KR20150114479A

KR20150114479A - 박테리아 셀룰로오스 및 이것을 생산하는 세균

Info

Publication number: KR20150114479A
Application number: KR1020157020229A
Authority: KR
Inventors: 겐지 다지마; 료타 고세; 히로아키 사쿠라이
Original assignee: 겐지 다지마; 료타 고세
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2013-12-27
Publication date: 2015-10-12
Also published as: CN107164426A; US20150376666A1; AU2013366934B2; PT2940145T; AU2013366934A1; CA2896699C; DK2940145T3; WO2014104318A1; US9611495B2; RU2654675C2; US9879295B2; RU2015131154A; NO2940145T3; PL2940145T3; JPWO2014104318A1; US20170191100A1; EP2940145A1; SA515360697B1; KR102077716B1; ES2660741T3

Abstract

(과제)본 발명은, 액체중에서의 분산성이 높고, 재료 응용에 있어서의 성형성이나 다른 재료와의 혼합성도 좋고, 실용 재료로서의 응용성이 우수한 박테리아 셀룰로오스 및 이것을 생산하는 세균을 제공한다.
(해결수단)종농도 0.1 ± 0.006%(w/w)로 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물에 있어서 파장 500nm의 빛의 투과율이 35%이상인 박테리아 셀룰로오스 및 이것을 생산하는 세균이다. 본 발명에 의하면, 물 등의 액체중에 균일하게 분산되는 박테리아 셀룰로오스를 얻을 수 있고, 이러한 박테리아 셀룰로오스는 성형성이나 다른 물질과의 혼합성이 우수한 것 때문에, 최종제품의 품질이나 생산효율의 향상 혹은 생산비용의 절감에 기여할 수 있다.

Description

박테리아 셀룰로오스 및 이것을 생산하는 세균{BACTERIAL CELLULOSE AND BACTERIUM PRODUCING SAME}

본 발명은, 박테리아 셀룰로오스 및 이것을 생산하는 세균에 관한 것으로서, 특히 액체중에서의 분산성(分散性)이 우수한 박테리아 셀룰로오스 및 이것을 생산하는 세균에 관한 것이다.

박테리아 셀룰로오스는, 일반적으로 폭이 약 50nm인 미세한 섬유(나노파이버(nanofiber))로 이루어지고, 높은 기계적 강도나 생체적합성(生體適合性), 생분해성(生分解性) 등의 특성을 가지고 있기 때문에, 여러가지 산업분야에서 활용할 수 있는 소재로서 주목받고 있다. 박테리아 셀룰로오스는, 일반적으로 초산균(醋酸菌) 등의 세균을 정치배양(靜置培養) 함으로써 배지 표면에 겔상(gel狀) 물질로 이루어지는 막(이하, 「겔상막(gel狀膜)」이라고 한다.)으로서 얻어지지만, 이 겔상막은 재료 응용상에 있어서 성형성이나 다른 물질과의 혼합성이 부족하고, 또 생산효율이 낮기 때문에 고비용이 되므로, 실용 재료로서의 응용성이 부족하다고 하는 문제가 있다.

이러한 문제에 대하여, 겔상막이 아닌, 재료로서의 응용성이 우수한, 액체중에 분산되는 박테리아 셀룰로오스가 요구되고 있다. 예를 들면 비특허문헌1에는, Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍｓｕｂｓｐ．ｓｕｃｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎs를 통기교반배양(通氣攪拌培養) 함으로써 얻어지는 박테리아 셀룰로오스가 개시되어 있고, 또 비특허문헌2에는, ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍＪＣＭ10150주를 카르복시메틸 셀룰로오스(ＣＭＣ)가 첨가된 배지중에서 회전진탕배양(回轉振蕩培養) 함으로써 얻어지는 박테리아 셀룰로오스가 개시되어 있다.

요시나가 외, 화학과 생물, Ｖｏｌ．35, Ｎｏ．11, 제7∼14쪽, 1997년 Ｓ．Ｗａｒａｓｈｉｎａ 외, 셀룰로오스학회 대 17회 연차대회 2010 ｃｅｌｌｕｌｏｓｅＲ&Ｄ 강연요지집, 제98쪽, 2010년

그러나 비특허문헌1에 기재되어 있는 박테리아 셀룰로오스는, 박테리아 셀룰로오스의 분산성의 향상 효과를 구비하는 ＣＭＣ를 첨가한 배지를 사용해서 생산된 것이 아닌 것 및 수중(水中)에서 「작은 입상(粒狀) 또는 섬유상(纖維狀)」으로 분산(동(同)문헌; 제9쪽 오른쪽란)되어 있다는 기재로부터도 분명하게 나타나 있는 바와 같이, 수중에서의 분산성이 높은 것은 아니다. 따라서 실용화를 위한 성형성이나 다른 물질과의 혼합성의 점에서 불충분하다. 또한 비특허문헌2에 기재되어 있는 박테리아 셀룰로오스는, ＣＭＣ의 배지에 대한 첨가량이 0.5%, 1%, 2%인 바, 어느 쪽의 경우에도 당해 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물은 상부보다 하부쪽이 백탁성(白濁性)이 높아서 침전이 관찰되는 것 및 셀룰로오스의 입자를 시인(視認)할 수 있을 만큼 큰 것 때문에(동문헌; Ｆｉｇ．1), 수중에서의 분산성이 높은 것은 아니다. 따라서 실용화에 필요한 성형성이나 다른 물질과의 혼합성의 점에서 불충분하다.

따라서 비특허문헌1 및 비특허문헌2 모두에 기재되어 있는 박테리아 셀룰로오스도, 재료로서의 성형성이나 다른 재료와의 혼합성이 불충분해서, 재료의 생산효율의 점에 있어서도 실용성이 떨어졌다.

본 발명은 이러한 문제점을 해결하기 위하여 이루어진 것으로서, 액체중에서의 분산성이 높고, 실용화함에 있어서의 성형성이나 다른 재료와의 혼합성도 좋아, 실용 재료로서의 응용성이 우수한 박테리아 셀룰로오스 및 이것을 생산하는 세균을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 예의 연구한 결과, 식물유(植物油)로부터 바이오 디젤 연료를 제조할 때에 발생하는 글리세롤을 함유하는 부산물(ＢｉｏＤｉｅｓｅｌＦｕｅｌＢｙ-ｐｒｏｄｕｃｔ; ＢＤＦ-Ｂ, 폐글리세린(廢glycerin))이나 시약 글리세롤 혹은 당밀(糖蜜)을 탄소원(炭素源)으로 하여, Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ의 신규의 균주(菌株)인 ＳＩＩＤ9587주(수탁번호 ＮＩＴＥＢＰ-01495)(이하, 「ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)」라고 하는 경우가 있다)를 ＣＭＣ를 포함하는 배지에서 교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스가, 수중에서 높은 분산성을 구비하는 것을 찾아내어, 하기의 각 발명을 완성하였다.

(1)본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는, 종농도(終濃度) 0.1 ± 0.006%(w/w)로 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물에 있어서 파장 500nm의 빛의 투과율이 35% 이상인 물성을 구비하고 있다.

(2)본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는, 또한 하기 i)∼ｖｉ)의 조건하에서 이루어지는 겔 침투 크로마토그래피의 크로마토그램의 피크 톱의 유지용량이 2.5ｍＬ이상 3.0ｍＬ미만인 물성을 구비하고 있다.

ｉ)칼럼; 입자지름 9μm의 메타크릴레이트 폴리머를 충전한 내경 6.0mm 및 길이 15cm의 칼럼,

ｉｉ)가드 칼럼; 내경 4.6mm, 길이 3.5cm,

ｉｉｉ)칼럼 온도; 35도,

ｉｖ)송액 속도; 0.07ｍＬ/분,

ｖ)용리액(eluent); 40∼42%(w/w) 수산화테트라부틸포스포늄 수용액,

ｖｉ)용리액에 있어서의 박테리아 셀룰로오스의 종농도; 0.2%(w/w).

(3)본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는, ＢＤＦ-Ｂ를 자화해서 생산되는 것이 바람직하다.

(4)본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는, 설탕, 설탕을 제조할 때에 발생하는 수크로오스를 함유하는 부산물 및 이들의 가수분해물 그리고 이성화당으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상을 자화해서 생산되는 것이 바람직하다.

(5)본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스가, 설탕을 제조할 때에 발생하는 수크로오스를 함유하는 부산물을 자화해서 생산되는 경우에는, 상기 부산물은 당밀인 것이 바람직하다.

(6)본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는, 글루콘아세토박터 인터메디우스(Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ)에 의하여 생산된 것이더라도 좋다.

(7)본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는, ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주(ＮＥＤＯ-01주)(수탁번호 ＮＩＴＥＢＰ-01495)에 의하여 생산된 것이더라도 좋다.

(8)본 발명에 관한 세균은, 상기 (1)∼(5)의 어느 하나에 기재된 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 것을 특징으로 하고 있다.

(9)본 발명에 관한 세균은, 상기 (1)∼(5)의 어느 하나에 기재된 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주(ＮＥＤＯ-01주)(수탁번호 ＮＩＴＥＢＰ-01495)이더라도 좋다.

본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스에 의하면, 물 등의 액체중에 거의 균일하게 분산되는 박테리아 셀룰로오스를 얻을 있고, 이 박테리아 셀룰로오스는 성형성이나 다른 물질과의 혼합성이 우수하기 때문에, 최종제품의 품질이나 생산효율의 향상 혹은 생산 비용의 절감에 기여할 수 있다. 또한 본 발명에 의하면, 믹서에 의한 미세화 등의 공정을 필요로 하지 않아, 완화된 조건하에서의 정제에 의하여 액체중에 거의 균일하게 분산되는 박테리아 셀룰로오스를 얻을 수 있으며, 비교적 큰 평균분자량을 구비하는 박테리아 셀룰로오스를 얻을 수 있다. 또한 본 발명에 의하면, 탄소원으로서, ＢＤＦ-Ｂ나 당밀 등의 설탕을 제조할 때에 발생하는 수크로오스를 함유하는 부산물을 사용함으로써, 자원의 유효활용에 기여함과 아울러 박테리아 셀룰로오스의 저가격화를 달성할 수 있다. 또한 본 발명에 의하면, Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ 혹은 ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주(ＮＥＤＯ-01주)를 사용해서 생산함으로써 효율적으로 대량의 박테리아 셀룰로오스를 얻을 수 있다.

도1은, ＢＤＦ-Ｂ를 자화(資化)해서 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 세균을 단리(單離)하는 절차를 나타내는 도면이다. 도면에서 박테리아 셀룰로오스는 ＢＣ로 약기(略記)한다.
도2a는, ＳＩＩＤ9587주와 Ｇ.ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＴＦ2주의 16ＳｒＤＮＡ 염기배열의 일치점 및 차이점을 나타내는 도면이다. 도면에서 염기배열의 일치점을 ＊표시로, 차이점을 사각으로 둘러싸서 각각 나타낸다. 또한 도면에서, Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ는 Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＴＦ2주를 나타낸다.
도2b는, ＳＩＩＤ9587주와 Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＴＦ2주의 16ＳｒＤＮＡ 염기배열의 일치점 및 차이점을 나타내는 도면이다. 도면에서 염기배열의 일치점을 ＊표시로, 차이점을 사각으로 둘러싸서 각각 나타낸다. 또한 도면에서, Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ는 Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＴＦ2주를 나타낸다.
도3은, ＳＩＩＤ9587주의 균학적 성상을 나타내는 도면이다.
도4는, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 정치배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스(상단도), ＢＤＦ-Ｂ 및 시약 글리세롤을 탄소원으로 하여 통기교반배양 함으로써 얻어진 생산물(중단도 및 하단도)의 ＩＲ스펙트럼을 나타내는 도면이다.
도5는, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 통기교반배양 및 정치배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스(좌측도 및 중앙도) 및 펄프 유래 박테리아 셀룰로오스 나노파이버(우측도)를 각각 포함하는 물의 외관을 나타내는 도면이다.
도6은, 당밀 및 시약 글리세롤을 각각 탄소원으로 하여, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 통기교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물에 있어서 파장 500nm의 빛의 투과율 및 박테리아 셀룰로오스의 생산량(ＢＣ생산량) 및 생산속도(ＢＣ생산속도)를 나타내는 도면이다.
도7은, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주) 및 기지(旣知)의 박테리아 셀룰로오스 생산균인 Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉｉＡＴＣＣ23769주, Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ53582주, Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ700178(ＢＰＲ2001)주, Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＪＣＭ10150주, Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＤＳＭ11804주 및 Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＫＣＣＭ40274주를 통기교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물에 있어서 파장 500nm의 빛의 투과율 및 ＢＣ생산량, ＢＣ생산속도와 ＢＣ생산속도의 비율을 나타내는 도면이다.
도8은, ＢＤＦ-Ｂ를 탄소원으로 하여 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 선회배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스(샘플B), 펄프 유래 셀룰로오스 나노파이버(펄프 유래 ＣＮＦ액) 및 풀루란(pullulan)의 겔 침투 크로마토그래피의 크로마토그램을 나타내는 도면이다.
도9는, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 통기교반배양(교반배양 ＢＣ액) 및 정치배양(믹서 처리 정치배양 ＢＣ액) 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스의 섬유폭 및 투과형 전자현미경에 의한 관찰 화상을 나타내는 도면이다.
도10은, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 통기교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스(교반배양 ＢＣ액) 및 펄프 유래 셀룰로오스 나노파이버(펄프 유래 ＣＮＦ액)에 있어서 투과형 전자현미경에 의한 관찰 화상을 나타내는 도면이다.
도11은, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 통기교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스(교반배양 ＢＣ액) 및 펄프 유래 셀룰로오스 나노파이버(펄프 유래 ＣＮＦ액)에 있어서 편광현미경에 의한 관찰 화상을 나타내는 도면이다.
도12는, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주) 및 기지의 박테리아 셀룰로오스 생산균인 Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉｉＡＴＣＣ23769주, Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ53582주 및 Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ700178(ＢＰＲ2001)주를 시약 글리세롤 또는 ＢＤＦ-Ｂ를 탄소원으로 하여 정치배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스의 중량을 나타내는 도면이다.
도13은, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주) 및 기지의 박테리아 셀룰로오스 생산균인 ＡＴＣＣ53582주 및 ＡＴＣＣ23769주를 시약 글리세롤 또는 ＢＤＦ-Ｂ를 탄소원으로 하여 진탕배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스의 중량을 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스 및 이것을 생산하는 세균에 대하여 상세하게 설명한다. 본 발명에 있어서의 박테리아 셀룰로오스란, 세균에 의하여 생산된 셀룰로오스를 말한다.

본 발명에 있어서 박테리아 셀룰로오스가 물 등의 액체중에 「분산된다」란, 박테리아 셀룰로오스가 액체중에 부유(浮遊) 혹은 현탁(懸濁)되는 것을 말한다. 또한 분산성이 높다란, 분산질(分散質)로서의 박테리아 셀룰로오스가 액체중에 있어서의 입자지름이나 섬유폭이 비교적 작은 것이나, 분산질로서의 박테리아 셀룰로오스가 액체중에서 비교적 균일하게 부유 혹은 현탁되어 있는 것 등을 말한다.

본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는 액체중에 거의 균일하게 분산될 만큼 높은 분산성을 구비하고 있다. 여기에서 박테리아 셀룰로오스를 분산시키는 액체는, 유기용매 및 수계용매의 어느 것이나 모두 사용할 수 있지만, 수계용매가 바람직하다.

박테리아 셀룰로오스의 분산성의 고저(高低)는, 예를 들면 빛의 투과율을 지표로 하여 측정할 수 있고, 빛의 투과율이 클수록 분산성이 높고, 빛의 투과율이 작을수록 분산성이 낮다고 하는 관계가 성립한다. 빛의 투과율은, 소정의 농도의 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물을 분광광도계(分光光度計)에 제공하고 소정의 파장의 빛을 조사하여 투과된 빛의 양을 측정함으로써 구할 수 있다.

본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는, 종농도(終濃度) 0.1 ± 0.006%(w/w)로 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물에 있어서 파장 500nm의 빛의 투과율이 35%이상인 물성을 구비하고 있다. 여기에서 본 발명에 있어서의 종농도 0.1 ± 0.006%(w/w)로 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물에 있어서 파장 500nm의 빛의 투과율로서는, 35%이상인 것 외에, 예를 들면 36%이상, 37%이상, 38%이상, 39%이상, 40%이상, 35%이상 99%이하, 36%이상 99%이하, 37%이상 99%이하, 38%이상 99%이하, 40%이상 99%이하, 35%이상 95%이하, 36%이상 95%이하, 37%이상 95%이하, 38%이상 95%이하, 40%이상 95%이하, 35%이상 90%이하, 36%이상 90%이하, 37%이상 90%이하, 38%이상 90%이하, 40%이상 90%이하, 35%이상 85%이하, 36%이상 85%이하, 37%이상 85%이하, 38%이상 85%이하, 40%이상 85%이하, 35%이상 80%이하, 36%이상 80%이하, 37%이상 80%이하, 38%이상 80%이하, 40%이상 80%이하 등을 들 수 있다.

또한 본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는, 펄프 유래 셀룰로오스 나노파이버 등, 식물 유래의 셀룰로오스와 비교해서 큰 평균분자량을 구비하고 있어도 좋다. 셀룰로오스의 평균분자량은, 예를 들면 겔 침투 크로마토그래피(gel permeation chromatography)의 크로마토그램을 지표로 하여 측정할 수 있고, 이러한 크로마토그램의 피크 톱(peak top)의 유지용량이 클수록 평균분자량이 작고, 유지용량이 작을수록 평균분자량이 크다고 하는 관계가 성립한다. 즉 본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는, 하기 ｉ)∼ｖｉ)의 조건하에서 행하는 겔 침투 크로마토그래피의 크로마토그램의 피크 톱의 유지용량이 2.5ｍＬ이상 3.0ｍＬ미만인 물성을 구비하고 있어도 좋다. ｉ)칼럼이 입자지름 9μm의 메타크릴레이트 폴리머를 충전한 내경 6.0mm 및 길이 15cm일 것, ｉｉ)가드 칼럼이 내경 4.6mm, 길이 3.5cm일 것, ｉｉｉ)칼럼 온도가 35도일 것, ｉｖ)송액 속도가 0.07ｍＬ/분일 것, v)용리액(eluent)이 40∼42%(w/w) 수산화테트라부틸포스포늄 수용액일 것, ｖｉ)용리액에 있어서의 박테리아 셀룰로오스의 종농도가 0.2%(w/w)일 것.

또한 본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는, 예를 들면 적당한 탄소원(炭素源)을 함유하는 배지(培地)중에서 세균을 배양해서 박테리아 셀룰로오스를 생산시킴으로써 제조할 수 있다.

여기에서 탄소원으로서는, 예를 들면 글루코오스나 프룩토오스 등의 단당(單糖), 수크로오스나 말토오스, 락토오스 등의 2당(二糖), 올리고당, 설탕, 설탕을 제조할 때에 발생하는 수크로오스를 함유하는 부산물, 이들의 가수분해물(加水分解物), 이성화당(異性化糖), 전분가수분해물 등의 당류(糖類)나 만니톨(mannitol), 에탄올, 아세트산, 구연산, 글리세롤, ＢＤＦ-Ｂ 등을 들 수 있고, 세균의 종류나 배양조건, 제조비용 등에 따라 적절하게 설정할 수 있다. 또 ＢＤＦ-Ｂ는, 일반적인 조성으로서 글리세롤 41.5%, 지방산 21.4%, 메탄올 12.4%, 강열잔분(强熱殘分) 6.3% 기타 18.4%(재단법인 일본식품분석센터(Japan Food Research Laboratories))로 이루어져, 세균의 탄소원으로서 이용가능한 글리세롤을 많이 포함하는 조성물이다.

여기에서 설탕이란, 수크로오스를 주성분으로 하는 감미료를 말하고(고지엔(일본어사전) 제6판), 본 발명에 있어서는, 화학합성된 것이라도 좋고, 사탕수수나 첨채(사탕무), 사탕단풍, 사탕야자(gomuti; 팔미라야자(Borassus flabellifer)), 단수수(sweet sorghum; 사탕옥수수) 등의 천연물을 원료로 하여 제조된 것이라도 좋다. 본 발명에 있어서의 설탕으로서는, 예를 들면 흑설탕이나 백하당(白下糖; 조제설탕), 카소나드(cassonade; 적설탕), 일본제 고급 백설탕(和三盆), 메이플 슈거(maple sugar) 등의 함밀당(含蜜糖)이나, 조당(粗糖)이나 정제당(精製糖) 등의 분밀당(分蜜糖)을 들 수 있다. 정제당으로서는, 예를 들면 백쌍당(白雙糖)이나 중쌍당(中雙糖), 그래뉴당(granulated sugar) 등의 자라메당(hard sugar; 결정의 크기가 큰 설탕), 상백당(上白糖)이나 삼온당(三溫糖) 등의 차당(車糖; soft sugar), 각설탕이나 빙(氷)설탕, 분(粉)설탕, 과립당(顆粒糖) 등의 가공당(加工糖), 그 밖에 액당(液糖) 등을 들 수 있다.

또한 설탕을 제조할 때에 발생하는 수크로오스를 함유하는 부산물이란, 설탕의 제조공정에 있어서 발생하는 부산물 중에서 수크로오스를 함유하는 것을 말하고, 구체적으로는, 예를 들면 상기의 사탕수수나 사탕무 등의 천연물 원료의 짜고 남은 찌꺼기나, 당밀, 여과나 이온교환수지에 의한 정제공정에서 발생하는 잔사(殘渣)를 들 수 있다.

또한 2당이나 올리고당, 설탕, 설탕을 제조할 때에 발생하는 수크로오스를 함유하는 부산물의 가수분해물이란, 2당이나 올리고당, 설탕, 설탕을 제조할 때에 발생하는 수크로오스를 함유하는 부산물에 대하여, 산성용액중에서 가열하는 등의 가수분해처리를 실시해서 얻어지는 것을 말한다.

탄소원 이외의 배지의 성분은, 세균의 배양에 사용되는 공지의 배지와 같은 것을 사용할 수 있고, ＣＭＣ를 함유하는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 ＣＭＣ, 질소원, 무기염류 그 밖에 필요에 따라 아미노산, 비타민 등의 유기 미량 영양소를 함유하는 통상의 영양배지를 들 수 있고, 질소원으로서는, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염, 질산염, 요소, 펩톤 등의 유기 혹은 무기의 질소원을 들 수 있다. 또한 무기염류로서는, 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등을, 유기 미량 영양소로서는, 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 또한 이들의 영양소를 포함하는 펩톤, 카사미노산(casamino acid), 효모 엑기스, 대두단백 가수분해물 등을 들 수 있고, 생육에 아미노산을 요구하는 영양요구성 변이주(榮養要求性變異株)를 사용하는 경우에는, 요구되는 영양소를 더 보첨(補添)할 수 있다.

또한 세균으로서는, 박테리아 셀룰로오스를 생산할 수 있는 세균이면 특별하게 한정되지 않지만, 교반배양(攪拌培養)이나 통기배양(通氣培養)에 의하여 박테리아 셀룰로오스를 생산할 수 있는 세균이 바람직하고, ＢＤＦ-Ｂ를 자화하는 세균이 더 바람직하다. 구체적으로는, 예를 들면 아세토박터속 세균이나 글루콘아세토박터속 세균, 슈도모나스(Pseudomonas)속 세균, 아그로박테리움(Agrobacterium)속 세균, 리조비움(Rhizobium)속 세균, 엔테로박터(Enterobacter)속 세균 등을 들 수 있고, 더 구체적으로는, Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ나 Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｈａｎｓｅｎｉｉ, Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｗｉｎｇｓｉｉ, Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ, Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅｔｉ, Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍ, Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍｓｕｂｓｐ．ｓｕｃｒｏｆｅｒｍｅｎｔａｎs, Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍｓｕｂｓｐ．ｎｏｎａｃｅｔｏｘｉｄａｎｓ, Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｒａｎｓｅｎｓ, Ｓａｒｃｉｎａｖｅｎｔｒｉｃｕｌｉ, Ｂａｃｔｅｒｉｕｍｘｙｌｏｉｄｅｓ, Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ． 등을 들 수 있지만, 이들 중에서 Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ가 바람직하다. 더욱 구체적으로는, ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주(ＮＥＤＯ-01주)(수탁번호 ＮＩＴＥＢＰ-01495), ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ53582주, ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｈａｎｓｅｎｉｉＡＴＣＣ23769주나 ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ700178(ＢＰＲ2001)주, ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｓｗｉｎｇｓｉｉＢＰＲ3001Ｅ주, ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｍＪＣＭ10150주, Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ．ＣＪＦ-002주 등을 들 수 있고, 이들 중에서 ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주(ＮＥＤＯ-01주)(수탁번호 ＮＩＴＥＢＰ-01495)가 바람직하다.

배양방법으로서는, 예를 들면 교반배양이나 통기배양 등을 들 수 있다. 교반배양으로서, 구체적으로는 퍼멘터(fermentor)를 사용하고 통기를 하지 않는 배양(무통기 교반배양)이나 퍼멘터를 사용하고 통기를 하는 배양(통기교반배양), 날개(가지) 부착 플라스크(baffled flask)를 사용한 좌우로 흔들리는 배양(진탕배양(振蕩培養)), 날개 부착 플라스크를 사용한 회전식 배양(선회배양(旋回培養))) 등을 들 수 있다. 또한 배양조건은 상기의 세균의 배양에 사용되는 공지의 배양조건으로 할 수 있고, 예를 들면 통기량 1∼10L/분, 회전수 100∼800ｒｐｍ, 온도 20∼40도, 배양기간 1일∼7일간의 배양조건을 들 수 있다.

또한 본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스의 제조에 있어서는, 필요에 따라 탄소원의 전처리공정(前處理工程), 전전(前前)배양공정, 전(前)배양공정, 박테리아 셀룰로오스의 정제, 건조, 현탁공정 등을 실시할 수 있다.

본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스는, 예를 들면 지력 증강제(紙力增强劑)나 식품의 증점제(增粘劑), 현탁 안정화제 등의 첨가물로서 사용할 수 있다.

다음에 본 발명에 관한 세균은, 상기한 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 것이다. 본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 세균에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스와 동일 또는 상당하는 구성에 대해서는 두 번의 설명은 생략한다.

이하, 본 발명에 관한 박테리아 셀룰로오스 및 이것을 생산하는 세균에 대해서, 각 실시예에 대해서 설명한다. 또 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 의하여 나타내는 특징에 한정되지 않는다.

실시예

<실시예1>세균의 단리(單離) 및 동정(同定)

(1)세균의 단리

ＢＤＦ-Ｂ를 자화해서 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 세균을 단리 했다. 구체적으로는, 도1에 나타내는 순서에 따라 우선 사과 및 프룬을 분리원으로 하여, 헤스트린 - 슈람(Ｈｅｓｔｒｉｎ-Ｓｃｈｒａｍｍ) 표준배지(조성; ｂａｃｔｏｐｅｐｔｏｎ 0.5%(w/v), ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ 0.5%(w/v), Ｎａ₂ＨＰＯ₄ 0.27%(w/v), 구연산 0.115%(w/v), 글루코오스 2%(w/v); ＨＳ배지)에 있어서 글루코오스 대신에 2%(w/v)의 시약 글리세롤(시약 특급; 와코준야쿠주식회사(Wako Pure Chemical Industries, Ltd.))을 포함하는 배지(ＨＳ/글리세롤 배지)를 사용해서 집적배양(集積培養)을 하였다. 이것을, 셀룰로오스 염색 시약을 포함하는 ＨＳ/글리세롤 배지에 식균(植菌)하고 30도에서 플레이트 배양하여, 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 균주를 15종 선택했다. 계속하여 이들의 균주를 2%(w/v)의 시약 글리세롤(시약 특급; 와코준야쿠주식회사)을 포함하는 ＬＢ배지(조성;트립톤 1%(w/v), ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ 0.5%(w/v), 염화나트륨 0.5%(w/v))에 식균하고 30도에서 정치배양 하여, 겔상막(gel狀膜)을 생성시켰다. 겔상막의 건조중량(乾燥重量)(이하, 「건조막중량」이라고 한다.)을 측정하여, 건조막중량이 큰 균주를, 글리세롤을 자화하고 또한 박테리아 셀룰로오스 생산능(生産能)이 높은 균으로서 8종 선택했다. 다음에 ＢＤＦ-Ｂ를 포함하는 ＬＢ배지에 식균해서 30도에서 플레이트 배양하고, 또 ＨＳ배지에 식균해서 30도에서 정치배양 함으로써 겔상막을 생성시켰다. 이 중에서 건조막중량이 큰 균주를 선택하여 글리세롤을 포함하는 ＬＢ배지 또는 ＨＳ/글리세롤 배지에서 플레이트 배양한 후, ＨＳ배지에서 정치배양 하는 조작을 반복해서 하여, ＢＤＦ-Ｂ 자화성을 구비하고 또한 박테리아 셀룰로오스 생산능이 높은 균주를 1종 선정하여, 이것을 ＳＩＩＤ9587주로 했다.

(2)세균의 동정

본 실시예1(1)의 ＳＩＩＤ9587주에 대해서, 보통의 방법에 따라 시퀀싱을 하여, 전장(全長) 16S ｒＤＮＡ의 염기배열(1367ｂｐ; 배열번호1)을 결정했다. 계속하여 주식회사테크노스루가·라보(TechnoSuruga Laboratory Co., Ltd.)에 있어서 16S ｒＤＮＡ 염기배열 해석 및 균학적 성상시험을 하였다.

[2-1] 16S ｒＤＮＡ 염기배열 해석

16S ｒＤＮＡ 염기배열 해석은, 소프트웨어로서 아폴론 2.0(테크노스루가·라보사)을, 데이터베이스로서 아폴론ＤＢ-ＢＡ 6.0(테크노스루가·라보사) 및 국제염기배열데이터베이스(ＧｅｎＢａｎｋ/ＤＤＢＪ/ＥＭＢＬ)를 사용해서 하였다. 아폴론ＤＢ-ＢＡ 6.0에 대한 상동성(相同性) 검색의 결과, ＳＩＩＤ9587주의 16S ｒＤＮＡ 염기배열(배열번호1)은, Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ속의 16S ｒＤＮＡ 염기배열에 대하여 높은 상동성을 나타내고, Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＴＦ2주(억세션번호(accession number) Ｙ14694)의 16S ｒＤＮＡ 염기배열에 대하여 상동율 99.8%의 가장 높은 상동성을 나타냈다. 또한 ＧｅｎＢａｎｋ/ＤＤＢＪ/ＥＭＢＬ에 대한 상동성 검색의 결과에 있어서도, ＳＩＩＤ9587주의 16S ｒＤＮＡ 염기배열(배열번호1)은, Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ속의 16S ｒＤＮＡ 염기배열에 대하여 높은 상동성을 나타내고, 기준주에서는, Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＴＦ2주(억세션번호 ＮＲ_026435)의 16S ｒＤＮＡ 염기배열에 대하여 상동율 99.8%의 높은 상동성을 나타냈다. 또 억세션번호 Ｙ14694의 배열과 억세션번호 ＮＲ_026435의 배열은 동일하다. ＳＩＩＤ9587주와 Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＴＦ2주(억세션번호 Ｙ14694, ＮＲ_026435)의 16S ｒＤＮＡ 염기배열 비교의 결과를 도2a 및 도2b에 나타낸다. 도2a 및 도2b에 나타나 있는 바와 같이 양자 사이에는 4염기의 차이점이 있었다. 또한 아폴론ＤＢ-ＢＡ 6.0에 대한 상동성 검색에 있어서, 상동성이 높았던 상위 15주의 16S ｒＤＮＡ 염기배열에 의거하는 간이분자계통 해석의 결과, ＳＩＩＤ9587주는 Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ속의 종으로 형성되는 클러스터(cluster)내에 포함되었다.

[2-2] 균학적 성상시험

균학적 성상시험의 결과를 도3에 나타낸다. 도3에 나타나 있는 바와 같이, ＳＩＩＤ9587주는, 5% 아세트산 함유 배지에서 생육하지 않는 점에서 기지의 Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ와는 성상이 다르고, 다른 성상은 일치했다(ＢＲＥＮＮＥＲ외, Ｂｅｒｇｅｙ's ｍａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．Ｔｗｏ. ＴｈｅＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ, ＰａｒｔＣＴｈｅＡｌｐｈａ-, Ｂｅｔａ-, Ｄｅｌｔａ-, ａｎｄＥｐｓｉｌｏｎｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ．2005．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ．ｐ72-77).

이상의 본 실시예1(2)[2-1] 및 [2-2]의 결과로부터, ＳＩＩＤ9587주는, Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ에 귀속하는 것이 밝혀졌다. 한편 ＳＩＩＤ9587주와 Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ의 기준주인 Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＴＦ2주와의 사이에는, 16S ｒＤＮＡ 염기배열 및 균학적 성상에 있어서 상기한 바와 같이 차이점이 존재하는 것으로부터, ＳＩＩＤ9587주는 Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ의 신규의 균주인 것이 밝혀졌다. 그래서 이 균주를 평성24년(2012년) 12월 21일에 독립행정법인 제품평가기술기반기구특허미생물기탁센터(National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganisms Depositary(ＮＩＴＥ-ＩＰＯＤ; 우편번호292-0818 일본국 치바켄 기사라즈시 가즈사가마타리 2-5-8, 122호실(#122, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba 292-0818, Japan))에 수탁번호 ＮＩＴＥＢＰ-01495로서 기탁했다. 이하, 이 ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주(수탁번호 ＮＩＴＥＢＰ-01495)를 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)로 한다.

(3)생산물의 확인

ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)의 전(前)배양을 하여 균체를 증식시켰다. 계속하여 전배양을 하여 얻어진 배양액(전배양액)을 ＨＳ배지(탄소원; 글루코오스)에 가하여, 30도에서 약 8일간 정치배양 함으로써 본배양(本培養)을 하여 배지 표면에 겔상막을 생성시켰다. 겔상막에 대해서, 보통의 방법에 따라 적외분광법(ＩＲ)의 스펙트럼 및 X선 회절 프로파일을 얻어서 해석을 하였다. 그 결과, 겔상막은 Ｉ형의 결정구조를 가지는 셀룰로오스인 것이 밝혀졌다. 또한 보통의 방법에 따라 주사형 전자현미경 화상을 얻어서 해석을 한 결과, 겔상막에서는, 나노 단위의 폭의 셀룰로오스 섬유(셀룰로오스 나노파이버)가 네트워크 구조를 형성하고 있는 것이 밝혀졌다. 이들 결과로부터, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)는 셀룰로오스를 생산하는 것이 확인되었다.

<실시예2>통기교반배양에 의한 생산물의 평가

(1)통기교반배양에 의한 생산물의 조제

ＢＤＦ-Ｂ를 중화처리 하고 또 오토클레이브(autoclave) 처리를 함으로써 전처리(前處理)한 ＢＤＦ-Ｂ를 얻었다.

2%(w/v)의 ＣＭＣ(화학용; 와코준야쿠주식회사)를 포함하는 ＨＳ배지에 있어서, 탄소원으로서 글루코오스 대신에 시약 글리세롤(시약 특급; 와코준야쿠주식회사)을 첨가한 것 및 글루코오스 대신에 전처리한 ＢＤＦ-Ｂ를 농도가 2%(w/v)가 되도록 첨가한 것을 조제하여 각각을 글리세롤 본배양배지 및 ＢＤＦ-Ｂ 본배양배지로 했다. 그리고 우선 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)의 전배양을 하여 균체를 증식시켰다. 다음에 전배양액을 5L의 글리세롤 본배양배지 및 ＢＤＦ-Ｂ 본배양배지에 각각 식균하고 퍼멘터를 사용하여 통기량 7∼10L/분, 회전수 200∼800ｒｐｍ, 온도 30도의 조건하에서 통기교반배양을 4일간 함으로써 본배양을 하였다. 본배양을 하여 얻어진 배양액(본배양액)에 1%(w/v) ＮａＯＨ 수용액을 가하여 60도, 80ｒｐｍ으로 4∼5시간 진탕함으로써 균체를 용해시켰다. 이것을 원심분리한 후에 상청(上淸; 표면에 떠 있는 맑은 부분)을 제거해서 침전물을 회수함으로써 수용성의 균체 성분을 제거했다. 거기에 초순수(超純水)를 가하고 원심분리를 한 후에 상청을 제거하는 조작을 습윤상태에서 침전물의 ｐＨ가 7이하가 될 때까지 반복함으로써 생산물을 정제하여, 이것을 교반배양 ＢＣ액으로 했다.

(2)정치배양에 의한 박테리아 셀룰로오스의 조제

실시예1(3)에 기재되어 있는 방법에 따라 겔상막을 얻어, 약 1cm × 1cm의 크기로 절단했다. 계속하여 1%(w/v) ＮａＯＨ 수용액을 가하여 60도, 80ｓｔｒｏｋｅｓ/분으로 4∼5시간 진탕한 후, 20도에서 하룻밤 진탕하였다. 철망을 사용해서 여과함으로써 액체를 제거해서 겔상막을 회수했다. 거기에 초순수를 가하고 20도에서 하룻밤 진탕하는 조작을 ｐＨ가 7이하가 될 때까지 반복함으로써 정제한 후, 믹서를 사용해서 몇 분간 현탁 처리하여, 이것을 믹서 처리 정치배양 ＢＣ액으로 했다.

(3)해석

실리콘판상에, 본 실시예2(1)의 교반배양 ＢＣ액 및 본 실시예2(2)의 믹서 처리 정치배양 ＢＣ액을 각각 적하해서 건조시킨 후, 적외분광광도계(ＦＴ/ＩＲ-4200; 일본분광주식회사(JASCO Corporation))로 적산 횟수 32회, 분해능 2cm^-1 또는 4cm^-1로 측정을 하여, ＩＲ스펙트럼을 얻었다. 그 결과를 도4에 나타낸다. 도4에 나타나 있는 바와 같이, ＢＤＦ-Ｂ 본배양배지 및 글리세롤 본배양배지를 사용해서 얻어진 교반배양 ＢＣ액의 ＩＲ스펙트럼은, 믹서 처리 정치배양 ＢＣ액의 ＩＲ스펙트럼과 동일한 형상이었다. 이 결과로부터, ＢＤＦ-Ｂ나 시약 글리세롤을 탄소원으로 하여 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 교반배양 함으로써 얻어진 생산물은 셀룰로오스인 것이 확인되었다.

<실시예3> 박테리아 셀룰로오스의 수중에서의 분산성

(1)박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물의 외관

실시예2(1)의 ＢＤＦ-Ｂ 본배양배지를 사용한 교반배양 ＢＣ액 및 실시예2(2)의 믹서 처리 정치배양 ＢＣ액을 준비했다. 또한 시판되는 펄프 유래 셀룰로오스 나노파이버를 물에 첨가해서 분산시켜서 이것을 펄프 유래 ＣＮＦ액으로 했다. 교반배양 ＢＣ액, 믹서 처리 정치배양 ＢＣ액 및 펄프 유래 ＣＮＦ액을 1일 정치한 후에 외관을 관찰했다. 그 결과를 도5에 나타낸다.

도5에 나타나 있는 바와 같이 펄프 유래 ＣＮＦ액에서는 셀룰로오스의 침전이 관찰되었다. 또한 믹서 처리 정치배양 ＢＣ액에서는, 괴상(塊狀)의 박테리아 셀룰로오스가 관찰되어, 박테리아 셀룰로오스의 분산 상태가 불균일했다. 이에 대하여 교반배양 ＢＣ액에서는 침전이나 괴상의 박테리아 셀룰로오스는 관찰되지 않았고, 박테리아 셀룰로오스가 균일하게 분산되어 있는 모습이 관찰되었다. 이들 결과로부터, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스는, 펄프 유래 셀룰로오스 나노파이버나 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 정치배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스와 비교해서, 분산성이 높아 물 등의 액체중에 균일하게 분산되는 것이 밝혀졌다.

(2)박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물의 빛의 투과율

[2-1]정치배양의 박테리아 셀룰로오스 및 펄프 유래 셀룰로오스와의 비교

실시예2(1)에 기재되어 있는 방법에 있어서, 본배양으로서 퍼멘터 대신에 날개 부착 플라스크를 사용해서 150ｒｐｍ, 온도 30도의 조건하에서 3일간 선회배양을 하여 교반배양 ＢＣ액을 조제하고, 이것을 샘플A(글리세롤 본배양배지를 사용한 것) 및 샘플B(ＢＤＦ-Ｂ 본배양배지를 사용한 것)로 했다. 또한 실시예2(1)의 ＢＤＦ-Ｂ 본배양배지를 사용한 교반배양 ＢＣ액을 샘플C, 글리세롤 본배양배지를 사용한 교반배양 ＢＣ액을 샘플D로 했다. 또한 실시예2(2)의 믹서 처리 정치배양 ＢＣ액 및 실시예3(1)의 펄프 유래 ＣＮＦ액을 각각 준비했다. 이들의 셀룰로오스의 종농도를 0.1 ± 0.006%(w/w)가 되도록 조제한 후, 셀에 1ｍＬ씩 가하고, 분광광도계(U-2001형 더블 빔 분광광도계; 주식회사히타치제작소(Hitachi, Ltd.))에 제공하여 파장 500nm의 빛의 투과율을 측정했다. 셀로는 폴리스티렌제 디스포저블 큐벳(disposable cuvette)(세미마이크로, 광로장(光路長) 10mm, 광로폭 4mm)을 사용하고, 레퍼런스로는 초순수를 사용했다. 그 결과를 표1에 나타낸다.

표1에 나타나 있는 바와 같이, 샘플A, B, C 및 D의 투과율은, 각각 74.75%, 70.53%, 63.82% 및 49.66%으로, 믹서 처리 정치배양 ＢＣ액의 19.19% 및 펄프 유래 ＣＮＦ액의 12.72%와 비교해서 현저하게 크고, 대략 40%이상 80%이하의 범위이었다.

[2-2] 배지중의 ＣＭＣ의 유무에 있어서의 비교

실시예2(1)에 기재되어 있는 방법에 있어서, 2%(w/v)의 ＣＭＣ를 포함하는 ＨＳ배지와 ＣＭＣ를 포함하지 않는 ＨＳ배지를 각각 사용해서 교반배양 ＢＣ액을 얻었다. 다만 탄소원으로서 글루코오스 대신에 당밀을 사용했다. 또한 당밀을 탄소원으로 한 경우에는, 본배양 3일째에 배지중의 탄소원이 거의 없어졌기 때문에, 본배양의 일수는 4일간 대신 3일간으로 했다. 계속하여 본 실시예3(2)[2-1]에 기재되어 있는 방법에 의하여 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물의 빛의 투과율을 측정했다. 그 결과를 하기의 표2에 나타낸다.

표2에 나타나 있는 바와 같이, ＣＭＣ를 포함하는 ＨＳ배지를 사용했을 경우의 투과율은 57%이었던 것에 대해서, ＣＭＣ를 포함하지 않는 ＨＳ배지를 사용했을 경우의 투과율은 18%이었다.

이상의 본 실시예3(2)[2-1] 및 [2-2]의 결과로부터, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 ＣＭＣ를 포함하는 배지에서 교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스를 종농도 0.1 ± 0.006%(w/w)로 포함하는 물에 있어서 파장 500nm의 빛의 투과율은, 40%이상 80%이하인 것이 밝혀졌다. 즉 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 ＣＭＣ를 포함하는 배지에서 교반배양 함으로써 액체중에서의 분산성이 현저하게 높아 액체중에 균일하게 분산되는 박테리아 셀룰로오스가 얻어지는 것이 밝혀졌다.

<실시예4> 탄소원이 다른 경우의 투과율 및 박테리아 셀룰로오스의 생산속도의 비교

실시예2(1)에 기재되어 있는 방법에 의하여 교반배양 ＢＣ액을 얻었다. 다만 탄소원으로서 글루코오스 대신에 당밀 및 시약 글리세롤을 사용했다. 또한 당밀을 탄소원으로 한 경우에는, 본배양의 일수는 4일간 대신 3일간으로 했다. 계속하여 실시예3(2)[2-1]에 기재되어 있는 방법에 의하여 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물의 빛의 투과율을 측정했다. 또한 교반배양 ＢＣ액을 건조시켜서 박테리아 셀룰로오스의 절건중량(絶乾重量)을 측정하고, 측정결과에 의거하여 배지 1Ｌ당의 박테리아 셀룰로오스의 농도를 산출하여 이것을 박테리아 셀룰로오스의 생산량(ＢＣ생산량; g/L)으로 했다. 또한 ＢＣ생산량을 본배양의 일수로 나눈 값을 산출하고, 이것을 박테리아 셀룰로오스의 생산속도(ＢＣ생산속도; g/L/일）로 했다. 그 결과를 도6에 나타낸다.

도6의 표 및 좌측의 막대그래프에 나타나 있는 바와 같이, 당밀을 탄소원으로서 사용했을 경우의 투과율은 57%로, 시약 글리세롤을 탄소원으로서 사용했을 경우의 57%와 동일한 값이었다. 이 결과로부터, 당밀을 탄소원으로 하여 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 배양함으로써, 시약 글리세롤을 탄소원으로 하였을 경우와 마찬가지로, 종농도 0.1 ± 0.006%(w/w)로 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물에 있어서 파장 500nm의 빛의 투과율이 현저하게 높은 박테리아 셀룰로오스가 얻어지는 것이 밝혀졌다. 즉 당밀을 탄소원으로 하여 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 배양함으로써 분산성이 높아 액체중에 균일하게 분산되는 박테리아 셀룰로오스가 얻어지는 것이 밝혀졌다.

또한 도6의 표 및 우측의 막대그래프에 나타나 있는 바와 같이, 당밀을 탄소원으로서 사용했을 경우의 ＢＣ생산속도는 1.48g/L/일로서, 시약 글리세롤을 탄소원으로서 사용했을 경우의 0.95g/L/일보다 약 1.5배 컸다. 이 결과로부터, 당밀을 탄소원으로 하여 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 배양함으로써 분산성이 높은 박테리아 셀룰로오스를 단기간에 대량으로 얻을 수 있는 것이 밝혀졌다.

<실시예5> 세균이 다른 경우의 투과율 및 박테리아 셀룰로오스 생산속도의 비교

실시예2(1)에 기재되어 있는 방법에 의하여 교반배양 ＢＣ액을 얻었다. 다만 탄소원으로서 글루코오스 대신에 당밀을 사용했다. 또한 세균으로서 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주) 및 기지의 박테리아 셀룰로오스 생산균인 ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｈａｎｓｅｎｉｉＡＴＣＣ23769주, ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ53582주, ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ700178(ＢＰＲ2001)주, ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｓＪＣＭ10150주, ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＤＳＭ11804주 및 ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｓＫＣＣＭ40274주를 각각 사용했다. 또한 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 사용한 경우에는, 본배양 3일째에 배지중의 탄소원이 거의 없어졌기 때문에, 본배양의 일수는 4일간에 대신하여 3일간으로 했다. 한편 ＤＳＭ11804주를 사용한 경우에는, 본배양 4일째에도 배지중의 탄소원의 감소의 정도가 작았기 때문에, 본배양의 일수는 4일간에 대신하여 5일간으로 했다. 계속하여 실시예3(2)[2-1]에 기재되어 있는 방법에 의하여 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물의 빛의 투과율을 측정했다. 또한 실시예4에 기재되어 있는 방법에 의하여 ＢＣ생산량(g/L) 및 ＢＣ생산속도(g/L/일）를 산출하고, 투과율 및 ＢＣ생산속도에 대해서는 수치를 막대그래프로 나타냈다. 그 결과를 도7에 나타낸다.

도7의 표 및 좌측의 막대그래프에 나타나 있는 바와 같이, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 사용했을 경우의 투과율은 57%이었던 것에 대해서, Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉｉＡＴＣＣ23769주, Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ53582주, Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ700178(ＢＰＲ2001)주, Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＪＣＭ10150주, Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＤＳＭ11804주 및 Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＫＣＣＭ40274주를 사용했을 경우의 투과율은, 각각 20%, 33%, 29%, 27%, 9% 및 13%이었다. 이 결과로부터, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 배양해서 얻어진 박테리아 셀룰로오스를 종농도 0.1 ± 0.006%(w/w)로 포함하는 물에 있어서 파장 500nm의 빛의 투과율은, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주) 이외를 배양해서 얻어진 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물의 당해 투과율과 비교해서 현저하게 크고, 35%이상인 것이 밝혀졌다. 즉 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 배양함으로써 분산성이 높아 액체중에 균일하게 분산되는 박테리아 셀룰로오스를 얻을 수 있는 것이 밝혀졌다.

또한 도7의 표 및 우측의 막대그래프에 나타나 있는 바와 같이, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 사용했을 경우의 ＢＣ생산속도는 1.48g/L/일이었던 것에 대해서, Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉｉＡＴＣＣ23769주, Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ53582주, Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ700178(ＢＰＲ2001)주, Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＪＣＭ10150주, Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＤＳＭ11804주 및 Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＫＣＣＭ40274주를 사용했을 경우의 ＢＣ생산속도는, 각각 1.05g/L/일, 1.03g/L/일, 1.11g/L/일, 1.10g/L/일, 0.42g/L/일 및 0.43g/L/일이었다. 즉 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 사용했을 경우의 ＢＣ생산속도는, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주) 이외를 사용했을 경우의 ＢＣ생산속도와 비교해서 현저하게 컸다. 이 결과로부터, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 배양함으로써 분산성이 높은 박테리아 셀룰로오스를 단기간에 대량으로 얻을 수 있는 것이 밝혀졌다.

<실시예6> 박테리아 셀룰로오스의 분자량

실시예3(2)의 샘플A, B, C 및 D 및 펄프 유래 ＣＮＦ액을 시료로서 준비했다. 이들 시료를 동결건조 하고 57∼59% 수산화테트라부틸포스포늄 수용액에 가하여 35도에서 정치해서 용해시킨 후, 수산화테트라부틸포스포늄의 농도가 40∼42%(w/w), 시료의 농도가 0.2%(w/w)가 되도록 물을 가했다. 계속하여 원심분리를 함으로써 불순물을 침전시켜서 상청을 회수했다. 이 상청을 하기의 조건하에서 겔 침투 크로마토그래피에 의한 크로마토그램의 피크 톱의 유지용량을 측정했다. 동(同)상청을 동(同)조건하에서 3회 측정했다. 그 결과를 표3에 나타냄과 아울러 임의로 선택한 크로마토그램을 도8에 나타낸다.

겔 침투 크로마토그래피의 조건

기기; 고속 액체 크로마토그래프(주식회사시마즈제작소(SHIMADZU CORPORATION))

칼럼; 입자지름 9μm의 메타크릴레이트 폴리머를 충전한 내경 6.0mm 및 길이 15cm의 칼럼(ＴＳＫｇｅｌｓｕｐｅｒＡＷＭ-Ｈ; 도소사(TOSOH CORPORATION))

가드 칼럼; 내경 4.6mm, 길이 3.5cm(ＴＳＫｇｕａｒｄｃｏｌｕｍｓｕｐｅｒＡＷ-Ｈ; 도소사)

칼럼 온도; 35도

송액 속도; 0.07ｍＬ/분

샘플 주입량; 10μL

용리액; 40∼42%(w/w) 수산화테트라부틸포스포늄 수용액

용리액에 있어서의 박테리아 셀룰로오스의 종농도; 0.2%(w/w)

대조 샘플; 분자량 85.3×10⁴의 풀루란(pullulan)(ＳｈｏｄｅｘｓｔａｎｄａｒｄＰ-82)

표3 및 도8에 나타나 있는 바와 같이, 샘플A, B, C 및 D의 피크 톱의 유지용량은 평균으로 보면 각각 2.79ｍＬ, 2.81ｍＬ, 2.82ｍＬ 및 2.76ｍＬ로서, 펄프 유래 ＣＮＦ액의 3.04ｍＬ 및 풀루란의 3.24ｍＬ와 비교해서 작았다. 이 결과로부터, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스의 평균분자량은, 펄프 유래의 셀룰로오스보다 크고, 풀루란 환산으로 85.3×10⁴보다 큰 것이 밝혀졌다. 또한 표3에 나타나 있는 바와 같이, 샘플A, B, C 및 D의 피크 톱의 유지용량은, 2.737∼2.849ｍＬ의 범위이었던 것으로부터, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스를 상기한 조건하에서 겔 침투 크로마토그래피에 제공한 경우에는, 크로마토그램의 피크 톱의 유지용량이 2.5ｍＬ이상 3.0ｍＬ미만이 되는 것이 밝혀졌다.

<실시예7> 박테리아 셀룰로오스의 형태

(1)섬유폭의 측정

실시예2(1)의 글리세롤 본배양배지를 사용한 교반배양 ＢＣ액 및 실시예2(2)의 믹서 처리 정치배양 ＢＣ액을 준비했다. 이들의 셀룰로오스 농도를 약 0.001%(w/w)로 조제한 후, 포름바(Formvar) 피복한 구리 그리드 상에 10μＬ씩 적하해서 바람으로 건조시켰다. 계속하여 5%(w/v) 아세트산 가돌리늄 수용액을 5μL 적하하고, 10초후에 여분의 액을 여과지로 제거함으로써 네거티브 염색했다. 투과형 전자현미경을 사용하여 가속전압 80kV, 관찰배율 30,000배로 관찰하고, 관찰 화상에 의거하여 셀룰로오스 섬유의 폭을 측정했다. 그 결과를 도9에 나타낸다.

도9에 나타나 있는 바와 같이, 셀룰로오스 섬유의 폭은 교반배양 ＢＣ액에서는 17±8nm로서, 믹서 처리 정치배양 ＢＣ액의 55±22nm와 비교해서 현저하게 작고, 또한 표준편차도 작았다. 이 결과로부터, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스는, 가늘고 섬유사이에서 폭의 편차가 작은 균일한 섬유인 것이 밝혀졌다.

(2)섬유폭의 균일성 및 응집 상태의 확인

실시예2(1)의 ＢＤＦ-Ｂ 본배양배지를 사용한 교반배양 ＢＣ액 및 실시예3(1)의 펄프 유래 ＣＮＦ액을 준비했다. 이들의 셀룰로오스 농도를 약 0.01%(w/w)로 조제한 후, 포름바 피복한 구리 그리드 상에 스프레이하고 드라이어를 사용해서 건조시키는 조작을 10회 반복해서 하였다. 계속하여 5%(w/v) 아세트산 가돌리늄 수용액을 5μL 적하하고, 여분의 액을 여과지로 제거했다. 또한 5μL의 초순수를 적하한 후에 여분의 액을 여과지로 제거하는 일련의 조작을 2회 반복해서 한 후, 바람으로 건조시킴으로써 네거티브 염색했다. 투과형 전자현미경을 사용하여 가속전압 80kV, 관찰배율 10,000배로 관찰했다. 그 결과를 도10에 나타낸다. 또한 편광현미경을 사용해서 크로스 니콜로 관찰했다. 그 결과를 도11에 나타낸다.

도10에 나타나 있는 바와 같이, 교반배양 ＢＣ액에서는 나노 스케일로 동등한 폭의 셀룰로오스 섬유가 다수 관찰된 것에 대해, 펄프 유래 ＣＮＦ액에서는 여러가지 폭의 셀룰로오스 섬유가 관찰되어, 큰 것에서는 섬유폭이 약 500nm이상의 것이 관찰되었다. 이 결과로부터, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스는 나노 스케일로 균일한 폭의 섬유인 것이 다시 확인되었다.

또한 도11에 나타나 있는 바와 같이, 펄프 유래 ＣＮＦ액에서는, 화살표로 나타내는 바와 같이 비교적 굵은 섬유가 명확하게 관찰된 것에 대해서, 교반배양 ＢＣ액에서는 점선으로 둘러싸인 부분에 어렴풋이 상이 관찰되었다. 이 결과로부터, 펄프 유래의 셀룰로오스에서는 서브 마이크로 파이버나 마이크로 파이버 등의 비교적 굵은 섬유가 존재하고 있는 것에 대해서, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)를 교반배양 함으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스는 나노 스케일로 가는 섬유가 균일하게 분산되어 있는 것이 밝혀졌다.

<실시예8> 박테리아 셀룰로오스 생산능의 평가

(1)정치배양에서의 생산능

ＬＢ배지에 있어서, 탄소원으로서 글루코오스 대신에 전처리한 ＢＤＦ-Ｂ 및 시약 글리세롤을 첨가한 것을 조제하여, ＬＢ/ＢＤＦ-Ｂ 배지 및 ＬＢ/글리세롤 배지로 했다. ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주), ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ53582주, ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｈａｎｓｅｎｉｉＡＴＣＣ23769주 및 ＧｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ700178(ＢＰＲ2001)주를 ＬＢ/글리세롤 배지 및 ＬＢ/ＢＤＦ-Ｂ 배지에 식균하여 30도에서 7일간 정치배양 함으로써 겔상막을 생성시켰다. 이것에 1%(w/v) ＮａＯＨ 수용액을 가하고 오토클레이브 처리하는 조작을 겔상막이 백색이 될 때까지 반복했다. 그 후에 물을 가하여 오토클레이브 처리하는 조작을 ｐＨ가 7이하가 될 때까지 반복하여, 정제를 하였다. 정제후에 건조시킴으로써 얻어진 박테리아 셀룰로오스의 절건중량을 측정했다. 그 결과를 도12에 나타낸다.

도12에 나타나 있는 바와 같이, Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉｉＡＴＣＣ23769주는, ＬＢ/글리세롤 배지 및 ＬＢ/ＢＤＦ-Ｂ 배지의 어디에 있어서도 박테리아 셀룰로오스의 중량이 작았다. 또한 Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ53582주 및 Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ700178(ＢＰＲ2001)주는, ＬＢ/글리세롤 배지에서는 비교적 박테리아 셀룰로오스의 중량이 컸지만, ＬＢ/ＢＤＦ-Ｂ 배지에서는 박테리아 셀룰로오스의 생산이 확인되지 않았다. 이에 대하여 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)는 ＬＢ/글리세롤 배지 및 ＬＢ/ＢＤＦ-Ｂ 배지의 어디에 있어서도 박테리아 셀룰로오스의 중량이 동등하게 컸다. 이들 결과로부터, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)는 시약 글리세롤뿐만 아니라 ＢＤＦ-Ｂ를 탄소원으로 하여도 정치배양에 의하여 효율적으로 박테리아 셀룰로오스를 생산할 수 있는 것이 밝혀졌다. ＢＤＦ-Ｂ를 탄소원으로 하여 박테리아 셀룰로오스를 생산할 수 있다고 하는 특징은, 다른 비교한 주에는 없는 특징으로서, 부산물을 이용할 수 있다고 하는 실용면에서도 유리하고 또한 생산비용 감소에도 크게 공헌하는 것이다.

(2)교반배양에서의 생산능

10ｍＬ의 ＨＳ배지에 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주), ＡＴＣＣ53582주 및 ＡＴＣＣ23769주를 식균하고, 30도에서 3일간 정치배양 함으로써 전전배양을 하였다. 계속하여 전전배양을 하여 얻어진 배양액을 10ｍＬ의 ＨＳ배지에 식균하고, 30도에서 3일간 정치배양 함으로써 전배양을 하였다. 다음에 날개 부착 삼각 플라스크에 실시예2(1)의 글리세롤 본배양배지 및 ＢＤＦ-Ｂ 본배양배지를 100mL 넣고, 각 균주에 대해 같은 균체수에 상당하는 양의 전배양액을 식균하고, 150ｒｐｍ, 30도의 조건하에서 3일간 진탕배양 함으로써 본배양을 하였다. 계속하여 본배양액중의 박테리아 셀룰로오스를 실시예2(1)에 기재되어 있는 방법에 의하여 정제했다. 다만 60도, 80ｒｐｍ으로 4∼5시간 진탕한 후, 20도에서 하룻밤 더 진탕하였다. 정제한 박테리아 셀룰로오스는 건조시켜서 절건중량을 측정했다. 그 결과를 도13에 나타낸다.

도13에 나타나 있는 바와 같이, Ｇ．ｘｙｌｉｎｕｓＡＴＣＣ53582주는, 글리세롤 본배양배지 및 ＢＤＦ-Ｂ 본배양배지의 어디에 있어서도 박테리아 셀룰로오스의 생산이 확인되지 않았다. 또한 Ｇ．ｈａｎｓｅｎｉｉＡＴＣＣ23769주는, 글리세롤 본배양배지에서는 박테리아 셀룰로오스의 절건중량이 비교적 컸지만, ＢＤＦ-Ｂ 본배양배지에서는 박테리아 셀룰로오스의 생산이 확인되지 않았다. 이에 대하여 ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)는, 글리세롤 본배양배지 및 ＢＤＦ-Ｂ 본배양배지의 어디에 있어서도 박테리아 셀룰로오스의 절건중량이 컸다. 이 결과로부터, ＮＥＤＯ-01주(Ｇ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓＳＩＩＤ9587주)는, 시약 글리세롤뿐만 아니라 ＢＤＦ-Ｂ를 탄소원으로 하여, 정치배양뿐만 아니라 교반배양에 의해서도 효율적으로 박테리아 셀룰로오스를 생산할 수 있는 것이 밝혀졌다.

Claims

세균(細菌)에 의하여 생산되고, 하기 (a)의 물성을 구비하는 박테리아 셀룰로오스;
(a)종농도(終濃度) 0.1 ± 0.006%(w/w)로 박테리아 셀룰로오스를 포함하는 물에 있어서 파장 500nm의 빛의 투과율이 35%이상.
제1항에 있어서,
하기 (b)의 물성을 구비하는 박테리아 셀룰로오스;
(b)하기 ｉ)∼ｖｉ)의 조건하에서 실시하는 겔 침투 크로마토그래피의 크로마토그램의 피크 톱의 유지용량이 2.5ｍＬ이상 3.0ｍＬ미만；
ｉ)칼럼; 입자지름 9μm의 메타크릴레이트 폴리머를 충전한 내경 6.0mm 및 길이 15cm의 칼럼
ｉｉ)가드 칼럼; 내경 4.6mm, 길이 3.5cm
ｉｉｉ)칼럼 온도; 35℃
ｉｖ)송액 속도; 0.07ｍＬ/분
ｖ)용리액(eluent); 40∼42%(w/w) 수산화테트라부틸포스포늄 수용액
ｖｉ)용리액에 있어서의 박테리아 셀룰로오스의 종농도; 0.2%(w/w).
제1항 또는 제2항에 있어서
상기 세균에 의하여, 식물유(植物油)로부터 바이오 디젤 연료를 제조할 때에 발생하는 글리세롤을 함유하는 부산물(副産物)을 자화(資化)하여 생산되는 박테리아 셀룰로오스.
제1항 또는 제2항에 있어서
상기 세균에 의하여, 설탕, 설탕을 제조할 때에 발생하는 수크로오스를 함유하는 부산물 및 이들의 가수분해물(加水分解物) 및 이성화당(異性化糖)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2 이상을 자화하여 생산되는 박테리아 셀룰로오스.
제4항에 있어서
상기 부산물이 당밀(糖蜜)인 박테리아 셀룰로오스.
제1항 내지 제5항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
상기 세균이 글루콘아세토박터 인터메디우스(Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ)인 박테리아 셀룰로오스.
제1항 내지 제5항 중의 어느 하나의 항에 있어서,
상기 세균이 글루콘아세토박터 인터메디우스(Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）ＳＩＩＤ9587주(수탁번호 ＮＩＴＥＢＰ-01495)인 박테리아 셀룰로오스.
제1항 내지 제5항 중의 어느 하나의 항에 기재된 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 세균.
제1항 내지 제5항 중의 어느 하나의 항에 기재된 박테리아 셀룰로오스를 생산하는 글루콘아세토박터 인터메디우스(Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）ＳＩＩＤ9587주(수탁번호 ＮＩＴＥＢＰ-01495).