CN107586801A - 一种利用棉杆制备细菌纤维素的方法 - Google Patents

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孙东平
鞠鹏程
陈金波
梁光芸
孙汴京
陈春涛
杨加志
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Abstract

本发明公开了一种利用棉杆制备细菌纤维素的方法。所述方法通过将干燥粉碎后的棉杆置于稀硫酸中，在120℃‑130℃下处理1‑2h，然后利用纤维素酶降解棉杆中的木质纤维素，再进行脱毒处理和脱色处理，利用过滤得到的棉杆酸解液配制发酵培养基，高温灭菌冷却后，接入木醋杆菌种子液，最后动态培养得到细菌纤维素。本发明利用废弃物棉杆做原料，以棉杆酸解液作为碳源和部分氮源，发酵生产细菌纤维素，既减少了环境污染和合理利用了农业废物，又为工业化低成本生产细菌纤维素提供了廉价的碳源。

Description

一种利用棉杆制备细菌纤维素的方法
技术领域
本发明属于细菌纤维素的制备技术领域，涉及一种利用棉杆制备细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素是由某些细菌合成的一种多聚糖，具有良好的生物相容性、可降解性和保水性等独特性能，在生物医学、组织工程以及食品等诸多领域得到广泛的应用。但受制于成本高、产量低，细菌纤维素的生产迟迟没有规模产业化。因此，降低细菌纤维素的成本是目前工业化大规模生产的一个亟待解决的问题。利用廉价的碳源是降低细菌纤维素培养基成本的有效方式。
棉杆属于农业废弃物，由于近年来农村劳动力的流失和劳动成本的增加，对农业废弃物的利用率越来越低。据统计我国该类废弃物每年可回收2亿吨，具有非常巨大的资源利用潜力。棉杆的成分中，纤维素含量低，木质素、半纤维素和粗蛋白含量高。在酸性条件下，可以水解成葡萄糖、戊糖、己糖和氨基酸等小分子。由于纤维素和粗蛋白水解所需的酸浓度不同，所以需要一个相对中间的酸度进行水解，以扩大棉杆在发酵过程中作为碳源和小部分氮源的作用。目前棉杆的利用形式有很多，包括造纸、直接燃料、种植双孢菇、堆肥饲料等，用于制备酸解液发酵的还比较少见。CN201710595452利用木质纤维素降解液作碳源制备细菌纤维素，通过碱预处理，该方法的葡萄糖转化率不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用棉杆制备细菌纤维素的方法，以棉杆作为碳源制备细菌纤维素的方法。
为实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种利用棉杆制备细菌纤维素的方法，具体步骤如下：
步骤1，棉杆干燥粉碎后，加入体积分数为4％-6％的稀硫酸，于120℃-130℃处理1-2h，冷却过滤，加入15FPU/g的纤维素酶降解3h，之后加入氢氧化钙，调节pH至9-11，进行脱毒处理1-2h，过滤调节pH至6，脱色过滤，即得棉杆酸解液，其中，棉杆粉末与稀硫酸的质量体积比为1：10-11；
步骤2，在棉杆酸解液中加入硫酸镁、柠檬酸、磷酸二氢钾、蛋白胨和酵母浸粉配制成发酵培养基，高温灭菌，冷却至常温，其中硫酸镁、柠檬酸、磷酸二氢钾、蛋白胨、酵母浸粉与棉杆溶解液的质量体积比分别为0.05％、0.06％、0.6％、1.2％、0.9％；
步骤3，将木醋杆菌种子液接种到发酵培养基中，动态培养，收集细菌纤维素。
步骤1中，所述的棉杆的干燥温度为120℃，干燥时间为30min，棉杆粉末的细度为40目以上。
步骤1中，所述的脱色处理为活性炭脱色，活性炭的质量为酸解液质量的1％-3％。
步骤3中，所述的木醋杆菌种子液的体积为发酵培养基的8％。
步骤3中，所述的动态培养中，转速为150-200rpm，培养时间为6d。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)有效利用农业废弃物棉杆，不仅减少环境污染，而且为工业化低成本生产细菌纤维素提供了廉价的碳源，同时以适中的低浓度硫酸酸解棉杆，无需经过离子液体预处理，简化了制备工艺，节约了人力和财力；
(2)相较于加碱预处理木质纤维素的方法，高温稀酸预处理提高了酶水解效率，葡萄糖转化率更高，而且在稀酸条件下会有粗蛋白水解成氨基酸，可以作为一部分氮源使用，使得棉杆的利用率更高。
附图说明
图1是实施例1制备的细菌纤维素的外观形态图。
图2是实施例1制备的细菌纤维素的红外光谱图。
图3是实施例2制备的细菌纤维素的SEM图。
图4是实施例3制备的细菌纤维素的XPS图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
实施例1
步骤1，棉杆酸解液的制备：将30g棉杆放置于130℃烘箱中干燥30min，取出后用球磨机粉碎后过40目筛，将20g棉杆粉末加入到200mL体积分数为4％的稀硫酸中，磁力搅拌均匀后，放入到120℃的烘箱中酸解2h，过滤后加入15FPU/g的纤维素酶降解3h，氢氧化钙调节pH至9脱毒处理2h，过滤后用2.5M硫酸调节pH至6，最后加入6g活性炭并过滤，得到棉杆酸解液。
步骤2，发酵培养基的配制：取100mL棉杆酸解液，依次加入0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾、1.2g蛋白胨和0.9g酵母浸粉，搅拌均匀配成培养基，121℃灭菌30min后，放入冷柜中冷却至4℃即得到发酵培养基。
步骤3，菌种接种与动态培养：将发酵培养基接入体积为发酵培养基的8％的种子液，30℃、200rpm条件下动态培养6d，既得细菌纤维素。
经过HPLC分析，棉杆酸解液中葡萄糖浓度为70g/L。
图1为制得的细菌纤维素。用傅里叶变换红外光谱仪对所制成的细菌纤维素扫描显示，结果如图2，用棉杆酸解液培养的细菌纤维素和纤维素标准谱图基本一致。
实施例2
步骤1，棉杆酸解液的制备：将30g棉杆放置于130℃烘箱中干燥30min，取出后用球磨机粉碎后过40目筛，将20g棉杆粉末加入到220mL体积分数为6％的稀硫酸中，磁力搅拌均匀后，放入到120℃的烘箱中酸解2h，过滤后加入15FPU/g的纤维素酶降解3h，加入氢氧化钙调节pH至11脱毒处理2h，过滤后用2.5M硫酸调节pH至6，最后加入6g活性炭并过滤，得到棉杆酸解液。
步骤2，发酵培养基的配制：取100mL棉杆酸解液，依次加入0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾、1.2g蛋白胨和0.9g酵母浸粉，搅拌均匀配成培养基，121℃灭菌30min后，放入冷柜中冷却至4℃即得到发酵培养基。
步骤3，菌种接种与动态培养：将发酵培养基接入体积为发酵培养基的8％的种子液，30℃、200rpm条件下动态培养6d，既得细菌纤维素。
经过HPLC分析，棉杆酸解液中葡萄糖浓度为73g/L。
将所得细菌纤维素冷冻干燥，用电子扫描显微镜观察琪形态，结果如图4所示，用棉杆酸解液制得的细菌纤维素具有三维网状结构，可以用于医用生物材料方面的应用。
实施例3
步骤1，棉杆酸解液的制备：将30g棉杆放置于125℃烘箱中干燥30min，取出后用球磨机粉碎后过40目筛，将20g棉杆粉末加入到200mL体积分数为5％的稀硫酸中，磁力搅拌均匀后，放入到120℃的烘箱中酸解1.5h，过滤后加入15FPU/g的纤维素酶降解3h，加入氢氧化钙调节pH至10脱毒处理1.5h，过滤后用2.5M硫酸调节pH至6，最后加入6g活性炭并过滤，得到棉杆酸解液。
步骤2，发酵培养基的配制：取100mL棉杆酸解液，依次加入0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾、1.2g蛋白胨和0.9g酵母浸粉，搅拌均匀配成培养基，121℃灭菌30min后，放入冷柜中冷却至4℃即得到发酵培养基。
步骤3，菌种接种与动态培养：将发酵培养基接入体积为发酵培养基的8％的种子液，30℃、200rpm条件下动态培养6d，既得细菌纤维素。
经过HPLC分析，棉杆酸解液中葡萄糖浓度为72g/L。
将所得细菌纤维素冷冻干燥，用XPS测试仪测试，结果如图4所示，可知棉杆酸解液制得的细菌纤维素的结晶度为14％。
对比例1
步骤1，棉杆酸解液的制备：将30g棉杆放置于120℃烘箱中干燥30min，取出后用球磨机粉碎后过40目筛，将20g棉杆粉末加入到240mL体积分数为4％的稀硫酸中，磁力搅拌均匀后，放入到120℃的烘箱中酸解2h，过滤后加入15FPU/g的纤维素酶降解3h，加入氢氧化钙调节pH至11脱毒处理2h，过滤后用2.5M硫酸调节pH至6，最后加入6g活性炭并过滤，得到棉杆酸解液。
步骤2，发酵培养基的配制：取100mL棉杆酸解液，依次加入0.05g硫酸镁、0.06g柠檬酸、0.6g磷酸二氢钾、1.2g蛋白胨和0.9g酵母浸粉，搅拌均匀配成培养基，121℃灭菌30min后，放入冷柜中冷却至4℃即得到发酵培养基。
步骤3，菌种接种与动态培养：将发酵培养基接入体积为发酵培养基的8％的种子液，30℃、200rpm条件下动态培养4d，既得细菌纤维素。
经过HPLC分析，棉杆酸解液中葡萄糖的含量为55g/L，即当棉杆与稀硫酸的质量体积比到1：12时，超过1：10～11时，葡萄糖的转化率有一个显著的下降。

Claims (5)

1.一种利用棉杆制备细菌纤维素的方法，其特征在于，具体步骤如下：
步骤1，棉杆干燥粉碎后，加入体积分数为4％-6％的稀硫酸，于120℃-130℃处理1-2h，冷却过滤，加入15FPU/g的纤维素酶降解3h，之后加入氢氧化钙，调节pH至9-11，进行脱毒处理1-2h，过滤调节pH至6，脱色过滤，即得棉杆酸解液，其中，棉杆粉末与稀硫酸的质量体积比为1：10-11；
步骤2，在棉杆酸解液中加入硫酸镁、柠檬酸、磷酸二氢钾、蛋白胨和酵母浸粉配制成发酵培养基，高温灭菌，冷却至常温，其中硫酸镁、柠檬酸、磷酸二氢钾、蛋白胨、酵母浸粉与棉杆溶解液的质量体积比分别为0.05％、0.06％、0.6％、1.2％、0.9％；
步骤3，将木醋杆菌种子液接种到发酵培养基中，动态培养，收集细菌纤维素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述的棉杆的干燥温度为120℃，干燥时间为30min，棉杆粉末的细度为40目以上。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中，所述的脱色处理为活性炭脱色，活性炭的质量为酸解液质量的1％-3％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述的木醋杆菌种子液的体积为发酵培养基的8％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中，所述的动态培养中，转速为150-200rpm，培养时间为6d。
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