CN101591626B

CN101591626B - 一株葡糖醋杆菌及其应用

Info

Publication number: CN101591626B
Application number: CN2009100694990A
Authority: CN
Inventors: 宋存江; 苏文萍; 曹名锋; 孔梅梅; 李保宾; 王淑芳
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2009-06-30
Filing date: 2009-06-30
Publication date: 2011-04-27
Anticipated expiration: 2029-06-30
Also published as: CN101591626A

Abstract

本发明公开了一株葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)及其应用。涉及一株葡糖醋杆菌及利用该菌生产细菌纤维素的方法。菌种接种至种子培养基，25-35℃摇床振荡培养24h，以10％接种量接入发酵培养基，25-35℃恒温静置培养10天或震荡培养5天。分离出纤维素、纯化、干燥。培养基碳源为葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木糖中的一种或几种；氮源为酵母粉或蛋白胨或玉米浆干粉中的一种或几种。该发明的菌株在低pH环境中仍有较高的细菌纤维素产量，适于大规模工业化发酵生产。利用本发明得到的细菌纤维素具有超纯、超细、结晶度高、吸水性强、可降解和机械强度高等特点。

Description

一株葡糖醋杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)及其应用，特别是涉及一株葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)的发酵方法及利用该菌生产细菌纤维素的方法。

背景技术

为了区别植物来源的纤维素，把微生物来源的纤维素称为细菌纤维素(bacterialcellulose，BC)。据报道，葡糖醋杆菌属的细菌合成细菌纤维素的能力最强，具有大规模发酵生产的潜力。

与植物纤维素相比，细菌纤维素是由超微纤维组成的超微纤维网，其超微纤维直径仅为植物纤维的1/100。其弹性模量高达1.5×10¹⁰pa，与铝相当。细菌纤维素是一种可生物降解的高分子，它有许多独特的性能：①结构均一性：具有超精细网状结构(纳米级)，高化学纯度，高结晶度，高聚合度；②较好的分散和乳化性。③高抗张强度和弹性模量、极佳的抗撕拉能力和形状维持能力。④高持水能力。⑤形状可塑性及物理性质的可调控性，如合成过程中通过改变培养方式或者添加特定的物质，可以得到所需特性的纤维素。⑥较高的生物相容性和良好的生物可降解性。

此外，细菌纤维素还具有其他一些优越性能，因此，细菌纤维素在食品、医药、造纸、纺织等领域具有广泛的应用潜力。例如在外科治疗中作为皮肤代用品，用于治疗烧伤、溃疡以及皮肤移植手术；用于制造超性能的声音振动膜；制作人造微血管；还可以作为食品添加剂及纸品添加剂等。

尽管细菌纤维素的理化性质及机械性能优于植物纤维素，并已被证明在工业生产中具有广泛的商业应用前景，但由于细菌纤维素的产量低，生产成本高，使其应用受到限制。细菌纤维素的生物合成是一个复杂的过程，为了提高其产量可以从多方面入手，分离高产菌株和优化菌株生长代谢的营养源及其发酵方式是一条可行的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一株可用于大规模生产细菌纤维素的葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)。

本发明提供的葡糖醋杆菌为葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)，该菌已于2009年5月26日保藏在中国典型培养物保藏中心(中国武汉，武汉大学内)，保藏编号为CCTCC NO：M 209112。

本发明的葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)分离自天津蓟县产腐烂的柿子。该菌可以在HS培养基(2％葡萄糖，0.5％蛋白胨，0.5％酵母浸粉，0.27％NaH₂PO₄，0.115％柠檬酸，1％乙醇，pH 6.0)上生长良好。菌落呈圆形，半透明，边缘整齐。其16S rDNA基因的核苷酸序列长度为1379bp，在GenBank中的登录号为FJ999663。使用BLAST对SC-01菌株的16S rDNA基因和GenBank中已登录细菌进行同源性比对，发现该菌株与已报道的Gluconacetobacter xylinus strain CGMCC1.1812的16S rDNA基因序列相似性最高。葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)的系统进化树见说明书附图1。

本发明的另一个目的是提供利用上述葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)生产性能优良的细菌纤维素的方法。

为了实现这一目的，本发明采用以下技术方案：葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobactersp.SC-01)生产性能优良的细菌纤维素的方法是采用优化的HS培养基进行发酵。具体步骤如下：首先将菌种接种至种子培养基中，25-35℃摇床振荡培养24h，转速为135rpm，以10％的接种量接入发酵培养基，接种时充分振荡，使菌体分散均匀，25-35℃恒温静置培养10天或震荡培养5天。取出纤维素膜，提纯处理并干燥之后称重。

利用葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)生产细菌纤维素所用发酵培养基的碳源为葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木塘中的一种或几种；氮源为酵母粉或蛋白胨或玉米浆干粉中的一种或几种。

为了提高葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)的细菌纤维素产量，所述发酵培养过程中添加发酵液体积百分比为0.5％-2％的95％乙醇作为生长因子促进菌株生长，以产生更多的细菌纤维素。

本发明中的发酵培养温度为25-35℃；发酵培养初始pH值为3.5-7.0。

本发明以葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)为生产菌株，发酵制备细菌纤维素。培养基的碳源为葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木塘中的一种或几种；氮源为酵母粉或蛋白胨或玉米浆干粉中的一种或几种。本发明的菌株培养条件更加灵活，菌株可以在较宽的温度和pH范围内生长。通过改变培养条件，可以根据需要得到所需特性的细菌纤维素，使细菌纤维素的合成有更好的可调控性。利用本发明的方法，可以得到较高的细菌纤维素产量，更适于大规模工业化发酵生产。以前报道的一些菌种在发酵的后期由于培养基中葡萄糖酸的产生，pH下降，从而抑制了细菌纤维素合成的相关酶的活性，使细菌纤维素产量下降。本发明的菌株在初始pH为4时仍有较高的细菌纤维素产量，优于以前报道的菌种。利用本发明的菌株和培养方法得到的细菌纤维素具有超纯、超细、结晶度高、吸水性好、可降解、机械强度高、合成可调控等特点。因此利用本发明的菌株和培养方法得到的细菌纤维素具有更广阔的应用前景。

附图说明

图1是葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)的系统进化树。

下面结合具体的实例对本发明做进一步说明。

具体实施方式

在下面的实施例中，所用的菌种均为葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)，实施例中所用的不同培养基配方如下：

1.筛选培养基：

(1)固体GYC培养基：葡萄糖3-5g，酵母粉0.3-1g，CaCO₃1-2g，95％乙醇0.5-2ml，琼脂1.5-2.5g，蒸馏水100ml，pH 6.8。另外加入100μl10mg/ml的制霉菌素抑制真菌等的生长。

(2)液体HS培养基：葡萄糖2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g，Na₂HPO₄0.27g，95％乙醇2ml，蒸馏水100ml，pH 6.0。另外加入100μl10mg/ml的制霉菌素抑制真菌等的生长。

其中，制霉菌素用二甲基亚砜作溶剂配制成10mg/ml，0.22μm滤器过滤除菌。

2.种子培养基：葡萄糖2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g，Na₂HPO₄ 0.27g，95％乙醇1ml，MgSO₄·7H₂O 0.05g，蒸馏水100ml，pH 6.0。

3.发酵培养基：

(1)发酵培养基1：葡萄糖2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g，Na₂HPO₄ 0.27g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，95％乙醇1ml，蒸馏水100ml，pH 6.0。

(2)发酵培养基2：甘露醇2g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g，Na₂HPO₄ 0.27g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，蒸馏水100ml，95％乙醇1ml，pH 6.0。

(3)发酵培养基3：甘露醇和蔗糖各1g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g，Na₂HPO₄0.27g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，蒸馏水100ml，95％无菌乙醇2ml，pH 6.0。

(4)发酵培养基4：半乳糖和甘露醇各1g，酵母粉1g，柠檬酸0.115g，Na₂HPO₄ 0.27g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，蒸馏水100ml，95％乙醇1ml，pH 6.0。

(5)发酵培养基5：果糖2g，玉米浆干粉1g，柠檬酸0.115g，Na₂HPO₄ 0.27g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，蒸馏水100ml，95％乙醇1ml，pH 6.0。

(6)发酵培养基6：木糖和甘露醇各1g，酵母粉0.5g，蛋白胨0.5g，柠檬酸0.115g，Na₂HPO₄ 0.27g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，蒸馏水100ml，95％无菌乙醇1ml，pH 4.0。

实施例1、分离葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)

实验材料来自于天津蓟县产腐烂的柿子。

具体步骤如下：取腐烂的柿子汁液，用100目筛过滤，以无菌生理盐水10倍梯度稀释，分别稀释为10¹-10⁶，取10³-10⁵涂布到固体GYC培养基平板上，25-35℃培养4天，观察菌落生长情况，挑取带有透明斑的菌落转接至液体HS培养基中培养10天，培养液表面有膜状物产生，将膜处理后经检测为细菌纤维素膜，初步判断该菌为细菌纤维素产生菌。经革兰氏染色，生理生化实验及16S rDNA基因序列分析以及BIOLOG鉴定，确定该菌株为葡糖醋杆菌，并且命名为葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)，经保藏，编号为CCTCC NO：M 209112。

实施例2、葡糖醋杆菌SC-01(Gluconacetobacter sp.SC-01)的发酵

采用发酵培养基1。具体步骤如下：首先将菌种接种到种子培养基中，25-35℃摇床振荡培养，转速为135rpm，培养24h后，按10％的接种量接入发酵培养基，接种时充分振荡，使菌体分散均匀，25-35℃恒温静置培养10天。取出纤维素膜，以去离子水多次冲洗除去膜表面的培养基及杂质，将膜浸在0.1mol/L的NaOH中，100℃煮沸1h，去除膜中菌体和残留培养基，至膜呈乳白色半透明，用去离子水浸泡过夜，然后用去离子水多次冲洗直至pH为7.2左右，然后250ml离心管中4000rpm离心40min，弃上清，将膜取出，置于吸水纸上吸取表面的水，称湿重。将湿膜放至平皿中包上保鲜膜，扎孔，于-20℃冰箱中预冻2h，然后冷冻真空干燥至恒重，称其重量为细菌纤维素的干重。

实施例3、采用发酵培养基2。具体步骤如下：首先将菌种接种到种子培养基中，25-35℃摇床振荡培养，转速为135rpm，培养24h后，按10％的接种量接入发酵培养基，接种时充分振荡，使菌体分散均匀，25-35℃恒温震荡培养5天。以下步骤同实施例2。

实施例4、采用发酵培养基3。具体步骤同实施例2。

实施例5、采用发酵培养基4。具体步骤同实施例3。

实施例6、采用发酵培养基5。具体步骤同实施例2。

实施例7、采用发酵培养基6。具体步骤同实施例3。

实施例8、采用发酵培养基6，发酵培养温度为25℃。具体步骤同实施例2。

实施例9、采用发酵培养基6，发酵培养温度为35℃。具体步骤同实施例3。

Claims

1.一株葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)SC-01 CCTCC NO：M 209112。

2.利用葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter sp.)SC-0 1CCTCC NO：M 209112生产细菌纤维素的方法，包括以下步骤：首先将菌种接种到种子培养基中，25-35℃摇床振荡培养，转速为135rpm，培养24h后，按10％的接种量接入发酵培养基，接种时充分振荡，使菌体分散均匀，发酵培养初始pH值为3.5-7.0，25-35℃恒温静置培养10天或振荡培养5天；取出培养液表面膜状物，提纯处理并干燥之后称重；所述培养基的碳源为葡萄糖或甘露醇或蔗糖或半乳糖或果糖或木糖中的一种或几种；氮源为酵母粉或蛋白胨或玉米浆干粉中的一种或几种。

3.根据权利要求2所述的生产细菌纤维素的方法，其特征在于：所述培养过程中添加发酵液体积百分比为0.5％-2％的95％乙醇作为生长因子促进菌株生长，以产生更多的细菌纤维素。