KR101816859B1 - 감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스 제조 방법 - Google Patents

감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스 제조 방법에 관한 것으로, 감귤 착즙박에서 당화 효율을 증진시키는 신규한 균주 아스페르길러스 나이거 NY(Aspergillus nigerNY)를 분리 동정하였으며, 상기 균주와 감귤 착즙박을 함께 당화하여 환원당 전환 활성이 높은 효소액을 제조하고, 상기 효소액을 탄소원으로 사용하여 글루콘아세토박터 속 GS7(Gluconacetobactersp.GS7)균주가 박테리아 셀룰로오스 생성 능력이 향상됨을 확인함으로써, 본 발명의 감귤 착즙박이 박테리아 셀룰로오스 제조에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스 제조 방법{A Method for producing Bacterial Cellulose Using juice extraction cake of Citrus Fruits}
본 발명은 감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스(bacterial cellulose) 제조 방법에 관한 것이다.
셀룰로오스는 목재와 종이 등으로 각종 산업과 일생생활에서 중요한 위치를 차지하고 있는데, 이는 자연계에 가장 풍부한 생체물질자원으로 특히 미생물, 주로 초산균로부터 유래되는 박테리아 셀룰로오스(bacterial cellulose)는 식품 첨가제뿐 아니라 고부가가치 산업용 신소재로 많은 주목을 받고 있다. 일반적인 식물체가 생성하는 셀룰로오스와는 달리 박테리아 셀룰로오스는 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 리그닌(lignin)과 같은 불순물이 함유되지 않은 고순도의 셀룰로오스로 물리학적인 성질이 매우 우수하여 실용화 소재 개발에 많은 연구가 진행 되고 있다.
필리핀에서는 셀룰로오스를 이용하여 코코넛 가공식품인 나타드코코(nata de coco)를 제조하였고, 이는 필리핀 과실 가공식품의 31%를 차지하며, 이들 중 96%가 일본으로 수출되고 있다. 또한, 일본에서는 박테리아 셀룰로오스의 우수한 물리적인 장점을 이용하여 고급 헤드폰이나 스피커의 진동판 원료로 사용하여 연간 10만조 이상의 수익을 올리고 있다. 박테리아 셀룰로오스는 밀도가 높고 파괴 길이(breaking length)가 길며 중합도가 크기 때문에 고급 종이의 첨가제로 사용 가능하며, 특유의 망상구조로 함수율이 높기 때문에 화상치료제에도 사용되고 있다. 최근에는 난소화성과 고점성을 이용하여 식이섬유로도 이용되고 있으며, 일본의 통상성은 박테리아 셀룰로오스의 대량생산 시스템 확립 및 용도개발을 위하여 활발한 연구를 진행하고 있다.
식물 유래의 셀룰로오스와 박테리아 셀룰로오스는 구조적으로 커다란 차이를 나타내는데, 식물 유래의 셀룰로오스는 미세섬유 묶음 형태로 구성이 되는 반면에 박테리아 셀룰로오스는 리본형 섬유로 구성되어진다. 또한 다른 물질이 포함되지 않은 순수한 상태의 셀룰로오스로 생산이 되어 강도, 보수성, 유화현탁 안정성 및 결착성 등이 뛰어난 특징(Ross R, et al., Microbiol. Reviews., 325(15), 35-38, 1991)을 가질 뿐 아니라 산업용 신소재로서 다양한 용도 개발이 가능하여 균주 개량에 의한 생산성 향상, 유전자 조작 및 배양 조건의 확립 등에 관한 연구결과로 고강도용 공업재료, 복합섬유, 의료용 재료 및 효소 고정화 등의 첨단 소재로의 전망도 밝다.
박테리아 셀룰로오스의 또 다른 주요 특성은 우수한 생분해성을 갖는 것이다. 박테리아 셀룰로오스는 토양 중에서 1개월 내에 생분해되기 때문에 환경적인 측면에서도 촉망받는 고분자 재료이다. 저비용 대량생산이 가능하다면, 친환경적 고분자 소재로써 그 능력이 매우 우수할 것이다.
그러나 현재까지도 박테리아 셀룰로오스의 다양한 기능성을 충분히 살리지 못하고 있는 이유는 대량생산의 배양기술이 제대로 확립되지 않았을 뿐 아니라 생산 원료로써 상업적인 복합배지를 사용하고 있기 때문에 원료 비용이 많이 소요되는 단점을 갖는다.
종래의 셀룰로오스 생산에서 사용되는 탄소원은 포도당이 가장 대표적이고(Masaoka S, et al., J. Fermen. Bioeng., 75, 18-22, 1993), 다른 소재로 천연재료 중 감즙 및 감식초(Kim SY, et al., Appl Biochem Biotechnol., 129-132, 705-15, 2006), 사과즙(Lee OS, et al., J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr., 31(4), 572- 577, 2002), 포도즙(Son CJ, et al., J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 12(5), 722-728, 2002), 맥주 폐액 (Park JK, et al., Kor Chem Eng Res., 44(1), 52-57, 2006) 및 코코넛 부산물(Jonas R, et al., Polym Degrad Stab., 59, 101-106, 1998) 등이 활용된 사례가 발표되고 있다.
이에 본 발명자들은 저비용, 고품질의 박테리아 셀룰로오스 대량 생산기술을 개발하기 위해 노력하던 중, 감귤 주스 공장에서 나오는 폐기물인 감귤 착즙박에서 당화 효율을 증진시키는 신규한 균주 아스페르길러스 나이거 NY(Aspergillus nigerNY)를 분리 동정하였으며, 상기 균주와 감귤 착즙박을 함께 당화하여 환원당 전환 활성이 높은 효소액을 제조하고, 상기 효소액을 탄소원으로 사용하여 글루콘아세토박터 속 GS7(Gluconacetobactersp.GS7)균주가 박테리아 셀룰로오스 생성 능력이 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스(bacterial cellulose) 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 수탁번호 KCTC18373P으로 기탁된 아스페르길러스 나이거NY(Aspergillus nigerNY) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 상기 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배양액에 감귤 착즙박을 혼합하는 단계를 포함하는 감귤 착즙박 당화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 감귤 착즙박을 당화시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 당화된 감귤 착즙박에 종균을 배양하는 단계를 포함하는 감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스(bacterial cellulose) 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스(bacterial cellulose) 제조 방법에 관한 것으로, 감귤 착즙박에서 당화 효율을 증진시키는 신규한 균주 아스페르길러스 나이거 NY(Aspergillus nigerNY)를 분리 동정하였으며, 상기 균주와 감귤 착즙박을 함께 당화하여 환원당 전환 활성이 높은 효소액을 제조하고, 상기 효소액을 탄소원으로 사용하여 글루콘아세토박터 속 GS7(Gluconacetobactersp.GS7)균주가 박테리아 셀룰로오스 생성 능력이 향상됨을 확인함으로써, 본 발명의 감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스 제조 방법이 저비용, 고효율의 박테리아 셀룰로오스 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 전처리 과정에 따른 감귤 착즙박을 나타낸 도이다.
도 2는 아스페르길러스 나이거NY(Aspergillus nigerNY) 균주의 18S rRNA의 전체 염기서열을 나타낸 도이다.
도 3은 아스페르길러스 나이거NY 균주를 광학현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 아스페르길러스 나이거NY 효소액의 시간당 환원당량을 나타낸 도이다.
도 5는 아스페르길러스 나이거NY 효소액 및 비스코자임의 환원당량을 나타낸 도이다.
도 6은 셀룰로오스(CMC), 크실란(Xylan) 및 팩틴(Pectin)에 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 처리하여 시간당 환원당량을 나타낸 도이다.
도 7은 글루콘아세토박터 속 GS7(Gluconacetobactersp.GS7) 균주를 아스페르길러스 나이거NY 효소액에 접종하여 생산된 셀룰로오스를 나타낸 도이다:
RT: 글루콘아세토박터 속 GS7 균주를 아스페르길러스 나이거NY 효소액에 접종하여 실온에서 배양한 것;
AT: 감귤 착즙박을 황산 처리하여 고온고압 처리한 것;
원액: 글루콘아세토박터 속 GS7 균주를 아스페르길러스 나이거NY 효소액에 접종한 것;
10배 희석: 글루루콘아세토박터 속 GS7 균주를 10배 희석한 아스페르길러스 나이거NY 효소액에 접종한 것; 및
C: 아스페르길러스 나이거NY 효소액 대신 증류수를 첨가한 것.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC18373P으로 기탁된 아스페르길러스 나이거NY(Aspergillus nigerNY) 균주를 제공한다.
상기 균주는 한국생명공학연구원이 감귤 착즙박으로부터 분리한 균주로 2015년 4월 8일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁번호 KCTC18373P으로 기탁되어 있는 균주이다.
또한, 상기 균주는 18S rRNA 유전자 상동성 검색에서, 아스페르길러스 나이거(Aspergillus niger)형의 곰팡이 균주와 100%의 유사성을 나타내는 신규한 균주로 확인되었는 바, 이를 아스페르길러스 나이거로 분류하였고, 상기 균주는 감귤 착즙박의 당화 효율을 증진시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 감귤 착즙박을 세척하여 당 및 용해성 성분을 제거한 후 50℃에서 48시간 건조시켜, 분쇄하여 가루형태로 전처리 하였다(도 1 참조). 전처리 된 감귤 착즙박 가루를 배지와 1 : 1 비율로 혼합하여 121℃에서 15분간 멸균한 뒤, 인근 대나무 숲에서 채취한 토양 시료와 혼합한 뒤 25℃, 습도 80% 조건에서 약 5일간 배양 후 형성된 검은색 곰팡이 포자를 분리배양 하여 광학현미경으로 관찰하였다(도 3 참조). 상기 분리된 단일 곰팡이 균주의 18S rRNA의 전체 염기서열을 결정하여 %유사도와 계통수를 분석한 결과, 아스페르길러스 나이거(Aspergillus niger)형의 곰팡이 균주와 100% 유사한 것을 확인하였고(도 2 참조), 상기 균주를 아스페르길러스 나이거NY(Aspergillus nigerNY)라고 명명하였다.
본 발명은,
1) 수탁번호 KCTC18373P으로 기탁된 아스페르길러스 나이거NY 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배양액에 감귤 착즙박을 혼합하는 단계를 포함하는 감귤 착즙박 당화 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 배양액은 탄소원으로 감귤 착즙박을 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 1)의 배양액의 배양 배지는 질소원으로 효모 추출물(yeast extract), 소이톤(soytone), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 맥아 추출물(malt extract), 콩 분말, 콩 비지 분말, 청국장 분말, 된장 분말 등의 천연 질소원, 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염, 질산염, 유레아 등의 유·무기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 배지에 바람직하게는 0.1 내지 8.0%(w/w)의 범위로 포함될 수 있다. 천연 질소원을 사용할 경우 타 미생물에 의한 원치 않는 발효를 방지하기 위해서 이를 멸균하여 사용할 수 있다. 멸균은 고온·고압 멸균법, 자외선 조사 등 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
또한, 상기 단계 1)의 배양액의 배양 배지는 보조 탄소원을 추가적으로 포함하여 제조될 수 있다. 보조 탄소원은 미생물의 생육에 있어 필수적인 성분은 아니나 미생물의 생육 및/또는 미생물에 당화 과정을 촉진시키기 위하여 첨가되는 성분으로 예컨대 젖산, 구연산, 숙신산, 시트르산, 아세트산, 에탄올, 포름산, 말산, 피부르산 등이 사용될 수 있으며, 나아가 이들 성분 중 하나 이상을 본래 포함하고 있거나 이들 성분 중 하나 이상의 성분이 인위적으로 첨가된 감즙(Kim SY, et al., Appl Biochem Biotechnol., 129-132, 705-15, 2006),감식초(Kim SY, et al., Appl Biochem Biotechnol., 129-132, 705-15, 2006), 사과즙(Lee OS, et al., J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr., 31(4), 572-577, 2002), 포도즙(Son CJ, et al., J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 12(5), 722-728, 2002), 맥주 폐액(Park JK, et al., Kor Chem Eng Res., 44(1), 52-57, 2006), 코코넛 부산물(Jonas R, et al., Polym Degrad Stab., 59, 101-106, 1998), 파인애플 과즙(일본 특허출원 제1999-299034호 참조), 감귤 착즙박 등을 들 수 있다.
또한, 상기 단계 1)의 배양액의 배양 배지는 무기염류와 미량원소를 추가로 포함하여 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 무기염류로서는 인산수소나트륨, 황산마그네슘, 염화철, 칼슘염, 망간염, 코발트염, 몰리브텐산염, 킬레이트금속염 등을 들 수 있으며, 미량원로소로서는 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 아황산 펄프 폐액 등을 들 수 있다. 이들 무기염류와 미량원소는 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 0.001 내지 3.0%(w/w)의 범위로 배지에 포함될 수 있다.
또한, 상기 단계 1)의 배양은 20 내지 30℃에서 5 내지 10일간 배양하는 것이 바람직하고, 25℃에서 7일간 배양하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 20℃ 미만의 온도에서 5일 미만의 기간동안 배양하는 경우 아스페르길러스 나이거NY 균주가 충분히 성장할 수 없고, 30℃ 초과의 온도에서 10일을 초과하여 배양하는 경우 상기 균주의 수가 과도하게 증가하여 균주가 사멸기에 들어갈 수 있는 문제점이 있다.
또한, 상기 단계 1)의 배양에서 배양 방법은 정치배양법과 연속배양법 모두 바람직하고, 정치배양법이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
또한, 상기 단계 2)의 "감귤"은 유럽 남부 등지에서 재배되는 시트론(citron), 미국 캘리포니아 등지에서 재배되는 레몬(lemon), 열대 지방 등지에서 재배되는 문단이나 자몽 등의 문단류, 미국의 플로리디 등지에 재배되는 문단의 돌연변이종인 그레이프 프루트(grape fruit), 인도, 이탈리아 등지에서 재배되는 광귤(sour orange), 중국이나 우리나라에서 재배되는 금귤이나 유자(柚子), 우리나라 제주도 등에서 재배되는 한라봉, 진지향, 진귤, 산귤, 청귤, 동정귤, 당유자, 홍귤, 편귤, 사두감, 주감, 탱귤 등을 모두 포함하는 의미이다.
또한, 상기 단계 2)의 "감귤 착즙박"은 감귤 원과(과피와 과육 포함)를 착즙한 후에 잔여물로서 얻어진 부산물(감귤 원과 착즙 박), 감귤 과육를 착즙한 후에 잔여물로서 얻어진 부산물(감귤 과육 착즙 박), 감귤 과피 분쇄물, 또는 이들의 혼합물을 의미한다.
또한, 상기 단계 2)의 감귤 착즙박은 감귤 원과 박이나 감귤 과육 박의 경우는 이들 부산물이 처리되는 효소 활성을 저해하지 않을 만큼 충분한 수분을 지니고 있어 효소 처리를 위해 특별히 물을 첨가하지 않고 효소 처리하여 얻어진 것을 사용하여도 무방하지만, 감귤 과피 분쇄물의 경우는 수분 함량이 낮아 물을 첨가하지 않고 효소 처리할 경우 효소 활성이 충분히 발휘되지 않을 수 있으므로, 감귤 과피 분쇄물의 효소 처리물은 감귤 과피 분쇄물에 물을 첨가한 후 효소 처리하고 얻어진 결과물을 사용하는 것이 바람직하다. 이때 첨가되는 물의 양은 통상 감귤 과피 분쇄물의 0.5 내지 2.0배 중량 범위에서 결정될 것이다. 감귤 부산물의 효소 처리물을 얻기 위한 효소의 첨가량과 효소의 처리 시간은 아래의 실시예 및 실험예를 참조할 때 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 결정될 수 있다.
또한, 상기 단계 2)의 혼합은 배양액 및 감귤 착즙박을 3 : 1 내지 1 : 3의 부피비로 혼합하는 것이 바람직하고, 2 : 1 내지 1 : 2의 부피비로 혼합하는 것이 더욱 바람직하나, 본 발명의 실시예에 의하면 1 : 1의 부피비로 혼합하는 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 단계 2)의 혼합 배양액은 30 내지 60℃에서 반응시키는 것이 바람직하고, 40 내지 50℃에서 반응시키는 것이 더욱 바람직하나, 본 발명의 실시예에 의하면 45℃에서 반응시키는 것이 가장 바람직하다. 30℃ 미만의 온도에서 반응시키는 경우, 당화에 이용되는 효소의 활성이 낮아 당화가 충분히 진행되지 않고, 60℃ 초과의 온도에서 반응시키는 경우, 당화에 이용되는 효소가 불활성되어 당화 효율이 떨어지게되는 문제점이 있다.
또한, 상기 단계 2)의 혼합 배양액은 24 내지 60시간 반응시키는 것이 바람직하고, 36 내지 50시간 반응시키는 것이 더욱 바람직하나, 본 발명의 실시예에 의하면 48시간 반응시키는 것이 가장 바람직하다. 24시간 미만으로 반응시키는 경우, 충분한 당화 시간을 가질 수 없고, 60시간 초과로 반응시키는 경우, 당화 효과에 차이가 없어 소요 시간 대비 낮은 경제성을 초래할 문제가 있다.
또한, 상기 단계 2)의 당화는 분리 가수분해 및 배양(SHF), 동시 당화 및 발효(SSF), 동시 당화 및 공발효(SSCF), 혼성 가수분해 및 발효(HHF), SHCF(분리 가수분해 및 공발효), HHCF(혼성 가수분해 및 발효), 및 직접 세균 전환(DMC)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 단계 2)의 당화는 일반적으로 제어된 pH, 온도 및 혼합 조건하에서 교반-탱크 반응기 또는 발효기에서 행할 수 있다. 적합한 공정 시간, 온도 및 pH 조건은 당업자에 의해 쉽게 결정할 수 있다. 예를 들면, 당화는 최대 200시간 지속할 수 있지만, 바람직하게는 약 24 내지 약 48 시간 동안 통상적으로 행한다. 온도는 바람직하게는 약 50℃의 범위 내이다. pH는 바람직하게는 약 3 내지 약 8 범위 내이다. 건조 고체 함량은 바람직하게는 약 5 내지 50 wt% 범위 내이다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 배지에 전처리된 감귤 착즙박 가루를 첨가한 뒤 아스페르길러스 나이거NY 균주를 접종하여 25℃에서 7일간 정치배양 하였다. 배양 후 포자가 형성되면, 소니케이션 후 원심분리 하여 상등액을 취한 뒤 필터를 이용하여 제균처리 하였다. 상기 처리액을 감귤 착즙박과 1 : 1의 부피비로 혼합한 후 45℃에서 48시간 반응시킨 후 생산된 당화액을 멸균처리하여 냉장 보관하였다. 감귤 착즙박 가루에 비스코자임을 및 상기 당화액인 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 각각 처리하였을 때, 아스페르길러스 나이거NY 효소액의 67%가 시간당 환원당으로 전환되었으며(도 4 참조), 비스코자임 대비 10배 이상의 환원당 전환 활성을 나타냄을 확인하였다(도 5 참조). 또한, 아스페르길러스 나이거NY 효소액의 기질 당 시간 별 환원당량이 팩틴, 크실란, 셀룰로오스 순으로 분해력이 강함을 확인하였다(도 6 참조). 따라서, 본 발명의 아스페르길러스 나이거NY 효소액은 박테리아 셀룰로오스 제조의 당화액으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은,
1) 감귤 착즙박을 당화시키는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 당화된 감귤 착즙박에 종균을 배양하는 단계를 포함하는 감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스 제조 방법을 제공한다.
상기 단계 1)의 당화는 수탁번호 KCTC18373P 아스페르길러스 나이거NY 균주를 이용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 단계 2)의 종균은 박테리아 셀룰로오스 생성능을 가진 미생물로 당업계에 공지된 임의의 미생물이 모두 사용될 수 있다. 그러한 미생물로서 아세토박터 속 미생물(Acetobacter sp., 초산균), 글루콘아세토박터 속 미생물(Gluconacetobacter sp.)아그로박테리움 속 미생물(Agrobacterium sp.), 리조비움 속 미생물(Rhizobium sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 사르시나 속 미생물(Sarcina sp.) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 하기 실시예에서 사용된 글루콘아세토박터 속 GS7 균주를 사용하는 경우이다.
또한, 상기 단계 2)의 배양 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배양 배지는 질소원으로 효모 추출물(yeast extract), 소이톤(soytone), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 맥아 추출물(malt extract), 콩 분말, 콩 비지 분말, 청국장 분말, 된장 분말 등의 천연 질소원, 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염, 질산염, 유레아 등의 유·무기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원도 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 배지에 바람직하게는 0.1%(w/w) 내지 8.0%(w/w)의 범위로 포함될 수 있다. 천연 질소원을 사용할 경우 타 미생물에 의한 원치 않는 발효를 방지하기 위해서 이를 멸균하여 사용할 수 있다. 멸균은 고온·고압 멸균법, 자외선 조사 등 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
또한, 상기 단계 2)의 배양 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배양 배지는 보조 탄소원을 추가적으로 포함하여 제조될 수 있다. 보조 탄소원은 박테리아 셀룰로오스 생성능을 가진 미생물의 생육이나 미생물에 의한 박테리아 셀룰로오스의 생산에 있어 필수적인 성분은 아니나 박테리아 셀룰로오스 생성능을 가진 미생물의 생육 및/또는 그러한 미생물에 의한 박테리아 셀룰로오스의 생산을 촉진시키기 위하여 첨가되는 성분으로 예컨대 젖산, 구연산, 숙신산, 시트르산, 아세트산, 에탄올, 포름산, 말산, 피부르산 등이 사용될 수 있으며, 나아가 이들 성분 중 하나 이상을 본래 포함하고 있거나 이들 성분 중 하나 이상의 성분이 인위적으로 첨가된 감즙(Kim SY, et al., Appl Biochem Biotechnol., 129-132, 705-15, 2006),감식초(Kim SY, et al., Appl Biochem Biotechnol., 129-132, 705-15, 2006), 사과즙(Lee OS, et al., J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr., 31(4), 572-577, 2002), 포도즙(Son CJ, et al., J. Appl. Microbiol. Biotechnol., 12(5), 722-728, 2002), 맥주 폐액(Park JK, et al., Kor Chem Eng Res., 44(1), 52-57, 2006), 코코넛 부산물(Jonas R, et al., Polym Degrad Stab., 59, 101-106, 1998), 파인애플 과즙(일본 특허출원 제1999-299034호 참조), 감귤 착즙박 등을 들 수 있다.
또한, 상기 단계 2)의 배양 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배양 배지는 무기염류와 미량원소를 추가로 포함하여 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 무기염류로서는 인산수소나트륨, 황산마그네슘, 염화철, 칼슘염, 망간염, 코발트염, 몰리브텐산염, 킬레이트금속염 등을 들 수 있으며, 미량원로소로서는 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 아황산 펄프 폐액 등을 들 수 있다. 이들 무기염류와 미량원소는 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 0.001 내지 3.0%(w/w)의 범위로 배지에 포함될 수 있다.
또한, 상기 단계 2)의 배양 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 접종될 박테리아 셀룰로오스 생성능을 가진 미생물이 내산성 세균인 점을 고려할 때 그 pH는 3 내지 7 범위인 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 2)의 배양 단계에서 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지가 제조된 후에는 멸균 단계가 추가로 포함될 수 있다. 이러한 멸균 단계는 타 미생물의 오염을 방지하기 위한 것이며, 결과적으로 박테리아 셀룰로오스 생산 수율을 높이기 위한 것이다. 멸균 방법은 고온·고압 멸균법, 자외선 조사 등 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.
또한, 상기 단계 2)의 배양은 10 내지 40℃에서 배양하는 것이 바람직하고, 15 내지 35℃에서 배양하는 것이 더욱 바람직하며, 20 내지 35℃에서 배양하는 것이 가장 바람직하다. 10℃ 미만의 온도에서 배양하는 경우 글루콘아세토박터 속 GS7 균주가 충분히 성장할 수 없고, 40℃ 초과의 온도에서 배양하는 경우 상기 균주 생육에 저해가 생길 문제점이 있다.
또한, 본 발명에서 얻어진 박테리아 셀룰로오스는 일반 박테리아 셀룰로오스와 마찬가지로 화상 치료, 창상 치료, 궤양 치료, 염증 치료, 항생제, 마취제 등의 약물 전달 용도 등의 의약품, 보습 용도 등의 화장품, 식감 향상 용도 등의 식품, 충진제 용도 등의 제지 등의 제품 소재로 활용될 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지에 글루콘아세토박터 속 GS7을 접종하고 28℃에서 3일간 전배양하였다. 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 원심분리하여 상등액을 취한 후 이를 첨가하여 글루코오스를 제외한 박테리아 셀룰로오스 생산용 액체 배지를 제조하고, 전배양한 글루콘아세토박터 속 GS7을 접종한 후 28℃에서 10일 정치배양 하였다. 그 결과, 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 사용하였을 경우 셀룰로오스 생성량이 2.6 g으로 효소 당화하지 않은 감귤 착즙박에 비해 85% 증가하였으며, 10배 희석한 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 사용한 경우 1.8 g으로 28%의 생성량이 증가함을 확인하였다(표 4 및 도 7 참조). 따라서, 본 발명의 박테리아 셀룰로오스 제조 방법은 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 이용하여 높은 수율의 셀룰로오스 생성량을 가짐을 확인함으로써 박테리아 셀룰로오스 제조 방법으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 감귤 착즙박의 전처리
자담의 감귤쥬스 제조시 발생하는 감귤 착즙박을 온수로 세척하여 15분 동안 교반 후 무명천을 통과시켜 즙을 짜내고 세척하는 과정을 20회 반복하여 당 및 용해성 성분을 제거하였다. 마지막 세척 과정 이후 물기가 없도록 완전히 탈수시킨 후 50℃에서 48시간 건조시켰다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 건조된 감귤 착즙박은 연회색을 띄는 단단한 덩어리를 형성하는데, 이를 분쇄하여 가루형태로 처리하여 사용하였다(도 1).
< 실시예 2> 균주의 분리 및 동정
감귤 착즙박을 분해하는 균주의 집적을 위하여 다음과 같은 과정을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 1과 같은 조성의 배지와 <실시예 1>에서 전처리된 감귤 착즙박 가루를 1 : 1 비율로 혼합하여 환 형태로 성형 후 121℃에서 15분간 멸균하였다. 상기 환을 인근 대나무 숲에서 채취한 토양 시료와 혼합한 뒤 25℃, 습도 80% 조건에서 약 5일간 배양 후 형성된 검은색 곰팡이 포자를 취한 다음 PDA배지에 분리배양 하여 광학현미경으로 관찰하였다(도 3).
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 상기 분리된 단일 곰팡이 균주의 18S rRNA의 전체 염기서열을 결정하여 %유사도와 계통수를 분석하여, 전형적인 분생포자를 갖는 아스페르길러스 나이거(Aspergillus niger)형의 곰팡이 균주와 100% 유사도를 나타내는 것을 확인하였고(도 2), 상기 균주를 아스페르길러스 나이거NY(Aspergillus nigerNY)라고 명명하였다.
조성 양(g/ℓ)
NaNO3 6
KCl 0.52
MgSO4·7H2O 0.52
KH2PO4 1.52
FeSO4·7H2O 0.005
ZnSO4·7H2O 0.005
< 실시예 3> 감귤 착즙박 당화를 이용한 아스페르길러스 나이거NY 효소액 제조
본 발명의 감귤 착즙박 당화를 이용하여 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 제조하기 위해 다음과 같은 과정을 수행하였다.
구체적으로, 상기 표 1의 배지 9 ㎖에 <실시예 1>에서 제조된 감귤 착즙박 가루 3 g을 첨가한 후 <실시예 2>의 아스페르길러스 나이거NY 균주를 접종하여 25℃에서 7일간 정치배양 하였다. 배양 후 검게 포자가 형성되면, 3차 증류수 30 ㎖을 첨가하여 소니케이터(wiseclean, Daihan scientific, Korea)를 이용 소니케이션 후, 원심분리 하여 상등액을 필터(25CS045AS, Advantec, TOYORoshi kaisha Ltd., Japan)로 제균처리하였다. 상기 처리액을 감귤 착즙박과 1 : 1의 부피비로 혼합한 후 45℃에서 48시간 동안 반응시킨 후 생산된 당화액을 121℃에서 15분간 멸균처리하여 냉장 보관하였다.
< 실험예 1> 아스페르길러스 나이거NY 효소액의 활성도 평가
상기 <실시예 3>에서 제조된 아스페르길러스 나이거NY 효소액의 활성도를 평가하기 위하여 감귤 착즙박 가루에 비스코자임(Viscozyme, NOVO Denmark) 및 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 처리하여 환원당량을 비교하였다.
구체적으로, 기질인 감귤 착즙박 가루에 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 처리후 시간대 별로 DNS법을 이용하여 측정하였으며, 또한, 감귤 착즙박 가루 5 ㎎에 10, 100, 1000, 10000 및 100000배로 희석한 비스코자임 및 상기 <실시예 3>에서 제조된 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 각각 1 ㎖ 처리한 후 45℃에서 48시간 동안 반응시킨 후 DNS법을 이용하여 환원당량을 측정하였다. 환원당량을 측정하는 방법으로, 하기 표 2의 조성을 순서대로 녹여 DNS 시약을 제조하고, 당을 정량하고자 하는 용액과 중탕하면서 반응시켜 흡광측정기(spectrophotometer)에서 550nm에서 파장을 측정하여 포도당용액의 표준곡선과 비교하여 환원당의 함량을 측정하였다.
조성 양(g/ℓ)
디니트로살리실산(Dinitrosalicylic acid) 6.3
수산화나트륨(NaOH) 21.4
로셸(Rochelle)염 182
페놀(Phenol) 5.375 ㎖
차아황산나트륨(Na2S2O4) 5.0
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 아스페르길러스 나이거NY 효소액의 시간별 생성 환원당량에서 67%의 감귤 착즙박 가루가 환원당으로 전환되었다(도 4). 또한, 도 5에 나타난 바와 같이 본 발명의 아스페르길러스 나이거NY 효소액은 시판 비스코자임 대비 10배 이상의 환원당 전환 활성을 나타내었다(도 5).
< 실험예 2> 아스페르길러스 나이거NY 효소액의 분해능 평가
상기 <실시예 3>에서 제조된 아스페르길러스 나이거NY 효소액의 기질을 확인하기 위하여, 셀룰로오스(CMC), 크실란(Xylan) 및 팩틴(Pectin)에 상기 효소액을 처리하여 반응 시간 별 환원당량을 측정하였다.
구체적으로, 감귤 착즙박 가루 10 ㎎에 상기 <실시예 3>에서 제조된 아스페르길러스 나이거NY 효소액 1 ㎖을 처리한 후 45℃에서 반응시키며 12시간 마다 상기 <실험예 1>에 기재된 바와 같이 DNS법을 이용하여 환원당량을 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 아스페르길러스 나이거NY 효소액은 팩틴 분해력이 강하고, 다음으로 크실란, 셀룰로오스 순으로 분해력이 가장 약하였다(도 6).
< 실험예 3> 박테리아 셀룰로오스 생산
감귤 착즙박 당화를 통해 박테리아 셀룰로오스(bacterial cellulose)를 생산하기 위해 다음과 같은 과정을 수행하였다.
구체적으로, 하기 표 3의 조성으로 제조된 배지 20 ㎖에 균주 글루콘아세토박터 속 GS7 3%를 접종하고 28℃에서 3일간 전배양하였다. 그리고나서, 상기 <실시예 3>에서 제조된 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 4000 rpm에서 1000초 원심분리 한 후, 상등액 10 ㎖을 취하고, 나머지 영양원으로 표 3의 글루코오스를 제외한 배지 10 ㎖을 첨가하여 액체배지를 제조하였다. 상기 액체배지에 전배양한 글루콘아세토박터 속 GS7을 접종한 후 28℃에서 10일 정치배양 하였다. 대조군으로는 아스페르길러스 나이거NY 효소액 대신 증류수를 첨가한 것(C), 감귤 착즙박을 황산 처리하여 고온고압 처리한 것(AT) 및 실온에서 배양한 것(RT)으로 3가지 대조군을 설정하였다. 배양 후 상층의 셀룰로오스 막을 회수하여 흐르는 중류수로 3차례 세척 후 1N 수산화나트륨(NaOH)에 24시간 담가둔 후 다시 증류수로 3차례 세척하여 겉면의 물기를 제거한 후 셀룰로오스의 중량 및 pH를 측정하였다.
조성 양
글루코오스(glucose) 20%
이스트(yeast extract) 5 g
펩톤(peptone) 5 g
Na2HPO4(무수) 2.7 g
구연산 일수화물(citric acid) 1.15 g
증류수 1000 ㎖
pH 6.0 (HCl 또는 NaOH)
그 결과, 하기 표 4 및 도 7에 나타난 바와 같이 pH 4 내지 5의 범위에서 셀롤로오스 막이 형성되며 아스페르길러스 나이거NY 효소액 및 아스페르길러스 나이거NY 효소 희석액으로 당화시킨 액상에서 셀룰로오스 생산량이 각각 2.6 및 1.8 g인 것과 비교하여 효소 당화하지 않은 감귤 착즙박의 경우 1.4 g으로 확인되었다. 이는, 아스페르길러스 나이거NY 효소액을 사용하였을 경우 셀룰로오스 생성량이 85% 증가하였고, 이를 10배 희석한 효소를 사용하였을 경우 약 28% 셀룰로오스 생성량이 증가하였음을 나타낸다(표 4 및 도 7).
실온배양
(RT)		 황산, 고온고압 처리감귤 착즙박(AT) 아스페르길러스 나이거NY 효소액 아스페르길러스 나이거NY 효소 희석액 배지만 처리한 군 증류수
처리군(C)
박테리아 셀룰로오스 막의 무게(g) 1.8 1 2.60 1.80 1.04 1.40
pH-초기 5.16 5.06 5.01 5.10 6.00 4.91
pH-배양후 4.65 4.11 4.67 4.53 3 4.44
따라서, 본 발명의 탄소원으로 감귤 착즙박 당화액을 사용하여 생산된 박테리아 셀룰로오스는 감귤 산업체로부터 산업폐기물의 처리비용을 줄이며, 박테리아 셀룰로오스 생산에 소요되는 원가를 절감할 수 있어 박테리아 셀룰로오스의 상업적 생산이 가능하게 하여, 본 발명의 박테리아 셀룰로오스 제조 방법은 셀룰로오스 생산의 최적화 조건을 확립하여 생산 수율을 향상시킬 수 있다.

Claims (10)

1) 수탁번호 KCTC18373P으로 기탁된 아스페르길러스 나이거NY(Aspergillus niger NY) 균주를 배양하여 배양액을 얻는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 얻은 배양액을 감귤 착즙박과 혼합, 배양하여 감귤 착즙박을 당화시켜 당화효소액을 얻는 단계; 및
3) 상기 단계 2)에서 얻은 당화효소액에 박테리아 셀룰로오스 생성능을 가진 미생물 배양액을 혼합, 배양하는 것을 특징으로 하는 박테리아 셀룰로오스의 대량 생산 방법.
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 단계 1)의 배양액은 탄소원으로 감귤 착즙박을 포함하는 것을 특징으로 하는 박테리아 셀룰로오스의 대량 생산 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 2)의 혼합은 배양액 및 감귤 착즙박을 3 : 1 내지 1 : 3의 부피비로 혼합한 것을 특징으로 하는 박테리아 셀룰로오스의 대량 생산 방법.
삭제
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제1항에 있어서,
상기 단계 3)의 배양은 20 내지 35 ℃에서 배양하는 것을 특징으로 하는 박테리아 셀룰로오스의 대량 생산 방법.
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