CN116240117B - 一种通过调控蛹虫草菌球形态来增强蛹虫草材料机械性能的方法和应用 - Google Patents
一种通过调控蛹虫草菌球形态来增强蛹虫草材料机械性能的方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物材料技术领域，公开一种通过调控蛹虫草菌球形态来增强蛹虫草材料机械性能的方法和应用，在蛹虫草深层液体培养的过程中，培养条件设置为蛹虫草孢子接种量的浓度为1x106、培养基pH为8和添加体积浓度2%的吐温80，60℃烘干5h，并用纯水浸泡菌膜2h，最后烘干。本发明选用真菌是蛹虫草，蛹虫草在液体深层培养中，其菌球随着培养条件的不同而呈现不同的形态，而蛹虫草的形态对于活体材料的机械性能至关重要。因此，通过改变培养条件来调控菌球形态，不需要其他昂贵和复杂的处理方法，从而增强蛹虫草活体材料的机械性能，使得蛹虫草活体生物材料有望成为新型类皮革材料，促进环境资源保护。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，尤其是一种通过调控蛹虫草菌球形态来增强蛹虫草材料机械性能的方法和应用。
背景技术
随着工业技术和市场经济的快速发展，环境污染问题日益严重。比如大多数塑料包装材料不可生物降解、不可持续，因此开发生物降解或复合稳定材料的研究越来越多，市场对绿色环保材料的需求也在不断增加。迄今为止，已经开发了一系列基于不同生物质原料的可降解材料，如纤维素、淀粉和甲壳素等。以这些基质为基础的生物基材料的发展减缓了传统石油基材料造成的环境污染。然而，这些基质的生长和发展需要水和土地，这在一定程度上造成了资源的浪费，因此，不建议频繁应用。而真菌菌丝易于培养、生长迅速、资源需求低，是多功能、易降解的生物复合材料的可持续来源，可以替代传统的石油基材料或其他生物基材料。因此，对这些低环境影响的可持续材料的需求正在增加。近年来，研究者们开始研究开发基于真菌菌丝的天然生物可降解材料，旨在利用环境资源进行绿色环保和逐步发展。
真菌菌丝是天然的、可再生的有价值的结构聚合物材料，主要由葡聚糖、蛋白质、几丁质和其他天然聚合物组成。与细菌和酵母不同，真菌作为丝状菌种，在适当的培养基中可以产生单管状菌丝，形成大面积的纤维状菌丝网状结构。该材料可用于包装材料、建筑材料、环保修复材料、耐磨材料等。菌丝基材料具有可降解、可重复利用、功能多样、安全、高效、环保等优点。以菌丝为基础的皮革替代品，比阿马杜皮革具有更好的拉伸性能和耐久性，以实现类似橡胶的力学性能。
另外，目前蛹虫草材料存在机械性能不佳的问题，即易断裂、柔韧性差。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一株通过调控蛹虫草菌球形态来增强蛹虫草材料机械性能的方法和应用。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种通过调控蛹虫草菌球形态来增强蛹虫草材料机械性能的方法，包括如下步骤：
在蛹虫草深层液体培养的过程中，培养条件设置为蛹虫草孢子接种量的浓度为1x106、培养基pH为8和添加体积浓度2%的吐温80，蛹虫草孢子在该深层液体培养的过程中形成的菌球，置于玻璃培养皿中60℃烘干5h，并用纯水浸泡菌膜2h，最后烘干20min得到蛹虫草生物材料。
进一步地，具体步骤如下：
步骤1）蛹虫草液体培养：
将蛹虫草孢子悬浮液接入灭过菌的马铃薯葡萄糖液体培养基中，使马铃薯葡萄糖液体培养基中蛹虫草孢子悬浮液终浓度达1x106个/mL，置于25°C、120 rpm的摇床中避光培养72 h，摇瓶中蛹虫草孢子萌发后菌丝缠绕成大小均匀的菌球；
2）蛹虫草基材料的制备
培养72 h后菌液经两层纱布过滤得到蛹虫草菌球，并用去离子水清洗两遍，将其取出置于玻璃培养皿中，放入60℃ 烘箱烘干5 h，再加纯水浸泡5h，取出烘干20min ，得到蛹虫草生物材料。
进一步地，所述蛹虫草为蛹虫草菌株ACCC50632，购买于信阳市中检计量生物科技有限公司，保藏于南京师范大学食品与制药工程学院。
进一步地，所述蛹虫草菌株菌丝体洁白、粗壮，上下均匀一致，生长速率快，见光后容易分泌色素，培养基表面气生菌丝较厚。
进一步地，具体步骤为：
蛹虫草在马铃薯固体培养基上活化后置于28°C培养箱培养7天，用纯水清洗培养基得到蛹虫草孢子悬浮液，用血球计数板进行计数接种；
配制马铃薯葡萄糖液体培养基，并用盐酸和氢氧化钠调节马铃薯液体培养基的pH为8，接种蛹虫草孢子悬浮液，使马铃薯葡萄糖液体培养基中孢子终浓度为1×106个/mL，加入体积浓度为2%的表面活性剂吐温80，再放入温度为25°C，转速为120rpm的摇床中培养3天；用双层纱布过滤菌液并清洗多次，得到菌球，在60°C下烘干5h，再用纯水浸泡5h，烘干20分钟，得到蛹虫草活体材料。
进一步地，所述马铃薯固体培养基的配制为：每称取200g去皮土豆切碎，放入纯水中煮沸30分钟，将土豆渣用双层纱布过滤得到滤液，加入20g葡萄糖、15g琼脂粉，定容至1升，无需调节pH，搅拌均匀后倒入蓝盖瓶，放入灭菌锅115°C，灭菌20分钟；
每1升马铃薯葡萄糖液体培养基的配制为：马铃薯浸出粉6g、葡萄糖20g，用水定容至1升，放入灭菌锅115°C，灭菌20分钟。
如上所述的方法在生物基材料制备方面中的应用。
本发明取得的有益效果是：
1、本发明方法的最主要特征在蛹虫草液体深层培养阶段控制培养条件，包括孢子接种量、培养基pH和添加不同浓度的表面活性剂等方法。
2、本发明方法选用的真菌是蛹虫草，蛹虫草在液体深层培养中，其菌球随着培养条件的不同而呈现不同的形态，而蛹虫草的形态对于活体材料的机械性能至关重要。因此，通过改变培养条件来调控菌球形态，不需要其他昂贵和复杂的处理方法，从而增强蛹虫草活体材料的机械性能，使得蛹虫草活体生物材料有望成为新型类皮革材料，促进环境资源保护。
3、一种通过调控蛹虫草菌球形态来增强蛹虫草材料机械性能的方法。在蛹虫草孢子生长培养成菌球的过程中，通过合理控制孢子接种量、培养基pH和添加表面活性剂等方法，使蛹虫草孢子在液体深层培养的过程中形成一种菌球密集且直径较小，菌丝粗壮且分支多的形态。该蛹虫草菌球的形态使活体材料的机械性能达到最佳。
4、为增强蛹虫草生物材料的机械性能，本发明通过不同的培养条件来调控蛹虫草菌球形态，方法简便，操作简单，并且由此构筑的蛹虫草生物材料机械性能将进一步增强，使蛹虫草活体生物材料有望成为新型类皮革材料。
附图说明
图1为本发明中实施例1的蛹虫草活体材料的微观图、扫描电镜示意图；
图2为本发明中实施例1的蛹虫草活体材料的拉伸数据图；
图3为本发明中实施例2的蛹虫草菌球在不同孢子液浓度条件下的显微镜视野图；
图4为本发明中实施例2的蛹虫草菌球在不同孢子液浓度条件下的拉伸数据图；
图5为本发明中实施例3的蛹虫草菌球在不同pH浓度条件下的显微镜视野图；
图6为本发明中实施例3的蛹虫草菌球在不同pH浓度条件下的拉伸数据图；
图7为本发明中实施例4的蛹虫草菌球在添加不同浓度的表面活性剂条件下的显微镜视野图；
图8为本发明中实施例4的蛹虫草菌球在添加不同浓度的表面活性剂条件下的拉伸数据图；
图9为本发明中对比例1的蛹虫草材料拉伸数据图；
图10为本发明中对比例2的蛹虫草材料拉伸数据图。
具体实施方式
为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例所表示的范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所使用的各物质质量均为常规使用质量。
一种通过调控蛹虫草菌球形态来增强蛹虫草材料机械性能的方法，包括如下步骤：
在蛹虫草深层液体培养的过程中，培养条件设置为蛹虫草孢子接种量的浓度为1x106、培养基pH为8和添加体积浓度2%的吐温80，蛹虫草孢子在该深层液体培养的过程中形成的菌球，置于玻璃培养皿中60℃烘干5h，并用纯水浸泡菌膜2h，最后烘干20min得到蛹虫草生物材料。
较优地，具体步骤如下：
步骤1）蛹虫草液体培养：
将蛹虫草孢子悬浮液接入灭过菌的马铃薯葡萄糖液体培养基中，使马铃薯葡萄糖液体培养基中蛹虫草孢子悬浮液终浓度达1x106个/mL，置于25°C、120 rpm的摇床中避光培养72 h，摇瓶中蛹虫草孢子萌发后菌丝缠绕成大小均匀的菌球；
2）蛹虫草基材料的制备
培养72 h后菌液经两层纱布过滤得到蛹虫草菌球，并用去离子水清洗两遍，将其取出置于玻璃培养皿中，放入60℃ 烘箱烘干5 h，再加纯水浸泡5h，取出烘干20min ，得到蛹虫草生物材料。
较优地，所述蛹虫草为蛹虫草菌株ACCC50632，购买于信阳市中检计量生物科技有限公司，保藏于南京师范大学食品与制药工程学院。
较优地，所述蛹虫草菌株菌丝体洁白、粗壮，上下均匀一致，生长速率快，见光后容易分泌色素，培养基表面气生菌丝较厚。
较优地，具体步骤为：
蛹虫草在马铃薯固体培养基上活化后置于28°C培养箱培养7天，用纯水清洗培养基得到蛹虫草孢子悬浮液，用血球计数板进行计数接种；
配制马铃薯葡萄糖液体培养基，并用盐酸和氢氧化钠调节马铃薯液体培养基的pH为8，接种蛹虫草孢子悬浮液，使马铃薯葡萄糖液体培养基中孢子终浓度为1×106个/mL，加入体积浓度为2%的表面活性剂吐温80，再放入温度为25°C，转速为120rpm的摇床中培养3天；用双层纱布过滤菌液并清洗多次，得到菌球，在60°C下烘干5h，再用纯水浸泡5h，烘干20分钟，得到蛹虫草活体材料。
较优地，所述马铃薯固体培养基的配制为：每称取200g去皮土豆切碎，放入纯水中煮沸30分钟，将土豆渣用双层纱布过滤得到滤液，加入20g葡萄糖、15g琼脂粉，定容至1升，无需调节pH，搅拌均匀后倒入蓝盖瓶，放入灭菌锅115°C，灭菌20分钟；
每1升马铃薯葡萄糖液体培养基的配制为：马铃薯浸出粉6g、葡萄糖20g，用水定容至1升，放入灭菌锅115°C，灭菌20分钟。
如上所述的方法在生物基材料制备方面中的应用。
具体地，相关的制备及检测如下：
马铃薯固体培养基的配制：称取200g去皮土豆切碎，放入纯水中煮沸30分钟，将土豆渣用双层纱布过滤得到滤液，加入20g葡萄糖、15g琼脂粉，定容至1升，无需调节pH，搅拌均匀后倒入蓝盖瓶，放入灭菌锅115°C，灭菌20分钟。
马铃薯葡萄糖液体培养基的配制：马铃薯浸出粉6g、葡萄糖20g，用水定容至1升，放入灭菌锅115°C，灭菌20分钟。
本发明提供一种通过调控蛹虫草菌球形态来增强机械性能的方法，包括1）蛹虫草液体培养，2）蛹虫草活体材料的制备及其拉伸性能测试
其中，步骤1）蛹虫草液体培养：
蛹虫草液体培养阶段单因素调控孢子悬浮液浓度（1x104-1x108）、液体培养基pH（2-10）、和添加外源物表面活性剂的浓度（吐温tween80（0%-4%））来调控蛹虫草菌球形态，避光培养72h，摇瓶中蛹虫草孢子萌发后菌丝缠绕成大小均匀的菌球，期间在固定时间段取样拍摄显微镜照片，记录蛹虫草生长阶段。
2）蛹虫草活体材料的制备及其万能力学测试
培养72h后的菌液经两层纱布过滤得到菌球，并用去离子水清洗两遍，将其取出置于培养皿中，放入60℃ 烘箱5h，再加纯水浸泡5h，烘干20min，得到蛹虫草菌膜。用万能力学测试仪测试活体材料的拉伸性能。
实施例1
蛹虫草菌株在马铃薯固体培养基上活化后置于28°C培养箱培养7天，用纯水清洗培养基得到蛹虫草孢子悬浮液，用血球计数板进行计数接种。配制100mL马铃薯葡萄糖液体培养基置于250ml锥形瓶中。接种蛹虫草孢子悬浮液，使100mL马铃薯液体培养基中孢子终浓度为1×103个/mL，放入25°C、120rpm的摇床中培养3天。前期对培养温度做了预实验，发现在25°C左右的条件下，菌球成型较好。温度过低，孢子不易生长萌发；温度过高，孢子萌发慢，菌球数量少。所以调控实验是在25°C、120rpm的摇床条件下进行的。用双层纱布过滤菌液并清洗多次，得到菌球，将其置于玻璃培养皿中，在60°C下烘干5h，再用纯水浸泡5h，烘干20分钟得到蛹虫草活体材料，如图1和图2所示，蛹虫草材料的伸长断裂率在23.7%。
实施例2
以实施例1中的菌球培养方法培养蛹虫草；配制100mL马铃薯葡萄糖液体培养基置于250ml锥形瓶中。接种蛹虫草孢子悬浮液，使100mL马铃薯液体培养基中孢子终浓度为1×104、1×105、1×106、1×107或1×108个/mL。放入25°C、120rpm的摇床中培养3天，拍摄72h孢子生长发育过程；用双层纱布过滤菌液并清洗多次，得到菌球，将其置于玻璃培养皿中，在60°C下烘干5h，再用纯水浸泡5h，烘干20分钟得到蛹虫草活体材料，每组3个平行，用万能力学测试仪测试拉伸性能，得到应变-应力曲线，如图3和图4所示，判断其机械性能，发现在孢子悬浮液在1x106的浓度下，菌球的形态较好，蛹虫草材料的伸长断裂率达41.3%。
实施例3
以实施例1中的菌球培养方法培养蛹虫草；配制5组100mL马铃薯葡萄糖液体培养基（每组3瓶），并用盐酸和氢氧化钠调节马铃薯液体培养基的pH，每组培养基的pH分别调至为2、4、6、8、10。接种蛹虫草孢子悬浮液，使100mL马铃薯液体培养基中孢子终浓度为1×106个/mL，放入25°C、120rpm的摇床中培养3天，拍摄72h孢子生长发育过程；用双层纱布过滤菌液并清洗多次，得到菌球，将其置于玻璃培养皿中，在60°C下烘干5h，再用纯水浸泡5h，烘干20分钟得到蛹虫草活体材料，每组3个平行，用万能力学测试仪测试拉伸性能，得到应变应力曲线，如图5和图6所示，判断其机械性能，表明在pH2的环境下孢子难以萌发，不能成球，做不成材料；在pH8的培养条件下，材料的性能综合较好，断裂率为34.1%。
实施例4
以实施例1中的菌球培养方法培养蛹虫草；配制pH为8的100mL马铃薯葡萄糖液体培养基，接种蛹虫草孢子悬浮液，使100mL马铃薯液体培养基中孢子终浓度为1×106个/mL，分别在锥形瓶中加入体积浓度为0%、1%、2%、3%、4%的表面活性剂吐温80，再放入温度为25°C，转速为120rpm的摇床中培养3天，拍摄72h孢子生长发育过程；用双层纱布过滤菌液并清洗多次，得到菌球，将其置于玻璃培养皿中，在60°C下烘干5h，再用纯水浸泡5h，烘干20分钟得到蛹虫草活体材料，每组3个平行，用万能力学测试仪测试拉伸性能，得到应变应力曲线，结果显示当添加2%的tween80时，伸长断裂率达到最好，可达55.2%；浓度过高后，无法形成菌球，大多为稠密絮状，如图7和图8所示。
对比例1
以实施例1中的菌球培养方法培养蛹虫草；配制pH为4的100mL马铃薯葡萄糖液体培养基，接种蛹虫草孢子悬浮液，使100mL马铃薯液体培养基中孢子终浓度为1×106个/mL，在锥形瓶中加入体积浓度为2%的表面活性剂吐温80，再放入温度为25°C，转速为120rpm的摇床中培养3天，拍摄72h孢子生长发育过程；用双层纱布过滤菌液并清洗多次，得到菌球，将其置于玻璃培养皿中，在60°C下烘干5h，再用纯水浸泡5h，烘干20分钟得到蛹虫草活体材料，每组3个平行，用万能力学测试仪测试拉伸性能，得到应变应力曲线，结果显示伸长断裂率为33.2 %，如图9。
对比例2
以实施例1中的菌球培养方法培养蛹虫草；配制pH为8的100mL马铃薯葡萄糖液体培养基，接种蛹虫草孢子悬浮液，使100mL马铃薯液体培养基中孢子终浓度为1×104个/mL，在锥形瓶中加入体积浓度为2%的表面活性剂吐温80，再放入温度为25°C，转速为120rpm的摇床中培养3天，拍摄72h孢子生长发育过程；用双层纱布过滤菌液并清洗多次，得到菌球，将其置于玻璃培养皿中，在60°C下烘干5h，再用纯水浸泡5h，烘干20分钟得到蛹虫草活体材料，每组3个平行，用万能力学测试仪测试拉伸性能，得到应变应力曲线，结果显示伸长断裂率39.6%，如图10。
综合以上调控实验分析，蛹虫草在孢子接种量为1x106、培养基pH为8、外源物添加浓度为2%的液体深层培养条件下，形成的菌球形态可使蛹虫草材料的机械性能进一步增强。同时也可以看出，本发明方法中蛹虫草孢子接种量为1x106、培养基pH为8这两个条件之间具有协同作用，能够协同提高制备得到的蛹虫草材料的机械性能。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
Claims (6)
1.一种通过调控蛹虫草菌球形态来增强蛹虫草材料机械性能的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1）蛹虫草液体培养：
将蛹虫草孢子悬浮液接入灭过菌的pH为8的马铃薯葡萄糖液体培养基中，使马铃薯葡萄糖液体培养基中蛹虫草孢子悬浮液终浓度达1x106个/mL，添加体积浓度2%的吐温80，置于25°C、120 rpm的摇床中避光培养72 h，摇瓶中蛹虫草孢子萌发后菌丝缠绕成大小均匀的菌球；
步骤2）蛹虫草基材料的制备：
培养72 h后菌液经两层纱布过滤得到蛹虫草菌球，并用去离子水清洗两遍，将其取出置于玻璃培养皿中，放入60℃ 烘箱烘干5 h，再加纯水浸泡5h，取出烘干20min ，得到蛹虫草生物材料。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛹虫草为蛹虫草菌株ACCC50632。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述蛹虫草菌株菌丝体洁白、粗壮，上下均匀一致，生长速率快，见光后容易分泌色素，培养基表面气生菌丝较厚。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于：具体步骤为：
蛹虫草在马铃薯固体培养基上活化后置于28°C培养箱培养7天，用纯水清洗培养基得到蛹虫草孢子悬浮液，用血球计数板进行计数接种；
配制马铃薯葡萄糖液体培养基，并用盐酸和氢氧化钠调节马铃薯液体培养基的pH为8，接种蛹虫草孢子悬浮液，使马铃薯葡萄糖液体培养基中孢子终浓度为1×106个/mL，加入体积浓度为2%的表面活性剂吐温80，再放入温度为25°C，转速为120rpm的摇床中培养3天；用双层纱布过滤菌液并清洗多次，得到菌球，在60°C下烘干5h，再用纯水浸泡5h，烘干20分钟，得到蛹虫草活体材料。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述马铃薯固体培养基的配制为：称取200g去皮土豆切碎，放入纯水中煮沸30分钟，将土豆渣用双层纱布过滤得到滤液，加入20g葡萄糖、15g琼脂粉，定容至1升，无需调节pH，搅拌均匀后倒入蓝盖瓶，放入灭菌锅115°C，灭菌20分钟；
每1升马铃薯葡萄糖液体培养基的配制为：马铃薯浸出粉6g、葡萄糖20g，用水定容至1升，放入灭菌锅115°C，灭菌20分钟。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法在生物基材料制备方面中的应用。
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