KR101577337B1 - 글루콘아세토박터 속 균주를 이용하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법 - Google Patents

글루콘아세토박터 속 균주를 이용하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101577337B1
KR101577337B1 KR1020130163101A KR20130163101A KR101577337B1 KR 101577337 B1 KR101577337 B1 KR 101577337B1 KR 1020130163101 A KR1020130163101 A KR 1020130163101A KR 20130163101 A KR20130163101 A KR 20130163101A KR 101577337 B1 KR101577337 B1 KR 101577337B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
microbial cellulose
gluconacetobacter
weight
kccm
Prior art date
Application number
KR1020130163101A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150075234A (ko
Inventor
송재광
오준영
최지은
나혜영
Original Assignee
한국화학연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국화학연구원 filed Critical 한국화학연구원
Priority to KR1020130163101A priority Critical patent/KR101577337B1/ko
Publication of KR20150075234A publication Critical patent/KR20150075234A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101577337B1 publication Critical patent/KR101577337B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/02—Separating microorganisms from their culture media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/60—Buffer, e.g. pH regulation, osmotic pressure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2523/00—Culture process characterised by temperature

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 글루콘아세토박터 속 균주를 최적화된 영양배지에서 배양하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따르면 기존의 방법과 비교하여 월등히 우수한 수준으로 순수한 미생물 셀룰로오스를 효과적으로 대량 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 바이오디젤 생산 시 부산물로 생성되는 폐글리세롤을 탄소 영양원으로 활용할 수 있으므로 고부가가치 사업으로 유용하다.

Description

글루콘아세토박터 속 균주를 이용하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법{METHOD FOR MASS PRODUCTION OF MICROORGANISM CELLULOSE USING GLUCONACETOBACTER SPECIES STRAIN}
본 발명은 최적화된 영양배지에서 글루콘아세토박터 속 균주를 배양하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법에 관한 것이다.
셀룰로오스는 자연계에 가장 풍부한 생체물질자원으로 특히, 초산균이 생성하는 셀룰로오스는 식품의 첨가제뿐만 아니라, 고부가가치의 산업용 신소재로 많은 주목을 받고 있다. 특히, 박테리아가 생성하는 셀룰로오스는 식물체가 생성하는 셀룰로오스와는 상이하게 달라 헤미셀룰로오스나 리그닌과 같은 것들이 함유되지 않은 고순도의 셀룰로오스이며, 물리학적인 성질이 매우 우수하여 실용화 소재 개발에 많은 연구가 진행되고 있다.
이러한 셀룰로오스를 생산하는 균주로는 글루콘아세토박터 속(Gluconacetobacter sp.), 아세토박터 속(Acetobacter sp.), 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.), 리조비움 속(Rhizobium sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 및 사르시나 속(Sarcina sp.) 등이 있다.
한편, 글리세롤은 석유화학, 페인트, 담배, 생활용품 및 화장품 분야에 원료 자체로서 사용되어 왔다. 그러나, 원유 값의 폭등으로 인한 바이오디젤의 공급이 급증하고 이에 따라 바이오디젤 생산 시 전이 에스테르화 공정에서 부산물로 생성되는 글리세롤의 공급 과잉이 유발되어 폐기물로서 활용방법이 모색되어야 하는 실정이다. 따라서 바이오디젤 공정부산물인 글리세롤의 새로운 용도 마련을 위한 많은 연구가 진행 중에 있다.
종래의 셀룰로오스 생산에서 사용되는 탄소원은 포도당이 가장 대표적이고(Masaoka S, et al., J. Fermen. Bioeng., 75, 18-22, 1993), 다른 소재로 천연재료 중 감즙 및 감식초, 사과즙, 포도즙, 맥주폐액 및 코코넛 부산물 등이 활용되었으나 글리세롤로부터 셀룰로오스 생산에 관한 보고는 미비하며, 만일 글리세롤로부터 고부가가치의 셀룰로오스를 대량으로 생산하는 방법이 확립되면 바이오디젤 산업부산물인 폐글리세롤을 고-부가가치화할 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 목적은 글루콘아세토박터 속 균주를 최적화된 영양배지에서 배양하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은
1) 총 중량을 기준으로 효모 추출물 0.5 내지 1중량%, 펩톤 0.5 내지 1중량%, 아세트산 1 내지 2 ml/L, 프럭토스 1 내지 6중량% 및 옥수수 침지액(Corn Steep Liquor, CSL) 1 내지 6중량%를 포함하고 초기 pH가 4 내지 6인 영양배지에 글루콘아세토박터 속 균주를 접종하여 28 내지 30℃에서 150 내지 250 rpm으로 진탕 배양하는 단계; 및
2) 상기에서 수득한 배양물로부터 미생물 셀룰로오스를 회수하는 단계를 포함하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은
1) 총 중량을 기준으로 효모 추출물 0.5 내지 1중량%, 펩톤 0.5 내지 1중량%, 아세트산 1 내지 2 ml/L, 바이오디젤 공정부산물의 수용성 추출액 10 내지 30중량% 및 CSL 1 내지 6중량%를 포함하고 초기 pH가 4 내지 6인 영양배지에 글루콘아세토박터 속 균주를 접종하여 28 내지 30℃에서 150 내지 250 rpm으로 진탕 배양하는 단계; 및
2) 상기에서 수득한 배양물로부터 미생물 셀룰로오스를 회수하는 단계를 포함하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법을 이용하면, 글루콘아세토박터 속 균주를 이용하여 기존의 방법과 비교하여 월등히 우수한 수준으로 셀룰로오스를 생산할 수 있어 미생물 셀룰로오스의 대량 생산에 효과적이다.
도 1은 배양 시간에 따른 미생물 셀룰로오스의 생산량을 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 배양 시간에 따라 미생물 셀룰로오스의 생산량이 증가하는 모습을 나타낸 것이다.
도 3 및 4는 각각 글루콘아세토박터 속 균주로부터 생산한 미생물 셀룰로오스의 주사전자현미경 및 투과전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
본 발명은, 1) 총 중량을 기준으로 효모 추출물 0.5 내지 1중량%, 펩톤 0.5 내지 1중량%, 아세트산 1 내지 2 ml/L, 프럭토스 1 내지 6중량% 및 옥수수 침지액(Corn Steep Liquor, CSL) 1 내지 6중량%를 포함하고 초기 pH가 4 내지 6인 영양배지에 글루콘아세토박터 속 균주를 접종하여 28 내지 30℃에서 150 내지 250 rpm으로 진탕 배양하는 단계; 및 2) 상기에서 수득한 배양물로부터 미생물 셀룰로오스를 회수하는 단계를 포함하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 배양은 총 중량을 기준으로 효모 추출물 0.5중량%, 펩톤 0.5중량%, 아세트산 1.5 ml/L, 프럭토스 5중량% 및 CSL 5중량%를 포함하고 초기 pH가 4.8인 영양배지에 글루콘아세토박터 속 균주를 접종하여 30℃에서 200rpm으로 진탕 배양하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 사용가능한 글루콘아세토박터 속 균주는 기존의 공지된 균주, 예를 들면 하기 표 1에 기재된 균주일 수 있으며, 바람직하게는, 글루콘아세토박터 자일리누스 아종 자일리누스(KCCM 40198 또는 KCCM 41431)일 수 있다.
균주명 기탁번호
글루콘아세토박터 리케파시엔스 (Gluconacetobacter liquefaciens) KCTC 2859
글루콘아세토박터 프럭투스(Gluconacetobacter fructus) KCTC 22717
글루콘아세토박터 자일리누스 아종 자일리누스
(Gluconacetobacter xylinus subsp. xylinus)		 KCCM 40198
글루콘아세토박터 자일리누스 아종 자일리누스 KCCM 41431
글루콘아세토박터 자일리누스 아종 자일리누스 KCTC 40216
글루콘아세토박터 한세니이(Gluconacetobacter hansenii) KCCM 40230
또한, 본 발명에서는 상기 글루콘아세토박터 속 공시균주를 자외선 돌연변이(UV mutagenesis) 생성방법으로 제조한 돌연변이 균주를 이용할 수도 있다(문헌[Kevin LIN, et al., Journal of Experimental Microbiology and Immunology, 1, 32-46, 2001] 참고). 예를 들어, 상기 돌연변이 균주는 글루콘아세토박터 공시 균주를 암실 조건에서 자외선 램프를 이용하여 250 내지 260 nm, 예를 들어 253.7nm 파장을 1 내지 5분 동안 조사하여 돌연변이시켜 제조한 균주일 수 있다.
본 발명의 단계 2)는 진탕 배양물로부터 미생물 셀룰로오스를 회수하는 단계로서 통상의 공지된 방법에 의해서 수행될 수 있다. 예를 들어, 단계 1)에서 수득한 진탕 배양물을 3,000 내지 5,000 rpm에서 10 내지 20분 동안 원심 분리하여 상등액을 제거한 후, NaOH 용액을 첨가하고 100℃에서 중탕하여 미생물 셀룰로오스에 섞여있는 균주를 용해시킨다. 이어, 상기에서 수득한 용액을 3,000 내지 5,000 rpm에서 10 내지 20분 동안 원심분리하여 NaOH 용액을 제거한 후, 산 용액을 가하여 세척하고, 다시 3,000 내지 5,000 rpm에서 10 내지 20분 동안 원심분리하여 산 용액을 제거한 후 충분한 양의 증류수로 세척하여 중화한 후 건조시킴으로써, 미생물 셀룰로오스를 회수할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 단계 1)에서 수득한 진탕 배양물을 4,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 제거한 후, 0.3N NaOH 용액을 첨가하여 100℃에서 10분간 중탕하여 미생물 셀룰로오스에 섞여 있는 균주를 녹였다. 이어, 상기에서 수득한 용액을 4,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 NaOH 용액을 제거한 후, 5% 초산 용액을 가하여 세척하고, 다시 4,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 초산 용액을 제거한 후 충분한 양의 증류수로 세척하여 중화한 후에 65℃ 오븐에서 무게 변화가 없을 때까지 건조시킴으로써, 건조물 형태의 미생물 셀룰로오스를 회수할 수 있다.
또한, 본 발명은 탄소 영양원으로서 바이오디젤 산업공정의 부산물로부터 추출한 수용성 추출액을 이용하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 1) 총 중량을 기준으로 효모 추출물 0.5 내지 1중량%, 펩톤 0.5 내지 1중량%, 아세트산 1 내지 2 ml/L, 바이오디젤 공정부산물의 수용성 추출액 10 내지 30중량% 및 CSL 1 내지 6중량%를 포함하고 초기 pH가 4 내지 6인 영양배지에 글루콘아세토박터 속 균주를 접종하여 28 내지 30℃에서 150 내지 250 rpm으로 진탕 배양하는 단계; 및 2) 상기에서 수득한 배양물로부터 미생물 셀룰로오스를 회수하는 단계를 포함하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 상기 배양은 총 중량을 기준으로 효모 추출물 0.5중량%, 펩톤 0.5중량%, 아세트산 1.5 ml/L, 바이오디젤 공정부산물의 수용성 추출액 10 내지 30중량% 및 CSL 5중량%를 포함하고 초기 pH가 4.8인 영양배지에서 글루콘아세토박터 속 균주를 접종하여 30℃에서 200rpm으로 진탕 배양하는 것을 특징으로 한다.
상기 방법에서 글루콘아세토박터 속 균주는 상기 표 1에 기재된 균주일 수 있으며, 바람직하게는, 글루콘아세토박터 자일리누스 아종 자일리누스(KCCM 40198 또는 KCCM 41431)일 수 있다.
또한, 글루콘아세토박터 속 공시 균주를 자외선 돌연변이 생성방법, 예를 들어 250 내지 260nm, 예를 들어 253.7nm 파장의 자외선 램프를 이용하여 암실 조건에서 제조한 돌연변이 균주일 수 있다.
상기 바이오디젤 공정부산물의 수용성 추출액의 원료로 사용되는 바이오디젤 산업공정의 부산물은 다량의 글리세롤을 함유하고 있어 미생물 배양을 위한 좋은 탄소 영양분으로 활용될 수 있다. 그러나, 상기 부산물은 바이오디젤 제조공정의 주원료인 유분을 많이 포함하고 있을 뿐 아니라, 높은 KOH 농도로 인하여 강한 염기성을 나타내기 때문에 미생물 배양을 위한 영양배지에 바로 사용하기에는 무리가 있다.
따라서, 상기 바이오디젤 공정부산물은 증류수와 혼합한 후 추출, 여과 및 분리하는 전처리 과정을 거쳐 바이오디젤 공정부산물의 수용성 추출액의 형태로 제조한 후 본 발명에 따른 영양배지의 탄소원으로 사용할 수 있다.
상기 전처리 과정은 i) 바이오디젤 공정부산물 및 증류수를 1:1 내지 1:5, 바람직하게는 1:3의 중량비로 혼합한 후 2 내지 3시간 동안 교반하여 글리세롤을 수용액 상으로 추출하는 단계; ii) 상기에서 수득한 추출액에 염산을 처리하여 pH를 4 이하로 조절하여 유분과 수용액 층을 분리하는 단계; 및 iii) 상기에서 수득한 수용액 층을 원심분리한 후, 여과기(예를 들면 0.2μm 포어 사이즈의 필터)로 여과하여 순수한 글리세롤 수용액 추출액을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
진탕 배양물로부터 미생물 셀룰로오스를 회수하는 단계는 앞서 설명한 바와 동일하다.
본 발명의 방법에 따르면, 기존에 미생물 셀룰로오스의 생산에 이용되어 온 영양배지, 예를 들면 mYPD 배지(modified YPD medium), 또는 HS 배지(Hestrin and Schramm medium)에서 미생물 셀룰로오스를 생산하는 경우와 비교하여 약 15 내지 33배나 우수한 미생물 셀룰로오스 생산성을 나타내므로, 본 발명의 방법은 미생물 셀룰로오스의 대량 생산에 있어 매우 유용하다(본원 명세서 표 11 참고).
[실시예]
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 미생물 셀룰로오스 생산용 영양배지 최적화를 위한 시작배지 및 CSL 첨가 유무에 따른 미생물 셀룰로오스 생산량 비교
하기 표 2와 같은 조성의 영양배지를 미생물 셀룰로오스 생산용 영양배지 최적화를 위한 시작배지로 사용하였다.
조성 양
글루코스(Glucose)
효모 추출물(Yeast extract)
펩톤(Peptone)
아세트산(Acetic acid)
pH		 50 g/L
5 g/L
5 g/L
1.5 ml/L
4.5
표 2에 개시된 조성을 포함하는 영양배지에 배지 총 중량을 기준으로 CSL 2%(w/v)를 넣은 배지 50 ml와, CSL 무첨가 배지 50ml 각각을 250 ml 삼각 플라스크에 넣고 121℃에서 15분간 멸균하였다. 멸균된 배지에 글루콘아세토박터 균주(KCCM 40198)를 OD600 = 0.2의 양으로 접종하고 30℃ 항온 배양기에서 10일간 정치 배양하였다. 배양이 끝난 후 다음과 같은 과정을 통해 균주를 제거하고 순수한 미생물 셀룰로오스를 획득하였다.
먼저, 상기 글루콘아세토박터 균주로부터 생산된 미생물 셀룰로오스가 포함된 정치 배양액을 4,000 rpm에서 20분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 0.3N NaOH 용액을 넣고 100℃에서 10분간 중탕하여 미생물 셀룰로오스에 섞여 있는 균주를 NaOH 용액에 녹였다. 4,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 NaOH 용액을 제거한 후 5% 초산 용액을 넣고 세척하였다. 4,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 초산용액을 제거한 후 충분한 양의 증류수로 세척하여 중화시킨 후 65℃ 오븐에서 무게 변화가 없을 때까지 건조하였다.
이렇게 생산된 미생물 셀룰로오스의 생산량을 하기 표 3에 나타내었다.
미생물 셀룰로오스의 건조중량 (g/L)
균주 CSL 무첨가 배지 CSL 2%(w/v) 첨가 배지
G. xylinus 40198 0.1 2.03
표 3에 표기한 바와 같이 글루콘아세토박터 균주에서 CSL이 효과적으로 미생물 셀룰로오스의 생산량을 증가시키는 것을 알 수 있었다.
실시예 2. CSL의 농도에 따른 미생물 셀룰로오스 생산량 비교
영양배지에 첨가하는 CSL의 농도에 따른 글루콘아세토박터 균주의 미생물 셀룰로오스 생산량을 비교하기 위하여, 다양한 농도의 CSL을 상기 표 2에 따른 시작배지에 첨가하여 배양하였다.
구체적으로, 상기 표 2의 시작배지에 CSL의 농도를 1%(w/v) 내지 6%(w/v)로 첨가한 영양배지 50 ml 각각을 250 ml 삼각 플라스크에 넣고 121℃에서 15분간 멸균하였다. 상기 멸균 배지에 글루콘아세토박터 균주(KCCM 40198)를 OD600 = 0.2의 양으로 접종하고 30℃ 항온 배양기에서 10일간 정치 배양하였다. 배양이 끝난 후 상기 실시예 1에서 서술한 방식으로 순수한 미생물 셀룰로오스를 획득하여 건조 중량을 측정하였고 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
CSL 농도 (w/v%) 글루콘아세토박터 균주에서 생산된
미생물 셀룰로오스의 건조중량 (g/L)
1 2.26
2 2.258
3 3.164
4 4.84
5 7.35
6 3.324
표 4에 보는 같이 글루콘아세토박터 균주는 영양배지에 첨가하는 CSL의 농도가 높을수록 미생물 셀룰로오스의 생산량이 증가하였다. 특히 CSL을 5%(w/v) 첨가하였을 때 생산량이 가장 높았으며, 5%(w/v)를 초과하면 생산량이 감소하였다. 따라서, 이후 실시예에서는 5%(w/v)의 CSL을 첨가한 영양배지를 사용하여 실험을 실시하였다.
실시예 3. CSL이 첨가된 영양배지에서 배양방식에 따른 미생물 셀룰로오스 생산량 비교
글루콘아세토박터속 균주는 배양 형태에 따라 균주의 미생물 셀룰로오스 생성능이 저해되는 변이(Cel- mutation) 정도가 다르기 때문에, 정치배양과 진탕배양의 배양형태에 따른 미생물 셀룰로오스 생산량을 비교하였다.
상기 실시예 2에서 제조한 CSL을 5%(w/v) 농도로 포함하는 영양배지 50 ml을 250 ml 삼각 플라스크에 넣고 121℃에서 15분간 멸균하였다. 상기 멸균 배지에 글루콘아세토박터 균주(KCCM 40198)를 OD600 = 0.2의 양으로 접종하고 30℃ 항온 배양기에서 10일간 정치 및 진탕배양을 실시하였다. 정치배양은 30℃ 항온 배양기에서 실시하였으며 진탕배양은 30℃ 항온 배양기에서 200 rpm의 속도로 회전시키면서 배양하였다. 이후, 상기와 동일한 방식으로 순수한 미생물 셀룰로오스를 획득하여 건조중량을 측정하였고 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
배양 방식 글루콘아세토박터 균주에서 생산된
미생물 셀룰로오스의 건조중량 (g/L)
정치배양 3.95
진탕배양 10.75
표 5에서 보는 바와 같이, 글루콘아세토박터 균주는 정치배양보다 진탕배양 방식에서 많은 양의 미생물 셀룰로오스를 생산하는 것을 알 수 있었다. 따라서, 이후 실시예에서는 진탕배양 방식을 사용하여 실험을 실시하였다.
실시예 4. CSL이 첨가된 영양배지에서 미생물 셀룰로오스 생산에 적합한 탄소원의 탐색
글루콘아세토박터속 균주는 그의 대사회로(metabolic pathway)가 이미 밝혀져 있으며, 포도당 외에 다른 여러 가지 탄소원을 활용하여 미생물 셀룰로오스를 생산하는 능력을 가지고 있다는 것이 알려져 있다. 이에, 다양한 탄소원을 이용하여 글루콘아세토박터 균주로부터 생산되는 셀룰로오스의 양을 비교하였다.
표 2의 시작 배지에서 글루코스를 제외하고, 상기 실시예 3에서 서술한 바와 같이 CSL을 5%(w/v) 농도로 첨가한 후, 하기 표 6에 기재된 다양한 탄소원을 배지 총 중량을 기준으로 5%(w/v) 농도로 넣은 영양배지 50 ml을 각각 250ml 삼각 플라스크에 넣고 121℃에서 15분간 멸균하였다. 이어, 상기 멸균 배지에 글루콘아세토박터 균주(KCCM 40198)를 OD600 = 0.2의 양으로 접종한 후 30℃ 항온 배양기에서 200rpm의 속도로 회전시키며 7일간 진탕배양을 실시하였다. 이후, 상기와 동일한 방식으로 순수한 미생물 셀룰로오스를 획득하여 건조중량을 측정하였고 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
탄소원 글루콘아세토박터 균주에서 생산된
미생물 셀룰로오스의 건조중량 (g/L)
글루코스(Glucose) 7.10
수크로스(Sucrose) 11.25
갈락토스(Galactose) 4.96
프럭토스(Fructose) 14.69
만노스(Mannose) 0.23
아라비노스(Arabinose) 0.57
자일로스(Xylose) 0.33
만니톨(Mannitol) 12.29
솔비톨(Sorbitol) 9.35
자일리톨(Xylitol) 3.46
글리세롤(Glycerol) 6.18
표 6에 표기한 바와 같이 글루콘아세토박터 균주는 프럭토스를 탄소원으로 사용하였을 때 미생물 셀룰로오스의 생산량이 가장 많았으며, 만니톨, 수크로스, 솔비톨, 글루코스, 글리세롤 등의 순으로 우수한 생산량을 나타내었다. 따라서 이후 실시예에서는 프럭토스를 탄소원으로 사용하여 실험을 실시하였다.
실시예 5. CSL이 첨가된 영양배지에서 초기 pH에 따른 미생물 셀룰로오스 생산량 비교
글루콘아세토박터 균주로부터 미생물 셀룰로오스를 생산하기 위한 영양배지의 초기 pH에 따른 미생물 셀룰로오스의 생산량을 확인하기 위하여 초기 pH 4~6의 다양한 조건에서 배양을 실시하였다.
표 2의 시작 배지에서 포도당 대신 5%(w/v) CSL 및 5%(w/v) 프럭토스를 첨가하여 제조된 영양배지에 초산과 5N NaOH 용액을 이용하여 초기 pH를 4부터 6까지 다양한 조건으로 조절한 배지 50ml 각각을 250ml 삼각 플라스크에 넣은 후 121℃에서 15분간 멸균하였다. 상기 멸균 배지에 글루콘아세토박터 균주(KCCM 40198)를 OD600 = 0.2의 양으로 접종하고 30℃ 항온 배양기에서 200 rpm의 속도로 회전시키면서 7일간 진탕배양하였다. 이후, 상기와 동일한 방식으로 순수한 미생물 셀룰로오스를 획득하여 건조 중량을 측정하였고 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
초기 pH 글루콘아세토박터 균주에서 생산된
미생물 셀룰로오스의 건조중량 및 최종 pH
건조중량 (g/L) 최종 pH
4.0 8.83 4.68
4.2 11.36 4.72
4.4 11.5 4.86
4.6 11.76 4.99
4.8 12.96 5.10
5.0 11.83 5.14
5.2 11.16 5.23
5.4 9.65 5.28
5.6 8.24 5.28
5.8 10.38 5.33
6 9.84 5.37
표 7에 나타난 바와 같이, 글루콘아세토박터 균주는 초기 pH가 4.0에서 증가할수록 미생물 셀룰로오스의 생산량이 증가하여 초기 pH 4.8의 조건에서 생산량이 가장 좋았다가 이보다 높아질수록 생산량이 감소하는 모습을 보였다. 배양 최종 pH는 pH 4.7 내지 pH 5.3의 구간으로 수렴하는 경향이 나타났다.
실시예 6. 최적화된 영양배지를 이용한 미생물 셀룰로오스 생산
상기 실시예 1 내지 5에서 확인된 내용에 따라, 글루콘아세토박터 균주의 미생물 셀룰로오스 대량 생산에 적합한 최적화 영양 배지의 구성 및 배양조건을 도출하여 하기 표 8에 나타내었다.
조성 양 배양조건
프럭토스
CSL
효모추출물
펩톤
아세트산
pH		 50 g/L
50 g/L
5 g/L
5 g/L
1.5 ml/L
4.8		 30℃ 항온
200rpm 진탕배양
또한, 이와 같이 최적화된 영양배지를 이용하여 글루콘아세토박터 균주의 미생물 셀룰로오스 생산 경향을 알아보기 위한 실험을 진행하였다.
구체적으로, 표 8에 개시된 조성의 배지 50 ml을 250 ml 삼각 플라스크에 넣은 후 121℃에서 15분간 멸균하였다. 상기 멸균된 최적화 영양배지에 글루콘아세토박터 균주를 접종한 후, 표 8에 개시된 배양조건에 따라 9일 동안 진탕배양하였다. 배양이 시작된 후 매 24시간 마다 생성된 순수한 미생물 셀룰로오스를 회수하여 건조중량을 측정하였으며, 배양시간(일)에 따른 미생물 셀룰로오스의 생산량을 도 1에 나타내었다.
또한, 배양 시간에 따라 미생물 셀룰로오스의 생산량이 증가하는 모습을 도 2에 나타내었으며, 이렇게 생산된 미생물 셀룰로오스의 주사전자현미경(Scanning Electron Microscope, SEM) 사진 및 투과전자현미경(Transmission Electron Microscope, TEM) 사진을 각각 도 3 및 4에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 글루콘아세토박터 균주는 배양 7일차까지 꾸준히 미생물 셀룰로오스의 생산량이 증가하다가 7일 이후부터는 생산량이 일정하게 유지되는 것을 알 수 있었다. 따라서 글루콘아세토박터 균주는 표 8에 개시된 바와 같은 최적화된 영양배지 및 배양조건에서 7~8일간의 배양을 통해 순수한 미생물 셀룰로오스를 효과적으로 대량생산함을 알 수 있었다.
실시예 7: 글루콘아세토박터 속 균주들의 미생물 셀룰로오스 생산 비교
본 발명에서 고안한 미생물 셀룰로오스를 대량으로 생산하기 위한 최적화 영 양배지의 조성 및 배양 조건이, 글루콘아세토박터속 다른 균주들에도 적용될 수 있는지 여부를 알아보았다. 실험 균주로는 글루콘아세토박터속 자일리너스 KCCM 40198 및 KCCM 41431 균주, 및 글루콘아세토박터속 균주를 암실 조건에서 253.7nm 파장의 자외선램프를 1분 동안 조사하여 제작한 글루콘아세토박터 돌연변이 균주를 이용하였다.
또한, 미생물 셀룰로오스를 생산함에 있어 본 발명에 따른 배양방법이 기존의 영양배지 및 배양조건에서 배양하는 경우보다 우수한지를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 진행하였다. 최적화 영양배지의 효과를 비교하기 위하여 사용한 기존 문헌의 영양배지는 mYPD 배지(5% 글루코스, 0.5% 효모추출물, 0.5% 펩톤, 1.5ml/L 아세트산, 초기 pH 4.5)와 HS 배지(2% 글루코스, 0.5% 효모추출물, 0.5% 펩톤, 0.27% Na2HPO4, 0.1% 시트르산, 초기 pH 6.0)이다.
상기 배지들 50 ml을 250 ml용 삼각 플라스크에 넣고 121℃에서 15분간 멸균한 후, 각각의 균주들을 접종하였다. mYPD 및 HS배지에 접종한 균주의 경우 30℃ 항온 배양기에서 10일간 정치배양을 하였으며, 최적화 배지에 접종한 균주의 경우 30℃ 항온 배양기에서 200 rpm으로 7일간 진탕배양하였다.
배양이 끝난 후 생산된 미생물 셀룰로오스를 회수하여 건조중량을 측정하였으며 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
미생물 셀룰로오스의 건조중량 (g/L)
영양배지 돌연변이 균주 KCCM 40198 균주 KCCM 41431 균주
mYPD 0.46 0.44 3.94
HS 0.36 0.48 0.88
최적화 배지 11.9 14.36 13.94
상기 표 9의 결과에서 살펴본 바, 본 발명의 최적화 영양배지를 이용하여 다양한 글루콘아세토박터속 균주 및 이의 돌연변이 균주에서도 많은 양의 미생물 셀룰로오스를 생산할 수 있었으며, 기존의 문헌들에서 사용하던 영양배지보다 월등히 높은 수율로 미생물 셀룰로오스를 생산할 수 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예 8: 바이오디젤 산업공정의 부산물을 이용한 미생물 셀룰로오스 생산
본 발명에서는 미생물 셀룰로오스를 생산하기 위해, 최적화된 영양배지의 탄소 영양원으로서 바이오디젤 산업공정의 부산물로부터 추출한 수용성 영양분을 이용하였다. 바이오디젤 공정부산물은 많은 유분을 함유하는 강한 염기성 용액이므로 미생물 배양을 위한 영양배지 성분으로 이용하기 위해 다음과 같은 전처리 공정을 수행하였다.
바이오디젤 공정 부산물에 물을 1:3의 중량비로 혼합한 후 2~3시간 가량 교반하였다. 이어, 염산 용액을 이용하여 pH를 4 이하로 적정함으로써 유분과 수용액의 층이 분리되도록 유도하였다. 8,000 rpm에서 30분 동안 원심분리하여 유분과 수용액의 층을 더 확실하게 분리하여 수용액만을 획득하였다. 이렇게 얻어진 수용액층을 0.2μm 포어 사이즈의 필터를 이용하여 여과시킨 후 수용성 영양분이 함유된, 바이오디젤 공정부산물의 수용성 추출액(글리세롤 115g/L 농도 함유)을 수득하였다.
상기 전처리 과정을 통해 수득한 바이오디젤 공정부산물의 수용성 추출액을 탄소영양원으로 이용하여 글루콘아세토박터 균주(KCCM 40198)를 이용한 미생물 셀룰로오스 생산 실험을 진행하였다. 상기 표 8에 따른 영양배지 조성에서 프럭토스 대신 0 내지 30%(v/v)의 바이오디젤 공정부산물의 수용성 추출액을 첨가하여 미생물 셀룰로오스 생산용 영양배지를 제조하였으며, 여기에 글루콘아세토박터 균주(KCCM 40198)를 접종한 후 30℃ 항온 배양기에서 200rpm으로 7일간 진탕배양하였다. 배양이 끝난 후 생산된 미생물 셀룰로오스의 건조중량을 측정한 결과를 하기 표 10에 나타내었다.
바이오디젤 공정부산물의 수용성 추출액 농도 (v/v%) 미생물 셀룰로오스의 건조중량
(g/L)
0 1.33
10 11.94
20 12.02
30 13.56
표 10에서 보는 바와 같이, 바이오디젤 공정부산물의 수용성 추출액의 농도가 높아질수록 생산량도 증가하는 경향을 보였으며, 최대 13.56 g/L의 생산량을 나타내었다. 이는 탄소원으로 프럭토스를 사용한 경우(11.9 g/L)보다도 더 우수한 수치로서, 바이오디젤 공정부산물의 수용성 추출액이 미생물 셀룰로오스를 생산하기 위한 영양 배지의 탄소 영양원으로서 매우 높은 활용성을 갖고 있다는 것을 알 수 있었다.

Claims (10)

1) 총 중량을 기준으로 효모 추출물 0.5 내지 1중량%, 펩톤 0.5 내지 1중량%, 아세트산 1 내지 2 ml/L, 프럭토스 1 내지 6중량% 및 옥수수침지액(Corn Steep Liquor, CSL) 1 내지 6중량%를 포함하고 초기 pH가 4 내지 6인 영양배지에, 글루콘아세토박터 속(Gluconacetobacter sp.) 균주를 접종하여 28 내지 30℃에서 150 내지 250 rpm으로 진탕 배양하는 단계; 및
2) 상기에서 수득한 배양물로부터 미생물 셀룰로오스를 회수하는 단계
를 포함하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 배양이, 총 중량을 기준으로 효모 추출물 0.5중량%, 펩톤 0.5중량%, 아세트산 1.5 ml/L, 프럭토스 5중량% 및 CSL 5중량%를 포함하고 초기 pH가 4.8인 영양배지에 글루콘아세토박터 속 균주를 접종하여 30℃에서 200rpm으로 진탕 배양하는 것을 특징으로 하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 글루콘아세토박터 속 균주가, 글루콘아세토박터 자일리누스 아종 자일리누스(Gluconacetobacter xylinus subsp. xylinus) 균주(기탁번호: KCCM 40198, KCCM 41431 및 KCTC 40216), 글루콘아세토박터 리케파시엔스(Gluconacetobacter liquefaciens) 균주(기탁번호: KCTC 2859), 글루콘아세토박터 프럭투스(Gluconacetobacter fructus) 균주(기탁번호: KCTC 22717), 글루콘아세토박터 한세니이(Gluconacetobacter hansenii) 균주(기탁번호: KCCM 40230), 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 글루콘아세토박터 속 균주가 글루콘아세토박터 속 균주에 암실 조건에서 250 내지 260nm 파장의 자외선 램프를 1 내지 5분 동안 조사하여 제조한 글루콘아세토박터 돌연변이 균주인 것을 특징으로 하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법.
1) 총 중량을 기준으로 효모 추출물 0.5 내지 1중량%, 펩톤 0.5 내지 1중량%, 아세트산 1 내지 2 ml/L, 바이오디젤 공정부산물인 폐글리세롤의 수용성 추출액 10 내지 30중량% 및 CSL 1 내지 6중량%를 포함하고 초기 pH가 4 내지 6인 영양배지에, 글루콘아세토박터 속 균주를 접종하여 28 내지 30℃에서 150 내지 250 rpm으로 진탕 배양하는 단계; 및
2) 상기에서 수득한 배양물로부터 미생물 셀룰로오스를 회수하는 단계
를 포함하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법.
제 5 항에 있어서,
상기 배양이, 총 중량을 기준으로 효모 추출물 0.5중량%, 펩톤 0.5중량%, 아세트산 1.5 ml/L, 바이오디젤 공정부산물인 폐글리세롤의 수용성 추출액 10 내지 30중량% 및 CSL 5중량%를 포함하고 초기 pH가 4.8인 영양배지에 글루콘아세토박터 균주를 접종하여 30℃에서 200rpm으로 진탕 배양하는 것을 특징으로 하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법.
제 5 항에 있어서,
상기 글루콘아세토박터 균주가, 글루콘아세토박터 자일리누스 아종 자일리누스 균주(기탁번호: KCCM 40198, KCCM 41431 및 KCTC 40216), 글루콘아세토박터 리케파시엔스 균주(기탁번호: KCTC 2859), 글루콘아세토박터 프럭투스 균주(기탁번호: KCTC 22717), 글루콘아세토박터 한세니이 균주(기탁번호: KCCM 40230), 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법.
제 5 항에 있어서,
상기 글루콘아세토박터 속 균주가 글루콘아세토박터 속 균주에 암실 조건에서 250 내지 260nm 파장의 자외선 램프를 1 내지 5분 동안 조사하여 제조한 글루콘아세토박터 돌연변이 균주인 것을 특징으로 하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법.
제 5 항에 있어서,
상기 바이오디젤 공정부산물인 폐글리세롤의 수용성 추출액이, 바이오디젤 공정부산물 및 증류수의 혼합물을 추출 및 여과한 후 분리하는 전처리 과정을 거쳐 제조된 것을 특징으로 하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 전처리 과정이,
i) 바이오디젤 공정부산물 및 증류수를 1:1 내지 1:5의 중량비로 혼합한 후 2 내지 3시간 동안 교반하여 글리세롤을 수용액 상으로 추출하는 단계;
ii) 상기에서 수득한 추출액에 염산을 처리하여 pH를 4 이하로 조절하여 유분과 수용액 층을 분리하는 단계; 및
iii) 상기에서 수득한 수용액 층을 원심분리한 후, 여과기로 여과하여 폐글리세롤 수용성 추출액을 수득하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법.
KR1020130163101A 2013-12-24 2013-12-24 글루콘아세토박터 속 균주를 이용하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법 KR101577337B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130163101A KR101577337B1 (ko) 2013-12-24 2013-12-24 글루콘아세토박터 속 균주를 이용하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130163101A KR101577337B1 (ko) 2013-12-24 2013-12-24 글루콘아세토박터 속 균주를 이용하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150075234A KR20150075234A (ko) 2015-07-03
KR101577337B1 true KR101577337B1 (ko) 2015-12-15

Family

ID=53788280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130163101A KR101577337B1 (ko) 2013-12-24 2013-12-24 글루콘아세토박터 속 균주를 이용하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101577337B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190016389A (ko) 2017-08-08 2019-02-18 (주)아모레퍼시픽 녹차 추출물의 발효를 통해 제조되는 바이오 셀룰로오스 및 그 제조방법
JPWO2022163649A1 (ko) * 2021-01-29 2022-08-04

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102089538B1 (ko) * 2018-08-27 2020-05-22 (주)리스펙트바이오 셀룰로오즈 생성 증대능이 우수한 코마가테이박터 인터메디우스 rb-b-24 균주 및 이를 이용한 바이오 셀룰로오즈 제조 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cellulose. 2013, Vol.20, pp.2971-2979*

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20190016389A (ko) 2017-08-08 2019-02-18 (주)아모레퍼시픽 녹차 추출물의 발효를 통해 제조되는 바이오 셀룰로오스 및 그 제조방법
JPWO2022163649A1 (ko) * 2021-01-29 2022-08-04

Also Published As

Publication number Publication date
KR20150075234A (ko) 2015-07-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ye et al. Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum ATCC 23767 using tobacco waste extract as culture medium
Wu et al. Cost-effective production of bacterial cellulose in static cultures using distillery wastewater
Wu et al. Thin stillage supplementation greatly enhances bacterial cellulose production by Gluconacetobacter xylinus
Singhania et al. Developments in bioprocess for bacterial cellulose production
Yang et al. Isolation and characteristics analysis of a novel high bacterial cellulose producing strain Gluconacetobacter intermedius CIs26
CN108642104B (zh) 一种细菌纤维素、制备方法及其应用
CN102796673B (zh) 一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法
CN108441528B (zh) 一种高效产细菌纤维素的培养基
WO2013185777A4 (en) Methods of processing municipal solid waste (msw) using concurrent enzymatic hydrolysis and microbial fermentation.
KR101005560B1 (ko) 신규한 글루콘아세토박터 속 ｃ１ 균주 및 이를 이용한셀룰로오스 생산방법
KR20150114479A (ko) 박테리아 셀룰로오스 및 이것을 생산하는 세균
Fernández et al. Microbial cellulose from a Komagataeibacter intermedius strain isolated from commercial wine vinegar
KR101970439B1 (ko) 신규 코마가테이박터 래티커스 균주 및 이를 이용한 셀룰로오스 시트의 제조방법
US20210139938A1 (en) Aspergillus oryzae blcy-006 strain and application thereof in preparation of galactooligosaccharide
CN104087531A (zh) 一株粪产碱杆菌突变株及用它制备可得然胶的方法
KR101577337B1 (ko) 글루콘아세토박터 속 균주를 이용하여 미생물 셀룰로오스를 대량 생산하는 방법
KR101970440B1 (ko) 박테리아 셀룰로오스 생산 균주 배양용 조성물
Sharma et al. Isolation of cellulolytic organisms from the gut contents of termites native to Nepal and their utility in saccharification and fermentation of lignocellulosic biomass
KR101144235B1 (ko) 바이오에탄올 폐발효액을 이용한 부탄올의 제조방법
CN107937307A (zh) 一株细菌纤维素高产菌及其最优发酵条件
JP5629876B2 (ja) 非滅菌発酵による乳酸製造方法
JP5551354B2 (ja) 糖アルコールの製造方法
CN110699263B (zh) 黑曲霉yh-6及其应用于提高淫羊藿中淫羊藿素的含量
KR101816859B1 (ko) 감귤 착즙박을 이용한 박테리아 셀룰로오스 제조 방법
KR101435582B1 (ko) 최적의 배지 조성을 이용한 글루콘아세토박터 속 kcg326 균주에 의한 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181203

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191001

Year of fee payment: 5