CN105950682A - 一种发酵方法 - Google Patents

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张玉明
刘彾普
薛冬冬
贾士儒
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Abstract

本发明公开了一种细菌纤维素的发酵生产方法，该方法是一种动态培养菌体和静态发酵生产细菌纤维素连用法，并应用了两类封闭式、多层次的细菌纤维素培养装置。接种后的培养基通过通过动态法培养12‑24小时，得到具有一定菌体量的发酵母液。然后，利用蠕动泵等装置在无菌条件下将发酵母液经管道自上而下的注入到两类细菌纤维素静置培养装置中，静态培养48‑164小时，最后获得凝胶状细菌纤维素。该方法能够有效的控制发酵条件、细菌纤维素膜的厚度，同时降低染菌几率和节省劳动力，最终提高发酵生产的效率和降低生产成本。

Description

一种发酵方法
发明领域
本发明属于微生物培养领域，具体来说，涉及一种细菌纤维素的发酵方法。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial cellulose，简称BC)，是指在特定条件下，由某些特殊菌属的微生物发酵生成的纤维素的统称。细菌纤维素的发酵合成方法有静态发酵和动态发酵两种，其中静态发酵是指细菌在静置的液态培养基与空气的气液接触面进行发酵培养而产生纤维素，细菌纤维素从培养液和空气的气液界面，沿着培养液向下不断合成积累，最终形成厚度与培养液高度有正相关的细菌纤维素膜。目前国内利用微生物合成细菌纤维素多数采用单纯静态发酵法。然而，目前静态发酵法生产细菌纤维素多采用的是开放式、单批次和单纯的人力操作，从而使的细菌纤维素的发酵生产容易染杂菌，生产过程中各种发酵条件(温度和氧含量等)难以有效的控制，以及效率低成本高。而本发明是一种动态培养和静态发酵生产连用、密闭式、多层次和部分机械化的发酵方法。前期的动态培养使的菌体大量繁殖，为后期的静态发酵提供足够的菌体。同时，在后期的静态发酵过程中，封闭式的静态培养装置能够有效的控制各种发酵条件，能够批量发酵生产，节省劳动力较低生产成本。
发明内容
为了解决上述现有细菌纤维素发酵技术中的不足，本发明的目的是提供一种动态培养和静态发酵生产连用、密闭式、多层次和部分机械化的细菌纤维素发酵生产方法。该方法能够有效的控制发酵条件、细菌纤维素膜的厚度，同时降低染菌几率和节省劳动力，最终提高发酵生产的效率和降低生产成本。
本发明针对目前的发酵技术，采用了两种封闭式、多层次的发酵装置，有效的控制了杂菌污染和各种发酵条件(温度和氧含量等)，同时采用机械化的方式通过密封管道将接种有细菌纤维素生产菌葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter xylinum)的发酵培养基注入到发酵装置中，节省了人力劳动，提高生产效率。
本发明通过下述技术方案实现：所述细菌纤维素的生产方法包括以下步骤：
发酵培养基经高温灭菌后采用蠕动泵经无菌管道注入到动态培养装置(搅拌式发酵罐或鼓泡式发酵罐)中，然后在动态培养装置中的培养基中接入葡糖醋杆菌(Gluconacetobacterxylinum)，葡糖醋杆菌的接种量为6-20％，动态培养(搅拌或鼓泡)12-24小时后，将获得由一定菌体量的发酵母液采用蠕动泵通过无菌密封管道注入到静态发酵生产培养装置中静置培养48-164小时，即可得到细菌纤维素凝胶膜。
将上述培养好的纤维素膜用0.1M的NaOH浸泡一天后用去离子水反复冲洗，最后用去离子水浸泡2天(每天换一次水)，最后得到纯化后的细菌纤维素凝胶膜；
所述发酵培养基的配制方法为：葡萄糖25g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母粉10.0g/L和磷酸氢二钠10g/L，用盐酸或乙酸调节pH至6.0，最后121℃下灭菌处理20分钟；
所述动态培养的装置为搅拌式发酵罐或鼓泡式发酵罐，动态培养的条件为：28-30℃，搅拌转速为50-100rpm，通气量为1.0-3.0vvm，培养时间为12-24小时。
所述静态发酵设备为装置1或装置2，具体步骤为：将动态培养后的发酵母液经蠕动泵通过无菌密封管道注入到发酵设备的上端，当上层培养容器中的培养基液面高度达到预设高度时，所述液体培养基流入到下一层培养容器中，以此类推，然后在填有所述液体培养基的发酵容器中进行发酵。
所述培养容器可从发酵设备拆卸，优选可从发酵设备外面抽出。
所述静态发酵设备1包括本体和至少2个培养盒，其中，所述本体包括顶壁(1)、底壁、前壁(2)、后壁、左壁、右壁(3)；
其中所述前壁(2)和后壁的内侧设有多个相互平行的滑轨，并且前壁(2)和后壁上的滑轨对应等高；在所述左壁和右壁(3)上，以上下两个滑轨的间隔为高度，自上而下依次排列有方向相反的开口(11)；
所述培养盒具有一个底面和四个侧面挡板，所述，在设有开口(11)侧的侧面挡板为最高挡板(9)，其高度等于或大于开口(11)的高度；最高挡板(9)对侧的挡板为最低挡板(10)，其高度小于其三个挡板的高度；其余两个相对的侧面挡板高度小于或等于所述本体上的上下两个滑轨的间隔高度。
所述培养盒架在所述本体的滑轨上，可以沿滑轨左右移动，优选所述培养盒可从开口处拆卸。
其中所述发酵设备中，在所述本体的顶壁(1)上还设有进料管(5)和出气口(4)；在所述本体的底壁上还设有废液流出管(7)和进气口(6)；优选在所述本体的前壁(2)或后壁内还安装有温度调节装置，此外，优选在培养盒的设有开口(11)侧的对侧挡板上设有拉手。
其中所述发酵设备中的培养盒数量为3-100个，优选5-60个，更优选10-40个。
在所述本体的前壁或后壁内还安装有温度调节装置，所述温度调节装置的数量根据培养设备的大小可安装1个或多个，从而使培养设备内的温度均匀、可控。
上述发酵设备中，所述上下两个滑轨的间隔高度和所述培养盒的最高挡板的高度为5-15厘米；所述培养盒的其侧面两个挡板的高度可各自独立的比最高挡板的高度低2-3厘米；所述培养盒的其侧面两个挡板高度可各自独立的为3-13厘米；所述培养盒最高挡板对侧的最低挡板的高度可独立的比其侧面的两个挡板低1-2厘米；所述培养盒最高挡板对侧的最低挡板的高度可独立的为2-12厘米；在所述培养盒最高挡板对侧的最低挡板外侧，还设有引流结构，以引导培养液流入下一层培养盒中；所述细菌纤维素发酵生产设备中可放置的培养盒的数量为10-20个。
所述静态发酵的另一种发酵设备2包括本体和至少2个培养盒，其中，所述本体包括顶壁(1)、底壁、前壁(2)、后壁、左壁、右壁(3)；
其中所述前壁(2)和后壁的内侧设有多个相互平行的滑轨(4)，并且前壁(2)和后壁上的滑轨(4)对应等高；在所述左壁和右壁(3)上，以上下两个滑轨(4)的间隔为高度，自上而下依次排列有方向相反的开口(5)；
所述培养盒具有一个底面和四个侧面挡板，所述，其中侧面挡板挡板的高度小于或等于所述本体上的上下两个滑轨(4)的间隔高度，并且在设有开口(5)侧的的对侧挡板(11)上，设有用于控制液态培养基高度的结构，优选设有孔隙(12)和滑块(13)；
所述培养盒架在所述本体的滑轨(4)上，可以沿滑轨(4)左右移动，优选所述培养盒可从开口处拆卸。
其中所述发酵设备中，在所述本体的顶壁(1)上还设有进料管(6)和出气口(7)；在所述本体的底壁上还设有废液流出管(8)和进气口(9)；优选在所述本体的前壁(2)或后壁内还安装有温度调节装置，此外，优选在培养盒的设有开口(5)侧的对侧挡板上设有拉手。
其中所述发酵设备中的培养盒数量为3-100个，优选5-60个，更优选10-40个。
在所述本体的前壁或后壁内还安装有温度调节装置，所述温度调节装置的数量根据培养设备的大小可安装1个或多个，从而使培养设备内的温度均匀、可控。
所述发酵设备中上下两个滑轨的间隔高度和所述培养盒的最高挡板的高度为5-15厘米；所述培养盒的其他三个挡板的高度可各自独立的比最高挡板的高度低2-3厘米；所述培养盒的其他三个挡板的高度可各自独立的为3-13厘米；所述培养盒挡板上的孔隙和滑块的数量选自一个或多个，例如2-5个；所述培养盒挡板上的孔隙形状选择长方形、椭圆形、弓形等本领域常用的孔隙形状；在所述培养盒挡板上的孔隙周围，还设有显示液态培养基高度的尺度标记；在所述培养盒挡板上的孔隙外侧，还设有引流结构，以引导培养液流入下一层培养盒中；所述细菌纤维素发酵生产设备中可放置的培养盒的数量为10-20个。
本发酵方法能够同时进行多个培养盒发酵生产，能同时生产出不同厚度或所要求厚度的细菌纤维素膜，并且能够通过一次操作就将所有的培养基加入到多个培养盒中，节约人力劳动，大大提高细菌纤维素的发酵产量和产率，最终提高了细菌纤维素生产的效率。
附图说明
图1：细菌纤维素发酵生产设备1本体的结构示意图。
图2：细菌纤维素发酵生产设备1培养盒的结构示意图。
图3：细菌纤维素发酵生产设备1的正面剖视图。
图4：细菌纤维素发酵生产设备2本体的结构示意图。
图5：细菌纤维素发酵生产设备2培养盒的结构示意图。
图6：细菌纤维素发酵生产设备2的正面剖视图。
图7：细菌纤维素发酵生产设备2培养盒的另一结构示意图。
具体实施方式
下面针对发酵方法和相关设备对本发明进一步详细说明，本领域技术人员应当意识到在不脱离本发明的范围和精神的情况下所作的改动，均属于本发明的范围。
实施例1：
本实施例所使用的设备为细菌纤维素发酵生产设备1的一种优选结构。如图1和图2所示，本实施例的细菌纤维素发酵生产设备包括本体和培养盒，其中，
所述本体包括顶壁1、底壁、前壁2、后壁、左壁、右壁3；其中所述前壁和后壁的内侧设有多个相互平行的滑轨，并且前壁和后壁上的滑轨对应等高；在所述左壁和右壁上，以上下两个滑轨的间隔为高度，自上而下依次排列有方向相反的开口11；
在所述本体的顶壁上还设有进料管5和出气口4；
在所述本体的底壁上还设有废液流出管7和进气口6；
所述培养盒具有一个底面和四个侧面挡板，所述四个侧面挡板的高度不同，其中最高挡板9的高度与本体上的上下两个滑轨的间隔高度相等，高度均为10厘米，其他三个挡板高度均为8厘米，在最高挡板9的对侧挡板10上，并在最低挡板中间位置设有引流装置。
在本实施例中，所述培养盒的最高挡板9与其对侧挡板10之间的距离为25厘米，本体中左壁和右壁之间的距离为28厘米；所述培养盒架在所述本体的滑轨上，可以沿滑轨左右移动。
本实施例中将细菌纤维素生产步骤如下：
培养基配制：葡萄糖25g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母粉10.0g/L和磷酸氢二钠10g/L，在121℃下灭菌处理20分钟；
动态培养制备发酵母液：首先将灭菌后的培养基通过蠕动泵装置注入到搅拌式发酵罐中，并在无菌条件下将细菌纤维素生产菌Gluconacetobacter xylinum的搅拌式发酵罐中，在30℃、100rpm条件下培养12-24h。
静态发酵：将培养好的发酵母液通过无菌泵经进料管6注入培养设备中的第一个培养盒，然后培养基经最低挡板引流装置流入下一个培养盒中，依次注满培养设备中的每个培养盒；
在30℃条件下静置培养7天，通过滑轨将每个培养盒抽取出来，收集膜状凝胶细菌纤维素。
纤维素膜的纯化，将上述培养好的纤维素膜用0.1M的NaOH浸泡一天后用去离子水反复冲洗，最后用去离子水浸泡2天(每天换一次水)，所得到的细菌纤维素湿膜为实验所需样品；
本本实例中中控制进气口9的通气量和出气口7的通气量，控制培养装置中的氧气含率为80-90％；
实例2
本实施例为本发明的细菌纤维素发酵生产设备2的一种优选结构。如图4和图5所示，本实施例的细菌纤维素发酵生产设备包括本体和培养盒，其中，
所述本体包括顶壁1、底壁、前壁2、后壁、左壁、右壁3；其中所述前壁和后壁的内侧设有多个相互平行的滑轨4，并且前壁和后壁上的滑轨对应等高；在所述左壁和右壁上，以上下两个滑轨的间隔为高度，自上而下依次排列有方向相反的开口5；
在所述本体的顶壁上还设有进料管6和出气口7；
在所述本体的底壁上还设有废液流出管8和进气口9。
所述培养盒具有一个底面和四个侧面挡板，所述四个侧面挡板的高度不同，其中最高挡板10的高度与本体上的上下两个滑轨4的间隔高度相等，高度均为10厘米，最低挡板11位于最高挡板的对侧，高度为5厘米，其余两个侧面挡板高度相等为8厘米。
在本实施例中，所述培养盒的最高挡板10与其对侧挡板11之间的距离为25厘米，本体中左壁和右壁之间的距离为28厘米；所述培养盒架在所述本体的滑轨4上，可以沿滑轨4左右移动。
本实施例中将细菌纤维素生产步骤如下：
培养基配制：葡萄糖25g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母粉10.0g/L和磷酸氢二钠10g/L，在121℃下灭菌处理20分钟；
动态培养制备发酵母液：首先将灭菌后的培养基通过蠕动泵装置注入到鼓泡式发酵罐中，并在无菌条件下将细菌纤维素生产菌Gluconacetobacter xylinum的搅拌式发酵罐中，在30℃、通气量为2.0vvm条件下培养12-24h。
静态发酵：将培养好的发酵母液通过无菌泵经进料管6注入培养设备中的第一个培养盒，然后培养基经孔隙12和引流装置流入下一个培养盒中，依次注满培养设备中的每个培养盒；
在30℃条件下静置培养7天，通过滑轨将每个培养盒抽取出来，收集膜状凝胶细菌纤维素。
纤维素膜的纯化，将上述培养好的纤维素膜用0.1M的NaOH浸泡一天后用去离子水反复冲洗，最后用去离子水浸泡2天(每天换一次水)，所得到的细菌纤维素湿膜为实验所需样品；
本实例中每个培养盒的滑块的高度设计为8厘米，从而决定最终培养基的高度均为8厘米厚；
本本实例中中控制进气口9的通气量和出气口7的通气量，控制培养装置中的氧气含率为80-90％；
本实例中的时间点设计为12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h。
本实施例为本发明的细菌纤维素发酵生产设备的另一种优选结构。如图1和图3所示，本实施例的细菌纤维素发酵生产设备包括本体和培养盒，其中所述本体与实施例1的结构相同。
实施例3：
本实施例所使用的细菌纤维素发酵生产设备2的另一种优选结构。如图4和图6所示，本实施例的细菌纤维素发酵生产设备包括本体和培养盒，其中所述本体与实施例1的结构相同。
所述培养盒具有一个底面和四个侧面挡板，所述四个侧面挡板的高度不同，其中最高挡板10的高度与本体上的上下两个滑轨4的间隔高度相等，高度均为12厘米，其他三个挡板高度均为9厘米，在最高挡板10的对侧挡板11上，设有两个竖向孔隙12，其中一个孔隙位于挡板上部，另一个孔隙位于挡板下部，在每个孔隙中都设有用于调节液态培养基高度的滑块13；通过设置这两个滑块在两个孔隙中的位置，能够设置更多不同的高度，从而可以生产更多不同厚度的细菌纤维素膜，在所述培养盒挡板上的孔隙周围，还设有显示液态培养基高度的尺度标记14。
本实施例为本发明中细菌纤维素发酵法的另一种优选步骤如下：
培养基配制：葡萄糖25g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母粉10.0g/L和磷酸氢二钠10g/L，在121℃下灭菌处理20分钟；
动态培养制备发酵母液：首先将灭菌后的培养基通过蠕动泵装置注入到搅拌式发酵罐中，并在无菌条件下将细菌纤维素生产菌Gluconacetobacter xylinum的搅拌式发酵罐中，在30℃、搅拌转速为50rpm条件下培养12-24h。
静态发酵：将培养好的发酵母液通过无菌泵经进料管6注入培养设备中的第一个培养盒，然后培养基经孔隙12和引流装置流入下一个培养盒中，依次注满培养设备中的每个培养盒；
在30℃条件下静置培养7天，通过滑轨将每个培养盒抽取出来，收集膜状凝胶细菌纤维素。
纤维素膜的纯化，将上述培养好的纤维素膜用0.1M的NaOH浸泡一天后用去离子水反复冲洗，最后用去离子水浸泡2天(每天换一次水)，所得到的细菌纤维素湿膜为实验所需样品；
本实例中每个培养盒的滑块的高度设计各不相同，其高度范围为0.5-8厘米，从而根据培养基的厚度培养不同厚度细菌纤维素膜。
本实例中中控制进气口9的通气量和出气口7的通气量，控制培养装置中的氧气含率为80-90％；
本实例中获得的细菌纤维素的凝胶湿膜厚度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0厘米的细菌纤维素。
在本实施例中，所述培养盒的最高挡板10与其对侧挡板11之间的距离为20厘米，本体中左壁和右壁之间的距离为24厘米；所述培养盒架在所述本体的滑轨4上，可以沿滑轨4左右移动。
实施例4：
本实施例为本发明的细菌纤维素发酵生产设备1本体和培养盒装配在一起的结构实例。如图1图3所示，本实施例的细菌纤维素发酵生产设备中有10个培养盒，其中上面5个培养盒为打开状态放置，下面5个培养盒为关闭状态放置，即进行发酵培养时状态。图1和图3培养盒中的深色物质为不同厚度的液体培养基12。
在使用本发明的细菌纤维素发酵生产设备进行静态细胞纤维素发酵生产时，将培养盒架在本体的滑轨上，推至闭合，使细菌纤维素发酵生产设备整体密封。
然后，将预先接种后的液态培养基从本发明的细菌纤维素发酵生产设备顶部的进料管5注入到设备中的首层培养盒里面，当首层培养盒中的培养基液面高度达到细菌纤维素发酵生产设备1中培养盒上的最低挡板(10)时，液体培养基会从沿着最低挡板11流入到下一层培养盒中。以此类推，随着液态培养基的不断注入，培养基会从首层培养盒中逐级的填满所有的培养盒，此时各个培养盒中的培养基高度为预先通过滑块设置的不同高度，然后进行发酵培养。
在发酵培养结束后，可以从细菌纤维素发酵生产设备的左右两侧根据需要抽拉出任意一层的培养盒，进行细菌纤维素的收集和对培养盒进行清洗。
实施例5：
本实施例为本发明的细菌纤维素发酵生产设备2本体和培养盒装配在一起的结构实例。如图4和图7所示，本实施例的细菌纤维素发酵生产设备中有10个培养盒，其中上面5个培养盒为打开状态放置，下面5个培养盒为关闭状态放置，即进行发酵培养时状态。图4和图7培养盒中的深色物质为不同厚度的液体培养基15。
在使用本发明的细菌纤维素发酵生产设备进行静态细胞纤维素发酵生产时，先将细菌纤维素发酵生产设备1的每个培养盒上用于调节液态培养基高度的滑块13固定到所需位置，使每个培养盒可以根据生产需要，装载不同高度的液态培养基，从而可以发酵生产出不同厚度的细菌纤维素膜。然后将培养盒架在本体的滑轨上，推至闭合，使细菌纤维素发酵生产设备整体密封。
然后，将预先接种后的液态培养基从本发明的细菌纤维素发酵生产设备顶部的进料管6注入到设备中的首层培养盒里面，当首层培养盒中的培养基液面高度达到细菌纤维素发酵生产设备2中培养盒上滑块13所设置的液面高度，液体培养基会从滑块上面的孔隙12流入到下一层培养盒中。以此类推，随着液态培养基的不断注入，培养基会从首层培养盒中逐级的填满所有的培养盒，此时各个培养盒中的培养基高度为预先通过滑块设置的不同高度，然后进行发酵培养。
在发酵培养结束后，可以从细菌纤维素发酵生产设备的左右两侧根据需要抽拉出任意一层的培养盒，进行细菌纤维素的收集和对培养盒进行清洗。

Claims (11)

1.一种发酵方法，将预先接种的液态培养基先经动态培养12-24小时后，通过蠕动泵装置加入到发酵设备的上端移入到静态发酵装置中，当上层培养容器中的培养基液面高度达到预设高度时，所述液体培养基流入到下一层培养容器中，以此类推，然后在填有所述液体培养基的发酵容器中进行静态发酵培养48-164小时。
2.权利要求1所述的静态培养的方法，其中所述培养容器可从发酵设备拆卸，优选可从发酵设备外面抽出。
3.前述权利要求任一项的方法，其中所述发酵是先动态培养菌体后，在静态发酵生产细菌纤维素。
4.前述权利要求任一项的方法，其中所述方法用于制备细菌纤维素。
5.前述权利要求任一项的方法，其中所述预先接种的菌种是木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacter xylinus)。
6.权利要求3所述的动态培养方法为搅拌式发酵罐培养或鼓泡式发酵罐培养。
7.前述权利要求1-5中任一项的方法，其中所述静态发酵设备1包括本体和至少2个培养盒，其中，所述本体包括顶壁(1)、底壁、前壁(2)、后壁、左壁、右壁(3)；
其中所述前壁(2)和后壁的内侧设有多个相互平行的滑轨，并且前壁(2)和后壁上的滑轨对应等高；在所述左壁和右壁(3)上，以上下两个滑轨的间隔为高度，自上而下依次排列有方向相反的开口(11)；
所述培养盒具有一个底面和四个侧面挡板，所述，其中侧面挡板挡板(10)的高度小于或等于所述本体上的上下两个滑轨的间隔高度，并且在设有开口(11)侧的对侧挡板(10)为最低挡板；
所述培养盒架在所述本体的滑轨上，可以沿滑轨左右移动，优选所述培养盒可从开口处拆卸。
8.根据权利要求6所述的发酵方法，其中所述发酵设备中，在所述本体的顶壁(1)上还设有进料管(5)和出气口(4)；在所述本体的底壁上还设有废液流出管(7)和进气口(6)；优选在所述本体的前壁(2)或后壁内还安装有温度调节装置，此外，优选在培养盒的设有开口(11)侧的对侧挡板上设有拉手。
9.前述权利要求1-5中任一项的方法，其中所述静态发酵的另一种设备2包括本体和至少2个培养盒，其中，所述本体包括顶壁(1)、底壁、前壁(2)、后壁、左壁、右壁(3)；
其中所述前壁(2)和后壁的内侧设有多个相互平行的滑轨(4)，并且前壁(2)和后壁上的滑轨(4)对应等高；在所述左壁和右壁(3)上，以上下两个滑轨(4)的间隔为高度， 自上而下依次排列有方向相反的开口(5)；
所述培养盒具有一个底面和四个侧面挡板，所述，在设有开口(5)侧的侧面挡板为最高挡板(10)，其高度等于或大于开口(5)的高度；最高挡板(10)对侧的挡板为最低挡板(11)，其高度小于其三个挡板的高度；其余两个相对的侧面挡板高度小于或等于所述本体上的上下两个滑轨(4)的间隔高度。
所述培养盒架在所述本体的滑轨(4)上，可以沿滑轨(4)左右移动，优选所述培养盒可从开口处拆卸。
10.根据权利要求8所述的发酵方法，其中所述静态发酵设备中，在所述本体的顶壁(1)上还设有进料管(6)和出气口(7)；在所述本体的底壁上还设有废液流出管(8)和进气口(9)；优选在所述本体的前壁(2)或后壁内还安装有温度调节装置，此外，优选在培养盒的设有开口(5)侧的对侧挡板上设有拉手。
11.根据权利要求6-7和8-9所述的发酵方法，其中所述静态发酵设备中的培养盒数量为3-100个，优选5-60个，更优选10-40个。
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