌纤维素的生产性培养基，国内外均进行了大量研究。国内细菌纤维素的生产，最初以椰子水为主要原料，但该方法受椰子产地的地域限制而不便于广泛推广应用。因此，科研及生产人员先后开发出果蔬汁、植物浸提物以及各类农副产品下脚料等作为细菌纤维素生产性培养基的基础原料。目前细菌纤维素的生产性培养基主要存在以下缺点：原料供应和质量不稳定，制成发酵原料的工艺复杂、成本高，耗费较大的人力和物力，原材料常常受地域限制，不利于广泛推广。并且，目前常用的生产性培养基对木醋杆菌的发酵能力低，造成细菌纤维素产率较低，增加了单位生产的成本，而高昂的生产成本限制了细菌纤维素的规模化生产和广泛推广应用，致使当前细菌纤维素的应用主要被限定在附加值较高的产品领域。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提高细菌纤维素产量的方法。
为实现上述目的，本案发明人经过长期研究和大量实践，得以提供本发明技术方案，具体实施过程如下：
一种提高细菌纤维素产量的方法，包括以下步骤：
s1、向甘油中加入氮源、磷酸氢二盐、醪糟、可溶性壳聚糖和水，混合制成生产细菌纤维素的培养基，并调节培养基的pH值为5.8～6.2，然后在115～125℃条件下灭菌，冷却；
所述甘油、氮源、磷酸氢二盐、醪糟、可溶性壳聚糖和水按g:g:g:g:g:L计为15:8～11:1～3:3～5:50～60:1；
s2、待灭菌后的培养基冷却至25～35℃时，接种细菌纤维素的生产菌株，接种比例为5～7％，将接种好生产菌株的培养液在28～32℃条件下，恒温需氧静置培养6～8天；
s3、培养结束后，从培养液中取出长成的细菌纤维素膜片，用水洗涤后，加入氢氧化钠溶液，在80℃条件下进行脱色处理，再用水洗涤，离心除去表面水分，即得细菌纤维素湿膜片，将其冻干或真空干燥，即得细菌纤维素干膜片。
优选的，所述s1中，氮源为硫酸铵、酵母浸粉和蛋白胨中的一种或多种。
优选的，所述s1中，磷酸氢二盐为磷酸氢二钾或磷酸氢二钠。
优选的，所述s1中，醪糟为市售食用醪糟。
优选的，所述s1中，可溶性壳聚糖为纯度为90％以上的市售产品。
优选的，所述甘油、酵母浸粉、磷酸氢二钾、醪糟、可溶性壳聚糖和水按g:g:g:g:g:L计为15:8:2:4:55:1。
优选的，所述s1中，调节培养基的pH值为6。
优选的，所述s3中，氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度为0.1mol/L。
优选的，所述s2中，细菌纤维素的生产菌株为木醋杆菌菌株。
优选的，所述木醋杆菌菌株菌液的制备方法为：从-75℃冰箱中取出木醋杆菌生产菌种保藏管，火焰干法消毒下，敲碎木醋杆菌菌种保藏管管口，用吸管吸取木醋杆菌种子培养液若干，推入管中木醋杆菌菌粉至乳悬液状态，摇匀后接种至木醋杆菌种子培养液中，扩增为高生物量的木醋杆菌菌液，然后将接种了木醋杆菌菌液的培养基，置于30℃恒温摇床中连续动态培养48h，即可生产出大量膜片状的细菌纤维素。
优选的，所述s2中，细菌纤维素的生产菌株的接种比例为6％。
优选的，所述s1中，培养基的灭菌温度为121℃，时间为20min。
本发明的有益效果在于：
1)本发明的制备方法明显提高了细菌纤维素产量，通过将原培养基中的葡萄糖替换为甘油，碳酸钙替换成磷酸氢二盐，新加入醪糟和可溶性壳聚糖，以及对培养基各个组分的配比进行优化，可显著提高细菌纤维素的产量，大幅度降低细菌纤维素的生产成本，从而能够有效促进细菌纤维素的产业化生产和推广应用；
2)本发明的提高细菌纤维素产量的方法，具有操作简单，条件温和，且安全环保等优点，在细菌纤维素的生产技术领域中具有推广应用价值。
附图说明
图1为本发明方法制得的细菌纤维素膜的形态图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
一种提高细菌纤维素产量的方法，包括以下步骤：
s1、打开洁净实验台，用紫外灯照射30min消毒，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌生产菌种保藏管，火焰干法消毒下，用镊子敲碎木醋杆菌菌种保藏管管口，用吸管吸取木醋杆菌种子培养液若干，推入管中木醋杆菌菌粉至乳悬液状态，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，连续动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；
s2、向7.5g甘油中，加入4g酵母浸粉，1.5g磷酸氢二钾和0.5L去离子水，混合制成生产细菌纤维素的培养基，并调节培养基的pH值为6.0，分装至500mL的三角烧瓶中，每瓶200mL，分装成2瓶，剩余的用于备用，然后在121℃条件下灭菌20min，冷却至30℃左右时，按6％的比例接种木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液在30℃条件下，恒温需氧静置培养7天；
s3、培养结束后，用镊子夹出培养液中的细菌纤维素膜，用去离子水洗3至4次，加入0.1mol/L的氢氧化钠，80℃处理1h；处理后用去离子水清洗至去离子水为中性，用离心机4000rpm/min,离心30min后，称量湿膜的重量；将称量后的湿膜在50-70℃下烘干至恒重，并称量干膜重量。
实施例2
一种提高细菌纤维素产量的方法，包括以下步骤：
s1、打开洁净实验台紫外灯照射30min后，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌菌种，在火焰旁，用镊子敲碎木醋杆菌菌种，用一次性注射器吸取木醋杆菌培养液，稀释木醋杆菌菌粉，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；
s2、向7.5g甘油中，加入4g酵母浸粉，1.0g磷酸氢二钠和0.5L去离子水，混合制成生产细菌纤维素的培养基，并调节培养基的pH值为6.0，分装至500mL的三角烧瓶中，每瓶200mL，分装成2瓶，剩余的用于备用，然后在121℃条件下灭菌20min，冷却至30℃左右时，按6％的比例接种木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液在30℃条件下，恒温需氧静置培养7天；
s3、培养结束后，用镊子夹出培养液中的细菌纤维素膜，用去离子水洗3至4次，加入0.1mol/L的氢氧化钠，80℃处理1h；处理后用去离子水清洗至去离子水为中性，用离心机4000rpm/min,离心30min后，称量湿膜的重量；将称量后的湿膜在50-70℃下烘干至恒重，并称量干膜重量。
实施例3
一种提高细菌纤维素产量的方法，包括以下步骤：
s1、打开洁净实验台紫外灯照射30min后，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌菌种，在火焰旁，用镊子敲碎木醋杆菌菌种，用一次性注射器吸取木醋杆菌培养液，稀释木醋杆菌菌粉，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；
s2、向7.5g甘油中，加入2.5g酵母浸粉，3g蛋白胨，1.5g磷酸氢二钾和0.5L去离子水，混合制成生产细菌纤维素的培养基，并调节培养基的pH值为6.0，分装至500mL的三角烧瓶中，每瓶200mL，分装成2瓶，剩余的用于备用，然后在121℃条件下灭菌20min，冷却至30℃左右时，按6％的比例接种木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液在30℃条件下，恒温需氧静置培养7天；
s3、培养结束后，用镊子夹出培养液中的细菌纤维素膜，用去离子水洗3至4次，加入0.1mol/L的氢氧化钠，80℃处理1h；处理后用去离子水清洗至去离子水为中性，用离心机4000rpm/min,离心30min后，称量湿膜的重量；将称量后的湿膜在50-70℃下烘干至恒重，并称量干膜重量。
实施例4
一种提高细菌纤维素产量的方法，包括以下步骤：
s1、打开洁净实验台紫外灯照射30min后，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌菌种，在火焰旁，用镊子敲碎木醋杆菌菌种，用一次性注射器吸取木醋杆菌培养液，稀释木醋杆菌菌粉，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；
s2、向7.5g甘油中，加入5.5g蛋白胨，1.5g磷酸氢二钾和0.5L去离子水，混合制成生产细菌纤维素的培养基，并调节培养基的pH值为6.0，分装至500mL的三角烧瓶中，每瓶200mL，分装成2瓶，剩余的用于备用，然后在121℃条件下灭菌20min，冷却至30℃左右时，按6％的比例接种木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液在30℃条件下，恒温需氧静置培养7天；
s3、培养结束后，用镊子夹出培养液中的细菌纤维素膜，用去离子水洗3至4次，加入0.1mol/L的氢氧化钠，80℃处理1h；处理后用去离子水清洗至去离子水为中性，用离心机4000rpm/min,离心30min后，称量湿膜的重量；将称量后的湿膜在50-70℃下烘干至恒重，并称量干膜重量。
对照实施例1
现有生产细菌纤维素的方法，包括以下步骤：
s1、打开洁净实验台紫外灯照射30min后，从-75℃冰箱中取出木醋杆菌菌种，在火焰旁，用镊子敲碎木醋杆菌菌种，用一次性注射器吸取木醋杆菌培养液，稀释木醋杆菌菌粉，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液；
s2、向50g葡萄糖中，加入5g酵母浸粉，10g碳酸钙和0.5L去离子水，混合制成生产细菌纤维素的培养基，并调节培养基的pH值为6.0，分装至500mL的三角烧瓶中，每瓶200mL，分装成2瓶，剩余的用于备用，然后在121℃条件下灭菌20min，冷却至30℃左右时，按6％的比例接种木醋杆菌菌株种子液，将接种好种子液的培养液在30℃条件下，恒温需氧静置培养7天；
s3、培养结束后，用镊子夹出培养液中的细菌纤维素膜，用去离子水洗3至4次，加入0.1mol/L的氢氧化钠，80℃处理1h；处理后用去离子水清洗至去离子水为中性，用离心机4000rpm/min,离心30min后，称量湿膜的重量；将称量后的湿膜在50-70℃下烘干至恒重，并称量干膜重量。
实施例1制得的细菌纤维素的湿膜的形态结构图如图1所示。从图1中分析可知，制得的细菌纤维素的湿膜具有良好的柔韧性和抗撕拉能力。
将实施例1～实施例4，以及对照实施例1制得的细菌纤维素进行称重，其中，细菌纤维素膜含水量计算：含水率＝(湿膜重量-干膜重量)/湿膜重量×100％，结果如表1所示。
表1五种不同培养基的细菌纤维素产量
Figure BDA0003046200610000061
Figure BDA0003046200610000071
从表1中分析可知，实施例1～实施例4中的配方以及配比制成的细菌纤维素含量均高于对照实施例1制得的细菌纤维素，且实施例1中的制得的细菌纤维素湿重高于由对照实施例1制得的细菌纤维素含量的5倍左右，同时，实施例1～实施例4中，所使用的原料的量大大降低，从而证明了以酵母浸粉做为氮源，可明显提高细菌纤维素的产量，以及大大降低生产成本。
综上所述，本发明的提高细菌纤维素产量的方法，通过将原培养基中的葡萄糖替换为甘油，碳酸钙替换成磷酸氢二盐，以及对成分配比进行优化，可显著提高细菌纤维素的产量，大幅度降低细菌纤维素的生产成本，可有效促进细菌纤维素的推广应用和产业化；且具有操作简单，条件温和，安全环保等优点，在细菌纤维素的生产领域具有推广应用价值。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (6)

1.一种提高细菌纤维素产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
s1、向甘油中加入氮源、磷酸氢二盐和水，混合制成生产细菌纤维素的培养基，并调节培养基的pH值为5.8~6.2，然后在115~125℃条件下灭菌，冷却；所述氮源为酵母浸粉；所述磷酸氢二盐为磷酸氢二钾；所述甘油、氮源、磷酸氢二盐和水按g:g:g:L计为15:8:3:1；
s2、待灭菌后的培养基冷却至25~35℃时，接种细菌纤维素的生产菌株，接种比例为5~7%，将接种好生产菌株的培养液在28~32℃条件下，恒温需氧静置培养6~8天；所述细菌纤维素的生产菌株为木醋杆菌菌株；
s3、培养结束后，从培养液中取出长成的细菌纤维素膜片，用水洗涤后，加入氢氧化钠溶液，在80℃条件下进行脱色处理，再用水洗涤，离心除去表面水分，即得细菌纤维素湿膜片，将其冻干或真空干燥，即得细菌纤维素干膜片。
2.根据权利要求1所述提高细菌纤维素产量的方法，其特征在于，所述s1中，调节培养基的pH值为6。
3.根据权利要求1所述提高细菌纤维素产量的方法，其特征在于，所述s3中，氢氧化钠溶液中氢氧化钠的浓度为0.1mol/L。
4.根据权利要求1所述提高细菌纤维素产量的方法，其特征在于，所述木醋杆菌菌株种子液的制备方法为：从-75℃冰箱中取出木醋杆菌生产菌种保藏管，火焰干法消毒下，敲碎木醋杆菌菌种保藏管管口，用吸管吸取木醋杆菌种子培养液若干，推入管中木醋杆菌菌粉至乳悬液状态，溶解完全后接种至木醋杆菌培养基中；然后将接种后的木醋杆菌培养基置于30℃恒温摇床中，连续动态培养48h，得木醋杆菌菌株种子液，用于接种。
5.根据权利要求1所述提高细菌纤维素产量的方法，其特征在于，所述s2中，细菌纤维素的生产菌株的接种比例为6%。
6.根据权利要求1所述提高细菌纤维素产量的方法，其特征在于，所述s1中，培养基的灭菌的温度为121℃，时间为20min。
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