CN101041844A - 一种利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法。其步骤是在培养基中加入海藻酸钠，然后接种木醋杆菌静置培养可得到产量提高的细菌纤维素。本发明提供的方法工艺简单，成本低，可以明显提高原料的转化率及细菌纤维素的产量，实验证实：利用本发明所述利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法可到以使细菌纤维素的干重由原来的8～10g/L提高到14～16g/L。
Description
技术领域
本发明涉及一种提高细菌纤维素产量的方法，尤其涉及一种在细菌发酵过程中利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法。
背景技术
细菌纤维素是在1886年由Brown发现的，木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)在静止培养时于培养基表面形成一层白色纤维状物质，经化学与物理方法分析确定此类物质具有纤维素的结构与化学性质，因其属细菌合成，故命名为细菌纤维素(bacterialcellulose，BC)。
细菌纤维素直径仅为人工合成纤维的1/10，为10nm～100nm，是一种新型的纳米级生物材料。其有许多独特的性质，如高结晶度和高化学纯度，高抗张强度和弹性模量，很强的水结合性，极佳的形状维持能力和抗撕力，较高的生物适应性和良好的生物可降解性。所以这种新型生物纳米材料的研究开发日益受到各国研究者的重视。但目前细菌纤维素产量较低，制约了其广泛的应用，急需研发提高细菌纤维素产量的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法。应用本发明方法可以明显提高原料的转化率及细菌纤维素的产量。
本发明的设计方案是在液体培养基包括种子培养基和发酵培养基中添加一定量的海藻酸钠，然后进行灭菌，接种，常规方式培养，即可得到高表达量的细菌纤维素湿膜。
本发明所述利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法，由步骤(1)菌株选择，(2)含海藻酸钠种子及液体培养基制备，(3)种子细胞培养，(4)静态液体发酵生产细菌纤维素，(5)细菌纤维素膜纯化组成；其特征是：所述菌株选择木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.1812或木醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)CGMCC No.1.2378；所述含海藻酸钠种子及液体培养基制备是在以重量百分比计，含2％～4％的葡萄糖或果糖或蔗糖，0.5％～1％的酵母粉，0.5％～1％胰蛋白胨，0.5％～1％Na2HPO4，0.2％～0.3％柠檬酸，2％～3％碳酸钙的种子培养基或液体培养基中添加0.2～0.8g/L的海藻酸钠，然后调节培养基的pH值为5～6，在121℃的温度下灭菌20～25min，冷却至30℃后，备用；所述种子细胞培养是取1～2环活化好的斜面种子接入含海藻酸钠的液体培养基中，8℃～32℃振荡培养24小时～36小时，摇床转速为140～180r/min，得种子液；所述静态液体发酵生产细菌纤维素是以体积百分比为5％～10％的接种量将种子液接种到含海藻酸钠的液体培养基中，充分振荡使菌液均匀，28℃～32℃静置培养6～10天，有生成的细菌纤维素膜浮于液面；所述细菌纤维素膜纯化是取生成的细菌纤维素膜，用水冲洗6～10次，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.08～0.12M的碱溶液中，80℃～100℃煮20min～30min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.0～7.2时，冲洗停止，70℃～80℃干燥至恒重，称细菌纤维素重量，计算产量。纤维素的产量以g纤维素/L培养基表示。
上述利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法中，优选的实施方式是：
所述含海藻酸钠种子及液体培养基制备是在以重量百分比计，含2％的葡萄糖或果糖或蔗糖，0.5％的酵母粉，0.5％胰蛋白胨，0.5％Na2HPO4，0.2％柠檬酸，2％碳酸钙的种子培养基或液体培养基中添加0.4～0.6g/L的海藻酸钠，然后调节培养基的pH值为6。
所述种子细胞培养是取1～2环活化好的斜面种子接入含海藻酸钠的液体培养基中，30℃～32℃振荡培养24小时～26小时，摇床转速为150～160r/min，得种子液。
所述静态液体发酵生产细菌纤维素是以体积百分比为6％～8％的接种量将种子液接种到含海藻酸钠的液体培养基中，充分振荡使菌液均匀，30℃～32℃静置培养6～8天，有生成的细菌纤维素膜浮于液面。
所述细菌纤维素膜纯化是取生成的细菌纤维素膜，用水冲洗8～10次，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.1M的碱溶液中，100℃煮20min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.0～7.2时，冲洗停止，80℃干燥至恒重。
其中：上述利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法中，所述碱溶液优选是NaOH溶液。
本发明所述种子培养基和液体培养基中主要由20～30g/L碳水化合物原料，5～10g/L含氮原料，1～1.5g/L防污染剂，0.2～0.6g/L添加剂组成，将上述原料加水加热溶解，pH调节到5～6，即可得到。
其中：碳水化合物主要包括果糖、葡萄糖、蔗糖或椰子水等，含氮原料主要指酵母膏或蛋白胨等，添加剂主要是指海藻酸钠。
所述pH调节主要采用柠檬酸、醋酸或Na2HPO4或K2HPO4或KH2PO4。
本发明提供的利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法工艺简单，成本低，可以明显提高原料的转化率及细菌纤维素的产量，实验证实：利用本发明所述利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法可到以使细菌纤维素的干重由原来的8～10g/L提高到14～16g/L。
具体实施方式
实施例1
(1)菌株选择：选择木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.1812。
(2)含海藻酸钠种子及液体培养基制备：在以重量百分比计，含2％的果糖，0.5％的酵母粉，0.5％胰蛋白胨，0.5％Na2HPO4，0.2％柠檬酸，2％碳酸钙的种子培养基或液体培养基中添加0.5g/L的海藻酸钠，然后调节培养基的pH值为6，在121℃的温度下灭菌20min，冷却至30℃后，备用；
(3)种子细胞培养：取1～2环活化好的斜面种子(木醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)CGMCC No.1.1812)接入含海藻酸钠的液体培养基中，30℃振荡培养24小时，摇床转速为160r/min，得种子液；
(4)静态液体发酵生产细菌纤维素：以体积百分比为6％的接种量将种子液接种到含海藻酸钠的液体培养基中，充分振荡使菌液均匀，30℃静置培养8天，有生成的细菌纤维素膜浮于液面。
(5)细菌纤维素膜纯化：取生成的细菌纤维素膜，用水冲洗8～10次，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.1M的NaOH溶液中，100℃煮20min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.0～7.2时，冲洗停止，80℃干燥至恒重，称细菌纤维素重量，计算产量。
经测定：纤维素的产量为：15g纤维素/L培养基，而以同样方法培养的不加海藻酸钠的细菌纤维素产量为8.5g纤维素/L培养基。
实施例2
按重量百分比计算，取2％的葡萄糖，0.5％的酵母粉，0.5％胰蛋白胨，0.5％Na2HPO4，0.2％柠檬酸，2％碳酸钙，0.05％海藻酸钠，调节pH至6.0。121℃灭菌20min。以此为液体培养基，取一环活化好的斜面种子木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCCNo.1.2378，接入液体培养基中，30℃振荡培养24小时，摇床转速为160r/min，作为种子液。以6％的接种量接种到液体培养基(500mL三角瓶盛有200mL液体培养基)，接种时需充分振荡，以使菌液均匀，30℃恒温静置培养6天。恒温静置培养6天后生成的细菌纤维素膜浮于液面。膜取出后，用水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1M的NaOH溶液，100℃煮沸20min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明后，用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，约7.2时，停止冲洗。80℃干燥至恒重，进行称重。
经测定：纤维素的产量为：14g纤维素/L培养基。相比较同样方法培养的不加海藻酸钠的细菌纤维素产量为7.5g纤维素/L培养基。
实施例3
按重量百分比计算，取2％的葡萄糖，0.5％的酵母粉，0.5％胰蛋白胨，0.5％Na2HPO4，0.2％柠檬酸，2％碳酸钙，0.04％海藻酸钠，调节pH至6.0。121℃灭菌20min。以此为液体培养基，取一环活化好的斜面种子木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCCNo.1.1812，接入液体培养基，32℃振荡培养24小时，摇床转速为160r/min，作为种子。以7％的接种量接种到液体培养基(分装到发酵浅盘中，发酵盘清洗干净后，臭氧水消毒)中，接种时需充分振荡，以使菌液均匀，厚度为10mm，32℃恒温静置培养6天。恒温静置培养6天后生成的细菌纤维素膜浮于液面，约厚为8mm。膜取出后，用水多次冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1M的NaOH溶液，100℃煮沸20min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明。然后用蒸馏水多次冲洗，用pH试纸轻压膜测pH值，pH约7.2时80℃干燥至恒重，进行称重。
经测定：纤维素的产量为：16g纤维素/L培养基。相比较同样方法培养的不加海藻酸钠的细菌纤维素产量为9.5g纤维素/L培养基。
实施例4
(1)菌株选择：选择木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.2378。
(2)含海藻酸钠种子及液体培养基制备：在以重量百分比计，含4％的蔗糖，1％的酵母粉，1％胰蛋白胨，1％Na2HPO4，0.3％柠檬酸，3％碳酸钙的种子培养基或液体培养基中添加0.8g/L的海藻酸钠，然后调节培养基的pH值为5.3，在121℃的温度下灭菌20min，冷却至30℃后，备用；
(3)种子细胞培养：取1～2环活化好的斜面种子(木醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)CGMCC No.1.2378)接入含海藻酸钠的液体培养基中，32℃振荡培养24小时，摇床转速为180r/min，得种子液；
(4)静态液体发酵生产细菌纤维素：以体积百分比为8％的接种量将种子液接种到含海藻酸钠的液体培养基中，充分振荡使菌液均匀，32℃静置培养7天，有生成的细菌纤维素膜浮于液面。
(5)细菌纤维素膜纯化：取生成的细菌纤维素膜，用水冲洗10次，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.12M的NaOH溶液中，100℃煮30min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.0～7.1时，冲洗停止，80℃干燥至恒重，称细菌纤维素重量，计算产量。
经测定：纤维素的产量为：15.5g纤维素/L培养基，而以同样方法培养的不加海藻酸钠的细菌纤维素产量为9.0g纤维素/L培养基。
实施例5
(1)菌株选择：选择木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.1812。
(2)含海藻酸钠种子及液体培养基制备：在以重量百分比计，含3％的葡萄糖，0.8％的酵母粉，0.7％胰蛋白胨，0.8％Na2HPO4，0.25％柠檬酸，2.5％碳酸钙的种子培养基或液体培养基中添加0.7g/L的海藻酸钠，然后调节培养基的pH值为5.7，在121℃的温度下灭菌20min，冷却至30℃后，备用；
(3)种子细胞培养：取1～2环活化好的斜面种子木醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)CGMCC No.1.1812接入含海藻酸钠的液体培养基中，22℃振荡培养36小时，摇床转速为150r/min，得种子液；
(4)静态液体发酵生产细菌纤维素：以体积百分比为5％的接种量将种子液接种到含海藻酸钠的液体培养基中，充分振荡使菌液均匀，28℃静置培养10天，有生成的细菌纤维素膜浮于液面。
(5)细菌纤维素膜纯化：取生成的细菌纤维素膜，用水冲洗10次，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.09M的NaOH溶液中，80℃煮30min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.1～7.2时，冲洗停止，70℃干燥至恒重，称细菌纤维素重量，计算产量。
经测定：纤维素的产量为：15.8g纤维素/L培养基，而以同样方法培养的不加海藻酸钠的细菌纤维素产量为9.2g纤维素/L培养基。
Claims (6)
1.一种利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法，由步骤(1)菌株选择，(2)含海藻酸钠种子及液体培养基制备，(3)种子细胞培养，(4)静态液体发酵生产细菌纤维素，(5)细菌纤维素膜纯化组成；其特征是：所述菌株选择木醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)CGMCC No.1.1812或木醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)CGMCC No.1.2378；所述含海藻酸钠种子及液体培养基制备是在以重量百分比计，含2％～4％的葡萄糖或果糖或蔗糖，0.5％～1％的酵母粉，0.5％～1％胰蛋白胨，0.5％～1％Na2HPO4，0.2％～0.3％柠檬酸，2％～3％碳酸钙的种子培养基或液体培养基中添加0.2～0.8g/L的海藻酸钠，然后调节培养基的pH值为5～6，在121℃的温度下灭菌20～25min，冷却至30℃后，备用；所述种子细胞培养是取1～2环活化好的斜面种子接入含海藻酸钠的液体培养基中，8℃～32℃振荡培养24小时～36小时，摇床转速为140～180r/min，得种子液；所述静态液体发酵生产细菌纤维素是以体积百分比为5％～10％的接种量将种子液接种到含海藻酸钠的液体培养基中，充分振荡使菌液均匀，28℃～32℃静置培养6～10天，有生成的细菌纤维素膜浮于液面；所述细菌纤维素膜纯化是取生成的细菌纤维素膜，用水冲洗6～10次，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.08～0.12M的碱溶液中，80℃～100℃煮20min～30min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.0～7.2时，冲洗停止，70℃～80℃干燥至恒重，称细菌纤维素重量，计算产量。
2.如权利要求1所述利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法，其特征是：所述含海藻酸钠种子及液体培养基制备是在以重量百分比计，含2％的葡萄糖或果糖或蔗糖，0.5％的酵母粉，0.5％胰蛋白胨，0.5％Na2HPO4，0.2％柠檬酸，2％碳酸钙的种子培养基或液体培养基中添加0.4～0.6g/L的海藻酸钠，然后调节培养基的pH值为6。
3.如权利要求1所述利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法，其特征是：所述种子细胞培养是取1～2环活化好的斜面种子接入含海藻酸钠的液体培养基中，30℃～32℃振荡培养24小时～26小时，摇床转速为150～160r/min，得种子液。
4.如权利要求1所述利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法，其特征是：所述静态液体发酵生产细菌纤维素是以体积百分比为6％～8％的接种量将种子液接种到含海藻酸钠的液体培养基中，充分振荡使菌液均匀，30℃～32℃静置培养6～8天，有生成的细菌纤维素膜浮于液面。
5.如权利要求1所述利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法，其特征是：所述细菌纤维素膜纯化是取生成的细菌纤维素膜，用水冲洗8～10次，除去膜表面培养基及杂质，再将膜浸泡于0.1M的碱溶液中，100℃煮20min，去除膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明后，用蒸馏水冲洗并测膜pH值到7.0～7.2时，冲洗停止，80℃干燥至恒重。
6.如权利要求1或5所述利用添加海藻酸钠提高细菌纤维素产量的方法，其特征是：所述碱溶液是NaOH溶液。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20070926 |