CN107164426A - 细菌纤维素 - Google Patents
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Abstract
本发明提供在液体中的分散性高、材料应用上的成形性和与其它材料的混合性均良好、作为实用材料的应用性优异的细菌纤维素及生产该细菌纤维素的细菌。一种细菌纤维素，含有终浓度为0.1±0.006％(w/w)的细菌纤维素的水的波长500nm的光透过率为35％以上，及生产该细菌纤维素的细菌。根据本发明，可以获得均一分散在水等液体中的细菌纤维素，所述细菌纤维素由于成形性和与其它物质的混合性优异，因此可以有助于最终制品的品质和生产效率的提高、或生产成本的降低。
Description
本申请是原申请、申请日为2013年12月27日，申请号为201380068766.7，发明名称为“细菌纤维素及生产该细菌纤维素的细菌”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及细菌纤维素及生产该细菌纤维素的细菌，尤其涉及在液体中分散性优异的细菌纤维素及生产该细菌纤维素的细菌。
背景技术
细菌纤维素通常由宽度为约50nm的微细纤维(纳米纤维)构成，具有高机械强度、生物适合性、生物降解性等特性，因此作为能够用于各种产业领域的材料而受到关注。细菌纤维素通常通过对醋酸菌等细菌进行静置培养而在培养基表面以包含凝胶状物质的膜(以下称为“凝胶状膜”。)的形式而获得，但该凝胶状膜在作为材料应用时缺乏成形性、与其它物质的混合性，此外由于生产效率低而使成本变高，因此存在作为实用材料的应用性匮乏这样的问题。
对于这样的问题，期待一种非凝胶状膜、作为材料的应用性优异的、分散在液体中的细菌纤维素。例如，非专利文献1中公开了一种通过对木醋杆菌sucrofermentans亚种(Acetbacter xylinum subsp.sucrofermentans)进行通气搅拌培养而获得的细菌纤维素，此外，非专利文献2中公开了一种在添加了羧甲基纤维素(CMC)的培养基中对木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)JCM10150株进行旋转振荡培养而获得的细菌纤维素。现有技术文献非专利文献
非专利文献1：吉永等、化学和生物、Vol.35、No.11、第7～14页、1997年
非专利文献2：S.Warashina等、纤维素学会第17次大会2010cellulose R&D讲演要旨集、第98页、2010年
发明内容
发明要解决的课题
但是，从并非使用添加了具有细菌纤维素的分散性提高效果的CMC的培养基而生产、以及在水中分散为“小的粒状或纤维状”(同一文献；第9页右栏)的记载可知，非专利文献1所述的细菌纤维素在水中的分散性并不高。因此，在用于实用化的成形性、与其它物质的混合性方面并不充分。此外，非专利文献2所述的细菌纤维素在向CMC培养基的添加量为0.5％、1％、2％时，任一情况下，含有该细菌纤维素的水均是下部的白浊性高于上部、观察到沉淀，并且纤维素粒子为能够目视辨认的程度的大小(同一文献；Fig.1)，因此在水中的分散性不高。因此，在实用化中所必须的成形性、与其它物质的混合性方面并不充分。
因此，非专利文献1及非专利文献2任一文献中所述的细菌纤维素作为材料的成形性、与其它材料的混合性均不充分，在材料的生产效率方面也缺乏实用性。
本发明是为了解决这样的问题而做出的发明，其目的在于提供一种在液体中的分散性高、实用化中的成形性和与其它材料的混合性均良好、作为实用材料的应用性优异的细菌纤维素及生产该细菌纤维素的细菌。用于解决课题的手段
本发明人进行了深入研究，结果发现，如下获得的细菌纤维素在水中具有高分散性，由此完成了下述各发明：所述细菌纤维素通过将作为新的菌株的SIID9587株(保藏号NITE BP-01495)(以下，有时称为“NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)”。)在含CMC的培养基中搅拌培养而获得，所述SIID9587株以由植物油制造生物柴油燃料时产生的含甘油的副产物(Bio Diesel Fuel By-product；BDF-B、废甘油)、试剂甘油或糖蜜为碳源的中间葡糖醋杆菌。
(1)本发明的细菌纤维素具有如下物性：含有终浓度为0.1±0.006％(w/w)的细菌纤维素的水的波长500nm的光透过率为35％以上。
(2)本发明的细菌纤维素进而具有如下物性：在下述i)～vi)的条件下进行的凝胶渗透色谱的色谱图的峰顶(ピ一クトツプ)的保留体积为2.5mL以上且小于3.0mL。
i)柱：填充有粒径为9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的内径为6.0mm及长度为15cm的柱、ii)保护柱：内径为4.6mm、长度为3.5cm、iii)柱温度：35℃、iv)送液速度：0.07mL/分钟、v)洗脱液：40～42％(w/w)四丁基氢氧化磷水溶液、vi)洗脱液中的细菌纤维素的终浓度：0.2％(w/w)。
(3)本发明的细菌纤维素，优选将BDF-B同化而生产。
(4)本发明的细菌纤维素，优选将选自砂糖、制造砂糖时产生的含有蔗糖的副产物及它们的水解物、以及异构化糖中的1或2种以上同化而生产。
(5)本发明的细菌纤维素是将制造砂糖时产生的含有蔗糖的副产物同化而生产的情况下，前述副产物优选为糖蜜。
(6)本发明的细菌纤维素也可以利用中间葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterintermedius)而生产。
(7)本发明的细菌纤维素也可以利用中间葡糖醋杆菌SIID9587株(NEDO-01株)(保藏号NITE BP-01495)而生产。
(8)本发明的细菌的特征在于，生产前述(1)～(5)中任一项所述的细菌纤维素。
(9)本发明的细菌也可以是生产前述(1)～(5)中任一项所述的细菌纤维素的中间葡糖醋杆菌SIID9587株(NEDO-01株)(保藏号NITE BP-01495)。
发明的效果
根据本发明的细菌纤维素，可以获得几乎均一分散在水等液体中的细菌纤维素，该细菌纤维素由于成形性、与其它物质的混合性优异，因此可以有助于最终制品的品质、生产效率的提高或生产成本的降低。此外，根据本发明，可以获得无需利用混合器进行微细化等工序而通过温和条件下的精制即可几乎均一地分散在液体中的细菌纤维素，可以获得具有较大的平均分子量的细菌纤维素。进而，根据本发明，通过利用BDF-B、糖蜜等制造砂糖时产生的含有蔗糖的副产物作为碳源，有助于资源的有效利用且可以实现细菌纤维素的低价格化。此外，根据本发明还使用中间葡糖醋杆菌或中间葡糖醋杆菌SIID9587株(NEDO-01株)进行生产，由此可以高效率地获得大量的细菌纤维素。
附图说明
图1是表示分离将BDF-B同化而生产细菌纤维素的细菌的步骤的图。图中，细菌纤维素简记为BC。
图2-1是示出SIID9587株和中间葡糖醋杆菌TF2株的16S rDNA碱基序列的一致点及不同点的图。图中，碱基序列的一致点用*标记来表示，不同点用方框围住来表示。此外，图中，G.intermedius表示中间葡糖醋杆菌TF2株。
图2-2为示出SIID9587株和中间葡糖醋杆菌TF2株的16S rDNA碱基序列的一致点及不同点的图。图中，碱基序列的一致点用*标记来表示，不同点用方框围住来表示。此外，图中，G.intermedius表示中间葡糖醋杆菌TF2株。
图3是示出SIID9587株的细菌学性状的图。
图4是示出对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行静置培养而获得的细菌纤维素(上段图)、以及将BDF-B及试剂甘油作为碳源进行通气搅拌培养而获得的生产物(中段图及下段图)的IR谱图的图。
图5是示出分别包含对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行通气搅拌培养及进行静置培养而获得的细菌纤维素(左图及中央图)、以及来自纸浆的细菌纤维素纳米纤维(右图)的水的外观的图。
图6是示出含有分别将糖蜜及试剂甘油作为碳源对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行通气搅拌培养而获得的细菌纤维素的水的波长500nm的光透过率以及细菌纤维素的生产量(BC生产量)及生产速度(BC生产速度)的图。
图7是示出含有对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)、以及作为已知的细菌纤维素生产菌的汉森葡糖醋杆菌(G.hansenii)ATCC23769株、木葡糖醋杆菌(G.xylinus)ATCC53582株、木葡糖醋杆菌ATCC700178(BPR2001)株、木葡糖醋杆菌JCM10150株、中间葡糖醋杆菌DSM11804株及木葡糖醋杆菌KCCM40274株进行通气搅拌培养而获得的细菌纤维素的水的波长500nm的光透过率、以及BC生产量、BC生产速度及BC生产速度的比率的图。
图8是示出将BDF-B作为碳源对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行旋转培养的而获得的细菌纤维素(样品B)、来自纸浆的纤维素纳米纤维(来自纸浆的CNF液)及普鲁兰多糖的凝胶渗透色谱的色谱图的图。
图9是示出对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行通气搅拌培养(搅拌培养BC液)及静置培养(混合器处理静置培养BC液)而获得的细菌纤维素的纤维宽度及利用透射型电子显微镜获得的观察图像的图。
图10为示出对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行通气搅拌培养而获得的细菌纤维素(搅拌培养BC液)及来自纸浆的纤维素纳米纤维(来自纸浆的CNF液)的利用透射型电子显微镜获得的观察图像的图。
图11为示出对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行通气搅拌培养而获得的细菌纤维素(搅拌培养BC液)及来自纸浆的纤维素纳米纤维(来自纸浆的CNF液)的利用偏光显微镜获得的观察图像的图。
图12为示出将试剂甘油或BDF-B作为碳源对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)以及作为已知的细菌纤维素生产菌的汉森葡糖醋杆菌ATCC23769株、木葡糖醋杆菌ATCC53582株及木葡糖醋杆菌ATCC700178(BPR2001)株进行静置培养而获得的细菌纤维素的重量的图。
图13为示出将试剂甘油或BDF-B作为碳源对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)以及作为已知的细菌纤维素生产菌的ATCC53582株及ATCC23769株进行振荡培养而获得的细菌纤维素的重量的图。
具体实施方式
以下，对本发明的细菌纤维素及生产该细菌纤维素的细菌进行详细说明。本发明中的细菌纤维素是指利用细菌生产的纤维素。
本发明中，细菌纤维素“分散”在水等液体中是指，细菌纤维素漂浮或悬浮在液体中。此外，分散性高是指，作为分散介质的细菌纤维素在液体中的粒径、纤维宽度较小、作为分散介质的细菌纤维素较均一地漂浮或悬浮在液体中等。
本发明的细菌纤维素具有几乎均一地分散在液体中的程度的高分散性。这里，使细菌纤维素分散的液体可以使用有机溶剂及水系溶剂中的任一种，优选水系溶剂。
细菌纤维素的分散性的高低例如可以测定光透过率作为指标，存在光透过率越大则分散性越高、光透过率越小则分散性越低这样的关系。光透过率可以通过将含有规定浓度的细菌纤维素的水供于分光光度计并照射规定波长的光、对透过的光的量进行测定而求出。
本发明的细菌纤维素具有如下性质：含有终浓度为0.1±0.006％(w/w)的细菌纤维素的水的波长500nm的光透过率为35％以上。这里，作为本发明中的含有终浓度为0.1±0.006％(w/w)的细菌纤维素的水的波长500nm的光透过率，除了为35％以上，还可以列举例如36％以上、37％以上、38％以上、39％以上、40％以上、35％以上且99％以下，36％以上且99％以下，37％以上且99％以下，38％以上且99％以下，40％以上且99％以下，35％以上且95％以下，36％以上且95％以下，37％以上且95％以下，38％以上且95％以下，40％以上且95％以下，35％以上且90％以下，36％以上且90％以下，37％以上且90％以下，38％以上且90％以下，40％以上且90％以下，35％以上且85％以下，36％以上且85％以下，37％以上且85％以下，38％以上且85％以下，40％以上且85％以下，35％以上且80％以下，36％以上且80％以下，37％以上且80％以下，38％以上且80％以下，40％以上且80％以下等。
此外，本发明的细菌纤维素可以具有与来自纸浆的纤维素纳米纤维等来自植物的纤维素相比大的平均分子量。纤维素的平均分子量可以例如测定凝胶渗透色谱的色谱图作为指标，存在所述色谱图的峰顶的保留体积越大则平均分子量越小、保留体积越小则平均分子量越大这样的关系。即，本发明的细菌纤维素还可以具有如下物性：在下述i)～vi)的条件下进行的凝胶渗透色谱的色谱图的峰顶的保留体积为2.5mL以上且小于3.0mL。i)柱为填充有粒径为9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的内径为6.0mm及长度为15cm的柱、ii)保护柱的内径为4.6mm、长度为3.5cm、iii)柱温度为35℃、iv)送液速度为0.07mL/分钟、v)洗脱液为40～42％(w/w)四丁基氢氧化磷水溶液、vi)洗脱液中的细菌纤维素的终浓度为0.2％(w/w)。
此外，本发明的细菌纤维素例如可以通过在含有适当碳源的培养基中培养细菌使其生产细菌纤维素而制造。
这里，作为碳源，可以列举例如葡萄糖、果糖等单糖，蔗糖、麦芽糖、乳糖等二糖，低聚糖、砂糖、制造砂糖时产生的含有蔗糖的副产物、它们的水解物、异构化糖、淀粉水解物等糖类以及甘露糖醇、乙醇、乙酸、柠檬酸、甘油、BDF-B等，可以根据细菌的种类、培养条件、制造成本等适当设定。予以说明的是，BDF-B的常规组成是甘油41.5％、脂肪酸21.4％、甲醇12.4％、强热残留成分6.3％、其它18.4％(财团法人日本食品分析中心)，是大量地含有能够用作细菌的碳源的甘油的组合物。
这里，砂糖是指以蔗糖为主成分的甘味料(广辞苑第6版)，在本发明中既可以是化学合成品，也可以是以甘蔗、甜菜(糖萝卜)、糖槭、桄榔(sugar palm)、高粱(sweet sorghum)等天然物质为原料而制造的砂糖。作为本发明中的砂糖，可以列举例如红糖、白糖、粗糖(cassonade)(红糖)、和三盆、枫糖等未分蜜糖以及粗糖、精制糖等分蜜糖。作为精制糖，可以列举例如白双糖(shirozara sugar)、粗晶软糖(coarse crystal medium soft sugar)、细白砂糖(caster sugar)等砂糖，上白糖、幼砂糖等绵白糖(soft sugar)，方糖、冰糖、粉砂糖、颗粒糖等加工糖以及液体糖等。
此外，制造砂糖时产生的含有蔗糖的副产物是指，在砂糖的制造工序中产生的副产物中的含有蔗糖的副产物，具体而言，可以列举例如上述的甘蔗、甜菜等天然原料的榨渣、糖蜜、利用过滤和/或离子交换树脂进行的精制工序中产生的残渣。
此外，二糖、低聚糖、砂糖、制造砂糖时产生的含有蔗糖的副产物的水解物是指，在酸性溶液中对二糖、低聚糖、砂糖、制造砂糖时产生的含有蔗糖的副产物进行加热等水解处理而获得的物质。
碳源以外的培养基成分可以使用与细菌培养中使用的公知的培养基同样的成分，优选含有CMC。具体而言，可以列举例如含有CMC、氮源、无机盐类、以及根据需要而含有的氨基酸、维生素等有机微量营养素的常规营养培养基，作为氮源，可以列举硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等铵盐，硝酸盐、尿素、蛋白胨等有机或无机的氮源。此外，作为无机盐类，可以列举磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等，作为有机微量营养素，可以列举氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、以及包含这些营养素的蛋白胨、水解酪蛋白氨基酸、酵母提取物、大豆蛋白水解物等，在使用生育中需要氨基酸的营养要求性变异株时，还可以进一步补充所要求的营养素。
此外，作为细菌，只要是能生产细菌纤维素的细菌则没有特别限定，优选可以通过搅拌培养、通气培养生产细菌纤维素的细菌，更优选同化BDF-B的细菌。具体而言，可以列举例如醋杆菌属细菌、葡糖醋杆菌属细菌、假单胞菌属细菌、土壤杆菌属细菌、根瘤菌属细菌、肠杆菌属细菌等，更具体而言，可以列举中间葡糖醋杆菌、汉森葡糖醋杆菌、斯氏葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter swingsii)、巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)、醋化醋杆菌(Acetobacter aceti)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、木醋杆菌sucrofermentans亚种(Acetbacter xylinum subsp.sucrofermentans)、木醋杆菌nonacetoxidans亚种(Acetbacter xylinum subsp.nonacetoxidans)、恶臭醋杆菌(Acetobacter ransens)、胃八叠球菌(Sarcina ventriculi)、Bacterium xyloides、肠杆菌等，这些之中，优选中间葡糖醋杆菌。进而，更具体而言，可以列举中间葡糖醋杆菌SIID9587株(NEDO-01株)(保藏号NITE BP-01495)、木葡糖醋杆菌ATCC53582株、汉森葡糖醋杆菌ATCC23769株、木葡糖醋杆菌ATCC700178(BPR2001)株、斯氏葡糖醋杆菌BPR3001E株、木醋杆菌JCM10150株、肠杆菌CJF-002株等，这些之中，优选中间葡糖醋杆菌SIID9587株(NEDO-01株)(保藏号NITE BP-01495)。
作为培养方法，可以列举例如搅拌培养、通气培养等。作为搅拌培养，具体而言，可以列举使用了发酵罐的不进行通气的培养(无通气搅拌培养)、使用了发酵罐的进行通气的培养(通气搅拌培养)、使用了带桨叶的烧瓶的左右摇动的培养(振荡培养)、使用了带桨叶的烧瓶的旋转式培养(旋转培养)等。此外，培养条件可以设定为上述细菌的培养中所使用的公知的培养条件，可以列举例如通气量为1～10L/分钟、转速为100～800rpm、温度为20～40℃、培养期为1天～7天的培养条件。
此外，在本发明的细菌纤维素的制造中，可以根据需要进行碳源的前处理工序、前前培养工序、前培养工序、细菌纤维素的精制、干燥、悬浮工序等。
本发明的细菌纤维素例如可以作为纸力增强剂、食品的增稠剂、悬浮稳定化剂等添加剂而使用。
其次，本发明的细菌是生产前述细菌纤维素的细菌。对于在生产本发明的细菌纤维素的细菌中，与上述的本发明的细菌纤维素相同或相当的构成将省略重复说明。
以下，对本发明的细菌纤维素及生产该细菌纤维素的细菌的各实施例进行说明。予以说明的是，本发明的技术范围不受这些实施例所示特征的限定。
实施例
<实施例1>细菌的分离及鉴定
(1)细菌的分离
对同化了BDF-B而生产细菌纤维素的细菌进行了分离。具体而言，按照图1所示的步骤，首先，以苹果及西梅为分离源，使用在Hestrin-Schramm标准培养基(组成：细菌蛋白胨0.5％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、Na2HPO40.27％(w/v)、柠檬酸0.115％(w/v)、葡萄糖2％(w/v)；HS培养基)中含有2％(w/v)的试剂甘油(试剂特级、和光纯药株式会社)来代替葡萄糖的培养基(HS/甘油培养基)进行富集培养。将其接种在含有纤维素染色试剂的HS/甘油培养基中，在30℃下进行平板培养，选择出15种生产细菌纤维素的菌株。然后，将这些菌株接种到含有2％(w/v)的试剂甘油(试剂特级、和光纯药株式会社)的LB培养基(组成；胰蛋白胨1％(w/v)、酵母提取物0.5％(w/v)、氯化钠0.5％(w/v))中，在30℃下静置培养，使其生成凝胶状膜。测定凝胶状膜的干燥重量(以下称为“干燥膜重量”。)，选择出8种干燥膜重量大的菌株，作为同化甘油且细菌纤维素生产能力高的菌。然后，接种到含有BDF-B的LB培养基中，在30℃下进行平板培养，进而，接种到HS培养基中，在30℃下进行静置培养，从而使其生成凝胶状膜。选择其中干燥膜重量大的菌株，用含有甘油的LB培养基或HS/甘油培养基进行平板培养后，用HS培养基反复进行静置培养操作，选定一种具有BDF-B同化性、且细菌纤维素生产能力高的菌株，将其作为SIID9587株。
(2)细菌的鉴定
按照常规方法对本实施例1(1)的SIID9587株进行测序，确定了全长16S rDNA的碱基序列(1367bp、序列号1)。然后，在TechnoSuruga Laboratory Co.，Ltd中进行了16S rDNA碱基序列解析及细菌学性状试验。
[2-1]16S rDNA碱基序列解析
16S rDNA碱基序列解析试验使用Apollo 2.0(TechnoSuruga Laboratory社)作为软件、使用Apollo DB-BA 6.0(TechnoSuruga Laboratory社)及国际碱基序列数据库(GenBank/DDBJ/EMBL)作为数据库而进行。相对于Apollo DB-BA6.0的同源性检索的结果，SIID9587株的16S rDNA碱基序列(序列号1)相对于葡糖醋杆菌属的16S rDNA碱基序列显示高同源性，相对于中间葡糖醋杆菌TF2株(登录号Y14694)的16S rDNA碱基序列显示最高同源性，同源率为99.8％。此外，在相对于GenBank/DDBJ/EMBL的同源性检索的结果中，SIID9587株的16S rDNA碱基序列(序列号1)也相对于葡糖醋杆菌属的16S rDNA碱基序列显示出高同源性，相对于基准株的中间葡糖醋杆菌TF2株(登录号NR_026435)的16S rDNA碱基序列显示高同源性，同源率为99.8％。予以说明的是，登录号Y14694的序列和登录号NR_026435的序列相同。SIID9587株和中间葡糖醋杆菌TF2株(登录号Y14694、NR_026435)的16SrDNA碱基序列较结果如图2-1及图2-2所示。如图2-1及图2-2所示，两者间有4个碱基不同。此外，在相对于ApolloDB-BA6.0的同源性检索中，在基于同源性高的排在前面的15株的16SrDNA碱基序列的简易分子系统解析的结果中，SIID9587株包含在由葡糖醋杆菌属中的种形成的簇内。
[2-2]细菌学性状试验
细菌学性状试验的结果如图3所示。如图3所示，SIID9587株在含5％乙酸的培养基中不生育，这一点与已知的中间葡糖醋杆菌的性状不同，其它性状一致(BRENNER等、Bergey’s manual of Systematic Bacteriology.Vol.Two.The Proteobacteria，Part CTheAlpha-，Beta-，Delta-，and Epsilonproteobacteria.2005.Springer.p72-77)。
从以上的本实施例1(2)[2-1]及[2-2]的结果可知，SIID9587株属于中间葡糖醋杆菌。另一方面，如上所述，SIID9587株和作为中间葡糖醋杆菌的基准株的中间葡糖醋杆菌TF2株之间，16S rDNA碱基序列及细菌学性状方面存在不同点，因此可知，SIID9587株是中间葡糖醋杆菌的新菌株。因此，将该菌株于平成24年(2012年)12月21日保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利微生物保藏中心(NITE-IPOD；日本国千叶县木更津市上总镰足2-5-8 122号室)，保藏号为NITE BP-01495。以下，将该中间葡糖醋杆菌SIID9587株(保藏号NITE BP-01495)称为NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)。
(3)生产物的确认
进行NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)的前培养，使菌体增殖。然后，将进行前培养而获得的培养液(前培养液)加入到HS培养基(碳源：葡萄糖)中，在30℃下进行约8天静置培养，由此进行主培养，使其在培养基表面生成凝胶状膜。对凝胶状膜，按照常规方法得到红外分光法(IR)的谱图及X射线衍射图并进行解析。由其结果可知，凝胶状膜为具有I型晶体结构的纤维素。此外，按照常规方法得到扫描型电子显微镜图像并进行了解析，结果表明，凝胶状膜中，纳米级的宽度的纤维素纤维(纤维素纳米纤维)形成了网络结构。由这些结果可确认NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)生产纤维素。
<实施例2>通气搅拌培养所产生的生产物的评价
(1)通气搅拌培养所产生的生产物的调制
对BDF-B进行中和处理，进而进行高压釜处理，由此获得经过了前处理的BDF-B。
调制了在含2％(w/v)的CMC(化学用、和光纯药株式会社)的HS培养基中添加试剂甘油(试剂特级、和光纯药株式会社)代替葡萄糖作为碳源的培养基、及在其中添加浓度为2％(w/v)的经过了前处理的BDF-B代替葡萄糖作为碳源的培养基，分别作为甘油主培养培养基及BDF-B主培养培养基。然后，首先进行NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)的前培养，使菌体增殖。然后，将前培养液分别接种到5L的甘油主培养培养基及BDF-B主培养培养基中，使用发酵罐在通气量为7～10L/分钟、转速为200～800rpm、温度为30℃的条件下进行通气搅拌培养4天，由此进行主培养。在进行主培养而获得的培养液(主培养液)中加入1％(w/v)NaOH水溶液，在60℃、80rpm下振荡4～5小时，由此溶解菌体。将其供于离心分离后，除去上清，回收沉淀物，由此除去水溶性的菌体成分。在其中加入超纯水进行离心分离后除去上清，将该操作反复进行至湿润状态下沉淀物的pH达到7以下，由此对生产物进行精制，将其作为搅拌培养BC液。
(2)利用静置培养调制细菌纤维素
通过实施例1(3)所述的方法获得凝胶状膜，裁切为约1cm×1cm的大小。然后，加入1％(w/v)NaOH水溶液，在60℃、80strokes/分钟下振荡4～5小时后，在20℃下振荡一晚。使用金属网进行过滤，由此除去液体而回收凝胶状膜。在其中加入超纯水并在20℃下振荡一晚，将该操作反复进行至pH达到7以下，由此进行精制后，使用混合器进行数分钟的悬浮处理，将其作为混合器处理静置培养BC液。
(3)解析
将本实施例2(1)的搅拌培养BC液及本实施例2(2)的混合器处理静置培养BC液分别滴加到硅板上并干燥后，将其供于红外分光光度计(FT/IR-4200、日本分光株式会社)，在累计次数32次、分辨率2cm-1或4cm-1下进行测定，获得IR谱图。其结果如图4所示。如图4所示，使用BDF-B主培养培养基及甘油主培养培养基而获得的搅拌培养BC液的IR谱图与混合器处理静置培养BC液的IR谱图为同样形状。由该结果可确认，以BDF-B、试剂甘油为碳源对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行搅拌培养而获得的生产物为纤维素。
<实施例3>细菌纤维素在水中的分散性
(1)含细菌纤维素的水的外观
准备使用了实施例2(1)的BDF-B主培养培养基的搅拌培养BC液及实施例2(2)的混合器处理静置培养BC液。此外，将市售的来自纸浆的纤维素纳米纤维添加到水中并使其分散，将其作为来自纸浆的CNF液。将搅拌培养BC液、混合器处理静置培养BC液及来自纸浆的CNF液静置1天后观察外观。其结果如图5所示。
如图5所示，来自纸浆的CNF液观察到了纤维素的沉淀。此外，混合器处理静置培养BC液观察到了块状的细菌纤维素，细菌纤维素的分散状态不均一。与此相对地，搅拌培养BC液未观察到沉淀、块状的细菌纤维素，观察到细菌纤维素均一地分散的样子。由这些结果可知，对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行搅拌培养而获得的细菌纤维素与来自纸浆的纤维素纳米纤维、对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行静置培养而获得的细菌纤维素相比分散性高，在水等液体中均一地分散。
(2)含细菌纤维素的水的光透过率
[2-1]静置培养的细菌纤维素及来自纸浆的纤维素的比较
在实施例2(1)所述的方法中，在主培养中，使用带桨叶的烧瓶代替发酵罐，在150rpm、温度为30℃的条件下进行3天旋转培养，调制搅拌培养BC液，将其作为样品A(使用了甘油主培养培养基)及样品B(使用了BDF-B主培养培养基)。此外，将使用了实施例2(1)的BDF-B主培养培养基的搅拌培养BC液作为样品C、将使用了甘油主培养培养基的搅拌培养BC液作为样品D。此外，分别准备了实施例2(2)的混合器处理静置培养BC液及实施例3(1)的来自纸浆的CNF液。将它们的纤维素终浓度调制为0.1±0.006％(w/w)后，在比色皿中分别加入1mL，供于分光光度计(U-2001型双光束分光光度计、株式会社日立制作所)，测定波长500nm的光透过率。比色皿使用聚苯乙烯制一次性比色皿(半微量、光路长10mm、光路宽度4mm)，参比使用超纯水。其结果如表1所示。
[表1]
如表1所示，样品A、B、C及D的透过率分别为74.75％、70.53％、63.82％及49.66％，与混合器处理静置培养BC液的19.19％及来自纸浆的CNF液的12.72％相比显著大，在大约40％以上且80％以下的范围。
[2-2]培养基中有无CMC的比较
在实施例2(1)所述的方法中，分别使用含2％(w/v)CMC的HS培养基和不含CMC的HS培养基获得搅拌培养BC液。其中，使用糖蜜代替葡萄糖来作为碳源。此外，使用糖蜜作为碳源时，在主培养第3天，培养基中的碳源几乎变没，因此将主培养的天数设为3天，来代替4天。然后，根据本实施例3(2)[2-1]所述的方法测定了含细菌纤维素的水的光透过率。其结果如下述表2所示。
[表2]
| 培养基中的CMC | 培养方法 | 碳源 | 透过率(％) |
| 含 | 搅拌培养 | 糖蜜 | 57 |
| 不含 | 搅拌培养 | 糖蜜 | 18 |
如表2所示，使用含CMC的HS培养基时的透过率为57％，与此相对，使用不含CMC的HS培养基时的透过率为18％。
由以上的本实施例3(2)[2-1]及[2-2]的结果可知，含有终浓度为0.1±0.006％(w/w)的、用含CMC的培养基对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行搅拌培养而获得的细菌纤维素的水的波长500nm的光透过率为40％以上且80％以下。由此可知，通过用含CMC的培养基对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行搅拌培养，从而获得了在液体中的分散性显著高、在液体中均一地分散的细菌纤维素。
<实施例4>碳源不同的情况下的透过率及细菌纤维素的生产速度的比较
利用实施例2(1)所述的方法获得搅拌培养BC液。其中，使用糖蜜及试剂甘油代替葡萄糖来作为碳源。此外，使用糖蜜作为碳源时，将主培养的天数设为3天，来代替4天。然后，利用实施例3(2)[2-1]所述的方法测定含细菌纤维素的水的光透过率。此外，将搅拌培养BC液干燥，测定细菌纤维素的绝干重量，基于测定结果算出每1L培养基的细菌纤维素的浓度，将其作为细菌纤维素的生产量(BC生产量、g/L)。此外，算出将BC生产量除以主培养的天数而得的值，将其作为细菌纤维素的生产速度(BC生产速度、g/L/天)。其结果如图6所示。
如图6的表及左侧的棒图所示，使用糖蜜作为碳源时的透过率为57％，与使用试剂甘油作为碳源时的57％为相同的值。由该结果可知，通过以糖蜜作为碳源对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行培养，与以试剂甘油作为碳源时同样地获得了含有终浓度为0.1±0.006％(w/w)的细菌纤维素的水的波长500nm的光透过率显著高的细菌纤维素。由此表明，通过将糖蜜作为碳源对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行培养，由此可获得分散性高、在液体中均一地分散的细菌纤维素。
此外，如图6的表及右侧的棒图所示，将糖蜜作为碳源时，BC生产速度为1.48g/L/天，比以试剂甘油为碳源时的0.95g/L/天大约1.5倍。由该结果可知，通过将糖蜜作为碳源对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行培养，由此可在短时间内大量获得分散性高的细菌纤维素。
<实施例5>细菌不同的情况下的透过率及细菌纤维素生产速度的比较
利用实施例2(1)所述的方法获得搅拌培养BC液。其中，使用糖蜜代替葡萄糖来作为碳源。此外，作为细菌，分别使用了NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)以及作为已知的细菌纤维素生产菌的汉森葡糖醋杆菌ATCC23769株、木葡糖醋杆菌ATCC53582株、木葡糖醋杆菌ATCC700178(BPR2001)株、木葡糖醋杆菌JCM10150株、中间葡糖醋杆菌DSM11804株及木葡糖醋杆菌KCCM40274株。此外，使用NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)时，在主培养的第3天，培养基中的碳源几乎变没，因此将主培养的天数设为3天，来代替4天。另一方面，使用DSM11804株时，在主培养的第4天，培养基中的碳源的减少程度还很小，因此将主培养的天数设为5天，来代替4天。然后，利用实施例3(2)[2-1]所述的方法测定含细菌纤维素的水的光透过率。此外，利用实施例4所述的方法算出BC生产量(g/L)及BC生产速度(g/L/天)，对于透过率及BC生产速度其数值示于棒图中。其结果如图7所示。
如图7的表及左侧的棒图所示，使用NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)时的透过率为57％，与此相对地，使用汉森葡糖醋杆菌ATCC23769株、木葡糖醋杆菌ATCC53582株、木葡糖醋杆菌ATCC700178(BPR2001)株、木葡糖醋杆菌JCM10150株、中间葡糖醋杆菌DSM11804株及木葡糖醋杆菌KCCM40274株时的透过率分别为20％、33％、29％、27％、9％及13％。由该结果可知，含有终浓度为0.1±0.006％(w/w)的、培养NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)而获得的细菌纤维素的水的波长500nm的光透过率比培养NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)以外的菌株而获得的含细菌纤维素的水的该透过率显著大，为35％以上。由此可知，通过对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行培养，由此可以获得分散性高、在液体中均一地分散的细菌纤维素。
此外，如图6的表及右侧的棒图所示，使用NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)时的BC生产速度为1.48g/L/天，与此相对地，使用汉森葡糖醋杆菌ATCC23769株、木葡糖醋杆菌ATCC53582株、木葡糖醋杆菌ATCC700178(BPR2001)株、木葡糖醋杆菌JCM10150株、中间葡糖醋杆菌DSM11804株及木葡糖醋杆菌KCCM40274株时的BC生产速度分别为1.05g/L/天、1.03g/L/天、1.11g/L/天、1.10g/L/天、0.42g/L/天及0.43g/L/天。即，使用NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)时的BC生产速度显著大于使用NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)以外的菌株时的BC生产速度。该结果表明，通过对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行培养，由此可以在短时间内大量获得分散性高的细菌纤维素。
<实施例6>细菌纤维素的分子量
准备实施例3(2)的样品A、B、C及D以及来自纸浆的CNF液作为试样。将这些试样冷冻干燥，加入57～59％四丁基氢氧化磷水溶液，在35℃下静置溶解，然后加入水，使四丁基氢氧化磷的浓度为40～42％(w/w)、试样的浓度为0.2％(w/w)。然后进行离心分离而使杂质沉淀，回收上清。将该上清在下述条件下供于凝胶渗透色谱，测定色谱图的峰顶的保留体积。同一上清在同一条件下测定3次。其结果如表3所示，且随机选择的色谱图如图8所示。
凝胶渗透色谱的条件
机器：高效液相色谱(株式会社岛津制作所)
柱：填充有粒径为9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的内径为6.0mm及长度为15cm的柱(TSKgel superAWM-H：东曹公司)
保护柱：内径为4.6mm、长度为3.5cm(TSK guardcolum superAW-H：东曹公司)
柱温度：35℃
送液速度：0.07mL/分钟
样品注入量：10μL
洗脱液：40～42％(w/w)四丁基氢氧化磷水溶液
洗脱液中的细菌纤维素的终浓度：0.2％(w/w)
对照样品：分子量为85.3×104的普鲁兰多糖(Shodex standard P-82)
[表3]
如表3及图8所示，样品A、B、C及D的峰顶的保留体积以平均计分别为2.79mL、2.81mL、2.82mL及2.76mL，小于来自纸浆的CNF液的3.04mL及普鲁兰多糖的3.24mL。该结果表明，对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行搅拌培养而获得的细菌纤维素的平均分子量大于来自纸浆的纤维素，以普鲁兰多糖换算大于85.3×104。此外，如表3所示，样品A、B、C及D的峰顶的保留体积在2.737～2.849mL的范围，因此表明在将对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行搅拌培养而获得的细菌纤维素在上述条件下供于凝胶渗透色谱时，色谱图的峰顶的保留体积为2.5mL以上且小于3.0mL。
<实施例7>细菌纤维素的形态
(1)纤维宽度的测定
准备使用了实施例2(1)的甘油主培养培养基的搅拌培养BC液及实施例2(2)的混合器处理静置培养BC液。将它们的纤维素浓度调制为约0.001％(w/w)后，分别将10μL滴加到包覆有聚乙烯醇缩甲醛(福姆瓦)的铜网上并风干。然后，滴加5μL5％(w/v)醋酸钆水溶液，10秒后用滤纸除去多余的液体，由此进行负染色。使用透射型电子显微镜在加速电压为80kV、观察倍率为30000倍条件下观察，基于观察图像测定纤维素纤维的宽度。其结果如图9所示。
如图9所示，对于搅拌培养BC液，其纤维素纤维的宽度为17±8nm，与混合器处理静置培养BC液的纤维素纤维的宽度55±22nm相比显著小，且标准偏差也小。由该结果可知，对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行搅拌培养而获得的是细菌纤维素细、纤维间的宽度偏差小的均一的纤维。
(2)纤维宽度的均一性及聚集状态的确认
准备使用了实施例2(1)的BDF-B主培养培养基的搅拌培养BC液及实施例3(1)的来自纸浆的CNF液。将它们的纤维素浓度调制为约0.01％(w/w)后，将喷雾到包覆有聚乙烯醇缩甲醛的铜网上并用干燥器使其干燥的操作反复进行10次。然后，滴加5μL5％(w/v)醋酸钆水溶液，用滤纸除去多余的液体。进而，将滴加5μL的超纯水后用滤纸除去多余的液体的一系列操作反复进行2次，然后风干，由此进行负染色。使用透射型电子显微镜，在加速电压为80kV、观察倍率为10000倍的条件下观察。其结果如图10所示。此外，使用偏光显微镜通过正交尼科尔棱镜进行了观察。其结果如图11所示。
如图10所示，对于搅拌培养BC液观察到较多的纳米级的同等宽度的纤维素纤维，与此相对地，对于来自纸浆的CNF液则观察到各种宽度的纤维素纤维，在较大的纤维中观察到了纤维宽度为约500nm以上的纤维。由该结果再次确认了对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行搅拌培养而获得的细菌纤维素为纳米级的宽度均一的纤维。
此外，如图11所示，如箭头标记所示，在来自纸浆的CNF液中明确观察到较粗的纤维，与此相对地，对于搅拌培养BC液，在用虚线包围的部分观察到模糊地影像。由该结果可知，对于来自纸浆的纤维素，存在亚微纤维(Submicrofiber)、微纤维等较粗的纤维，而对NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)进行搅拌培养而获得的细菌纤维素为纳米级的细纤维均一地分散着。
<实施例8>细菌纤维素生产能力的评价
(1)静置培养中的生产能力
调制在LB培养基中添加了经过了前处理的BDF-B及试剂甘油代替葡萄糖来作为碳源的培养基，作为LB/BDF-B培养基及LB/甘油培养基。将NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)、木葡糖醋杆菌ATCC53582株、汉森葡糖醋杆菌ATCC23769株及木葡糖醋杆菌ATCC700178(BPR2001)株接种到LB/甘油培养基及LB/BDF-B培养基中，在30℃下进行7天静置培养，由此使其生成凝胶状膜。在其中加入1％(w/v)NaOH水溶液并进行高压釜处理，将该操作反复进行至凝胶状膜变为白色。然后，将加水进行高压釜处理的操作反复进行至pH为7以下，进行精制。精制后，测定干燥而获得的细菌纤维素的绝干重量。其结果如图12所示。
如图12所示，在LB/甘油培养基及LB/BDF-B培养基中的任一培养基中，汉森葡糖醋杆菌ATCC23769株的细菌纤维素的重量均小。此外，木葡糖醋杆菌ATCC53582株及木葡糖醋杆菌ATCC700178(BPR2001)株在LB/甘油培养基中细菌纤维素的重量较大，但在LB/BDF-B培养基中没有确认到细菌纤维素的生产。与此相对地，NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)在LB/甘油培养基及LB/BDF-B培养基中的任一培养基中细菌纤维素的重量为同等大小。这些结果表明，NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)不仅可将试剂甘油为碳源，也可将BDF-B作为碳源，通过静置培养有效地生产细菌纤维素。可将BDF-B作为碳源生产细菌纤维素的特征是其它比较株所不具有的特征，在可利用副产物的实用方面也是有利的，且非常有助于降低生产成本。
(2)搅拌培养中的生产能力
在10mL的HS培养基中接种NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)、ATCC53582株及ATCC23769株，在30℃下进行3天静置培养，由此进行前前培养。然后，将进行前前培养而获得的培养液接种在10mL的HS培养基中，在30℃下进行3天静置培养，由此进行前培养。然后，在带桨叶的三角烧瓶中装入100mL的实施例2(1)的甘油主培养培养基及BDF-B主培养培养基，对各菌株接种相当于相同菌体数的量的前培养液，在150rpm、30℃的条件下进行3天振荡培养，由此进行主培养。然后，利用实施例2(1)所述的方法对主培养液中的细菌纤维素进行精制。其中，在60℃、80rpm下振荡4～5小时后，再在20℃下振荡一晚。使精制后的细菌纤维素干燥后测定绝干重量。其结果如图13所示。
如图13所示，木葡糖醋杆菌ATCC53582株在甘油主培养培养基及BDF-B主培养培养基中的任一培养基中均没有确认到细菌纤维素的生产。此外，汉森葡糖醋杆菌ATCC23769株，在甘油主培养培养基中细菌纤维素的绝干重量较大，但在BDF-B主培养培养基中没有确认到细菌纤维素的生产。与此相对地，NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)在甘油主培养培养基及BDF-B主培养培养基中的任一培养基中，细菌纤维素的绝干重量均大。该结果表明，NEDO-01株(中间葡糖醋杆菌SIID9587株)不仅可将试剂甘油作为碳源，也可将BDF-B作为碳源，不仅可通过静置培养也可通过搅拌培养而有效地生产细菌纤维素。
Claims (4)
1.一种细菌纤维素，其利用细菌生产，具有下述(a)的物性：
(a)含有终浓度为0.1±0.006％(w/w)的细菌纤维素的水的波长500nm的光透过率为35％以上。
2.根据权利要求1所述的细菌纤维素，具有下述(b)的物性：
(b)在下述i)～vi)的条件下进行的凝胶渗透色谱的色谱图的峰顶的保留体积为2.5mL以上且小于3.0mL，
i)柱：填充有粒径为9μm的甲基丙烯酸酯聚合物的内径为6.0mm及长度为15cm的柱、
ii)保护柱：内径为4.6mm、长度为3.5cm、
iii)柱温度：35℃、
iv)送液速度：0.07mL/分钟、
v)洗脱液：40～42％(w/w)四丁基氢氧化磷水溶液、
vi)洗脱液中的细菌纤维素的终浓度：0.2％(w/w)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的细菌纤维素，为利用前述细菌由选自砂糖、制造砂糖时产生的含有蔗糖的副产物及它们的水解物、以及异构化糖的组中的1或2种以上同化而生产的。
4.根据权利要求3所述的细菌纤维素，前述副产物为糖蜜。
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