CN103497890B - 细菌用发酵罐灌流培养系统及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种细菌用发酵罐灌流培养系统，涉及培养细菌的技术，尤其涉及细菌用发酵罐灌流培养系统及方法。其包括用于培养细菌的发酵罐，还包括供给单元、检测单元、过滤单元和控制装置，供给单元与发酵罐连接；过滤单元与发酵罐连接；控制装置与检测单元连接，检测单元检测发酵罐内的OD值和溶氧值并当OD值和溶氧值均在预设范围内时发送信息至控制装置；控制装置接收信息，并控制供给单元和过滤单元。本发明还提供一种灌流培养细菌的方法。通过输入培养基和排出过滤后的废液，使得细菌在培养基罐中的培养基消耗完之前长期处于对数生长期末期。如此，提高了单次发酵产出的菌数和质量；避免了多次发酵产生的人力、物力和财力的浪费；大大提高了单位体积发酵菌液的菌数。

Description

细菌用发酵罐灌流培养系统及方法

技术领域

本发明涉及一种培养细菌的技术，尤其涉及一种细菌用发酵罐灌流培养系统及方法。

背景技术

发酵为复杂的有机化合物在微生物的作用下分解成比较简单的物质。在工业生产中，利用微生物进行工业化的生产通常采用工程技术手段，利用微生物和有活性的离体酶的某些功能加工或制作产品。例如，微生物菌体发酵、微生物酶发酵、微生物代谢产物发酵、微生物转化发酵及生物工程细胞的发酵。通过以上五种发酵方式可以得到菌体本身、微生物酶制剂、微生物代谢产物、利用微生物的酶转化的化合物和利用生物工程技术所获得的细胞等。

目前通常采用分批发酵的方法获取对人类有用的物质，此种方法除去发酵过程，还需反复进行放料、洗罐、加料及灭菌等不产生任何对人类有用物质的动作。存在生产时间短及人力、物力、动力消耗较大等缺点。

因此，亟需一种能连续培养细菌的系统，从而不再需要反复进行放料、洗罐、加料及灭菌等不产生任何对人类有用物质的动作，杜绝上述问题的出现。

发明内容

本发明的一个目的在于提出一种细菌用发酵罐灌流培养系统，通过将培养基罐内的培养基输入发酵罐，使得发酵罐内的细菌保持在对数生长期末的状态，细菌可以以最快的速度连续不断的生产出来，提高了生产效率和质量。

本发明的另一个目的在于提供了一种细菌用发酵罐灌流培养系统，通过设置具有废液出口的过滤单元，其两端分别连接发酵罐，通过蠕动泵提供动力过滤发酵菌液，并将过滤后的废液排出的同时将过滤后的发酵菌液输入发酵罐。如此，对发酵罐内细菌起到了富集作用，提高了单次发酵的活菌数，大大减轻了后期对细菌浓缩的工作量，并避免了分批发酵带来的人力、物力和财力的浪费。

本发明的另一个目的在于提供一种灌流培养细菌的方法，通过检测发酵罐内细菌是否进入对数增长期末，若进入对数增长期，则向发酵罐输入培养基的同时排出废液，使得细菌在较长时间段处于高速成长状态，提高了单次发酵的产量并提高了生产效率。

为达此目的，一方面，本发明采用以下技术方案：

一种细菌用发酵罐灌流培养系统，包括用于培养细菌的发酵罐，还包括供给单元、检测单元、过滤单元和控制装置，

所述供给单元与所述发酵罐连接以便为所述发酵罐提供培养基；

过滤单元与所述发酵罐连接以过滤发酵菌液并将废液排出；

所述控制装置与所述检测单元连接，所述检测单元用于检测发酵罐内发酵菌液的OD值和溶氧值并在OD值和溶氧值在预设范围内时发送信息至所述控制装置；

所述控制装置用于接收所述信息，并控制供给单元向所述发酵罐输入培养基的同时控制过滤单元排出废液，以使得所述发酵罐内的发酵菌液处于动态平衡状态。

优选的，所述供给单元与所述发酵罐之间设有三通装置，所述三通装置包括T形通和阀门，所述T形通分别与输入支管、供给单元和发酵罐连通，所述T形通的三个出口端分别与第一阀门、第二阀门和第三阀门连接。

优选的，所述控制装置连接有驱动单元，所述驱动单元包括设置于所述培养系统各连接管路上的蠕动泵，通过所述蠕动泵控制连接管路内介质的流速。

优选的，所述T形通与所述发酵罐之间设置第一蠕动泵，控制向所述发酵罐输入培养基的速度。

优选的，所述过滤单元的进口端通过第三蠕动泵和第五阀门连接至所述发酵罐的底部，所述过滤单元的出口端通过第二蠕动泵和第四阀门连接至所述发酵罐的顶部。

另一方面，本发明采用以下方案：

一种使用上述细菌用发酵罐灌流培养系统进行灌流培养细菌的方法，在进行细菌发酵时，检测单元实时检测发酵罐内发酵菌液的OD值和溶氧值，判断OD值和溶氧值是否均在预设范围内，

是，则供给单元向发酵罐内输入新的培养基，并通过过滤单元将发酵罐内的发酵菌液过滤，将废液排出，过滤后的发酵菌液流回发酵罐内，以使得OD值和溶氧值维持在所述预设范围内；

否则继续进行OD值和溶氧值的实时检测。

优选的，所述方法具体包括以下几个步骤：

A.同时开启第一阀门、第二阀门和第三阀门，第四阀门和第五阀门处于关闭状态，通过输入支管向供给单元和发酵罐注入细菌用培养基，进行高温灭菌后关闭第一阀门、第二阀门和第三阀门，并将培养基降温至[37℃，37.5℃]的温度区间内；

B.关闭第二阀门，将种子液与发酵用营养液通过输入支管导入所述发酵罐后关闭第一阀门和第三阀门；

C.发酵开始后，检测装置实时检测发酵罐内发酵菌液的OD值和溶氧值；

D.判断OD值和溶氧值是否均在预设范围内，是，则执行步骤E，否则返回步骤C；

E.开启第二阀门、第三阀门、第四阀门和第五阀门，所述控制装置控制供给单元向所述发酵罐输入无菌新鲜培养基，同时控制过滤单元将发酵罐内的发酵菌液过滤，将废液排出，过滤后的发酵菌液流回发酵罐内。

优选的，步骤D中所述的预设范围为细菌处于对数生长期的末期时对应的OD值和溶氧值的范围。

优选的，步骤E中，所述控制装置根据检测的OD值和溶氧值控制调整第一蠕动泵、第二蠕动泵和第三蠕动泵的转速，进而调整相应管路内介质流速，以使得OD值和溶氧值维持在所述预设范围内。

优选的，步骤A中所述高温灭菌的温度范围为116℃-121℃，灭菌时间为30-40min。

本发明所提供的一种细菌用发酵罐灌流培养系统，在细菌进入对数生长期末之后，连续的从培养基罐提取培养基并补充到发酵罐中，使得细菌始终处在良好的生长环境，始终处于对数生长期末，进而使得细菌处于高速生长状态，提高了生产效率和菌体的质量；在向发酵罐输入培养基的同时经过滤单元排出废液，使得发酵罐内的发酵菌液始终处于一个动态平衡状态，在提高了单次发酵的活菌数的同时也提高了发酵菌液单位体积内的菌数，大大减轻了后期对细菌浓缩的工作量，并避免了分批发酵带来的人力、物力和财力的浪费。

附图说明

图1是本发明具体实施方式一提供的细菌用发酵罐灌流培养系统的模块示意图；

图2是本发明具体实施方式一提供的细菌用发酵罐灌流培养系统的组装结构示意图；

图3为本发明具体实施方式一提供的用发酵罐灌流培养细菌的方法的流程图。

图中，10、细菌用发酵罐灌流培养系统；11、第一阀门；12、第二阀门；13、第三阀门；14、第四阀门；15、第五阀门；16、T形通；17、输入支管；21、第一蠕动泵；22、第二蠕动泵；23、第三蠕动泵；31、中空纤维超滤器；100、检测单元；110、OD检测单元；120、溶氧值检测单元；200、发酵罐；210、搅拌器；220、发酵罐夹层；300、培养基罐；310、培养基罐夹层；400、控制装置。

具体实施方式

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

实施方式一

如图1，图1是本发明具体实施方式一提供的细菌用发酵罐灌流培养系统的模块示意图。细菌用发酵罐灌流培养系统10包括用于培养细菌的发酵罐200，还包括检测单元100、供给单元、控制装置400、阀门、蠕动泵及过滤单元。检测单元100检测发酵罐200内的溶氧值和从发酵罐中提取出的发酵菌液的OD值，当溶氧值和OD值达到细菌在对数生长期末对应的范围时发送信息至控制装置400；阀门和蠕动泵设置在连通发酵罐200、供给单元及过滤单元之间的管道上，控制装置400连接蠕动泵，并通过控制阀门和蠕动泵，使得与发酵罐200连通的供给单元为发酵罐200提供培养基；与此同时，过滤单元过滤发酵罐200内的发酵菌液，并将废液排出，将过滤后的发酵菌液重新输入发酵罐200内。

在本实施例中，供给单元为培养基罐300，过滤单元为中空纤维超滤器31。

再结合图2，图2是本发明具体实施方式一提供的细菌用发酵罐灌流培养系统的组装结构示意图。发酵罐200为细菌生长的场所，进行发酵前，先向发酵罐200和培养基罐300中加入足量的培养基，然后对发酵罐200和培养基罐300进行高温灭菌，最后将种子液与营养液输入发酵罐200后开始发酵。发酵罐200内还设置有一个搅拌器210，通过缓慢匀速的搅拌使得营养液均匀的分布。发酵罐200上设置有发酵罐夹层220，培养基罐300上设置有培养基罐夹层310，可在夹层中通冷却水，对发酵罐200和培养基罐300进行冷却。

检测单元100与发酵罐200连接以便检测发酵罐200内细菌的OD值和溶氧值。检测单元100包括OD值检测单元110和溶氧值检测单元120。OD值检测单元110用以检测发酵菌液的OD值，溶氧值检测单元120用于检测细菌的溶氧值。细菌在生长过程中有延滞期、对数期、稳定期和衰亡期。其中对数期的细菌以最大的速率生长和分裂，细菌数量对数增加，此时期是细菌发酵所需要的。当OD值检测单元110、溶氧值检测单元120检测到OD值、溶氧值达到细菌在对数生长期末对应的范围时，检测单元100向控制装置400发送细菌进入对数生长期末的信息。在本实施例中，对发酵菌液的OD值的检测采用每隔单位时间进行人工取样，并通过紫外分光光度计快速的对取出的样品进行OD值检测；将溶氧值检测装置与发酵罐200连接以实时检测发酵罐200内发酵菌液的溶氧值。发酵罐200还与温度感应器连接，以便检测发酵罐200内的温度。

可以理解的是，发酵罐200可以与本领域认可的其他检测发酵罐200内的溶氧值的仪器连接，并可使用本领域认可的检测OD值的仪器测量发酵罐200内的发酵菌液的OD值。

控制装置400分别与检测单元100、培养基罐300及中空纤维超滤器31连接以便根据反馈信息控制细菌用发酵罐灌流培养系统10。在本实施例中，控制装置400为PLC控制单元。其分别与温度传感器及溶氧值检测装置连接，以便接收温度传感器及溶氧值检测装置发送的发酵罐200内的温度信息和溶氧值信息。并根据接收的信息控制细菌用发酵罐灌流培养系统10的动作。

培养基罐300通过管道与发酵罐200连通，为发酵罐200提供培养基，以便为细菌维持在对数生长期末提供营养物质。在一些实施例中，培养基罐300为培养基高压罐，且该培养基高压罐内存储有足量的培养基。

中空纤维超滤器31的两端分别与发酵罐200的顶部和底部相连通。中空纤维超滤器31还设有一出液口以便将中空纤维超滤器31过滤后的废液排出。在发酵罐200、培养基罐300与将种子液和营养液导入发酵罐200的输入管道（17）之间通过T形通16相交并连通，在T形通16的三个出口端分别和第一阀门11、第二阀门12及第三阀门13连通。在第三阀门13和发酵罐200之间的管道上还设有第一蠕动泵21以便控制培养基进入发酵罐200的速度。在中空纤维超滤器31的出口端与发酵罐200的顶部相连的管道上设置有第四阀门14和第二蠕动泵22；在中空纤维超滤器31的进口端与发酵罐200的底部相连的管道上设置有第五阀门15和第三蠕动泵23。通过协调第一蠕动泵21、第二蠕动泵22和第三蠕动泵23的转数，使得第一蠕动泵21单位时间输入的培养基的体积与从中空纤维超滤器31单位时间排出的废液体积相等。

本发明提供的一种细菌用发酵罐灌流培养系统10，通过控制装置400接收发酵罐200内发酵菌液的OD值和溶氧值达到细菌进入对数生长期末对应的范围时，启动第一蠕动泵21，使得培养基罐300向发酵罐200输入培养基，同时启动第二蠕动泵22和第三蠕动泵23，使得发酵罐200内的发酵菌液经过中空纤维超滤器31的过滤，排出废液并将过滤后的发酵菌液重新导入发酵罐200内。如此，使得细菌进入对数生长期末时连续不断的接收新的培养基，为处于高速增长的细菌提供足量的营养液，延长了细菌处在对数生长期末的时间，进而将细菌连续且快速的培养出来，提高了生产效率和质量；由于设置了具有足量培养基的培养基罐300，提高了单次发酵产出的菌数，避免了多次发酵产生的人力、物力和财力的浪费，节约了生产成本；在向发酵罐200输入新鲜无菌培养基的同时，发酵罐200通过中空纤维超滤器分离出废液和除去废液的发酵菌液，并将废液排出，将除去废液后的发酵菌液重新注入发酵罐200，降低了发酵菌液中毒素的浓度，维持了发酵罐200内发酵菌液体积的平衡，提高了对培养基的利用率，进而进一步的节约了生产成本，大大提高了单位体积发酵菌液的菌数。

可以理解的是，文中未做特别说明的阀门均处于关闭状态，发酵罐200中的培养基高温灭菌后，需降温至公众普遍认可的不同细菌对应的最适宜生长的温度。

本发明还进一步提供了一种发酵罐灌流培养细菌的方法。请结合图2和图3，图3为本发明具体实施方式一提供的发酵罐灌流培养细菌的方法的流程图。该发酵罐灌流培养细菌的方法包括以下步骤：

在步骤S11中，加培养基并消毒。在本实施例中，同时开启第一阀门11、第二阀门12和第三阀门13，第四阀门14和第五阀门15处于关闭状态，通过输入支管17向培养基罐300和发酵罐200加入足量的培养基，然后对培养基罐300和发酵罐200进行高温灭菌。将培养基罐300和发酵罐200加热至121℃灭菌30分钟，之后通过培养基罐300和发酵罐200的夹层冷却水使罐内培养基温度降至[37℃，37.5℃]。在本实施例中，培养基罐300为培养基高压罐。

在步骤S12中，加入种子液和营养液。在本实施例中，关闭第二阀门12，开启第一蠕动泵21，将种子液和发酵用营养液输入发酵罐200内，然后关闭第一阀门11、第三阀门13和第一蠕动泵21以便发酵。

在步骤S13中，检测发酵罐内OD值和溶氧值。在本实施例中，检测单元100分为OD值检测单元110和溶氧值检测单元120，检测发酵罐200内发酵菌液的OD值和溶氧值，当OD值和溶氧值达到细菌进入对数生长期末对应的OD值和溶氧值范围时，发送该信息至控制装置400。

在步骤S14中，OD值和溶氧值是否达到细菌进入对数生长期末对应的OD值和溶氧值？在本实施例中，当检测单元100检测到发酵罐200内发酵菌液的OD值和溶氧值在细菌进入对数生长期末对应的OD值和溶氧值范围时，向控制装置400发送该信息，控制装置400接收到细菌进入对数生长期末的信息后对相应阀门和蠕动泵进行控制。若OD值和溶氧值均未到达细菌进入对数生长期末对应的OD值和溶氧值范围时，返回步骤S13；若OD值和溶氧值均到达细菌进入对数生长期末对应的OD值和溶氧值范围时，则转至步骤S15。

在步骤S15中，按设定的程序向发酵罐输入培养基的同时过滤发酵菌液并将过滤后的废液排出。在本实施例中，当根据检测的OD值和溶氧值判断出细菌进入对数生长期末时，则通过PLC控制单元开启第二阀门12、第三阀门13和第一蠕动泵21，以便培养基高压罐中的培养基进入发酵罐200中。与此同时，开启第四阀门14、第五阀门15、第二蠕动泵22和第三蠕动泵23，以便输出发酵罐200内的发酵菌液并经中空纤维超滤器31过滤后排出废液，将过滤后的发酵菌液重新输入发酵罐200。通过PLC控制单元调节第一蠕动泵21、第二蠕动泵22和第三蠕动泵23的转数使得从培养基高压罐单位时间输入的培养基的体积与中空纤维超滤器31单位时间过滤出的发酵废液体积相等。

在步骤S16中，检测培养基罐内的培养基是否用完？在本实施例中，判断出细菌进入对数生长期末后，检测是否还有培养基通过第一蠕动泵21。若第一蠕动泵21进入空转状态，即可判断出培养基罐300中的培养基用完，转入步骤S17；若第一蠕动泵21未进入空转状态，则继续检测第一蠕动泵21的工作状态。

在步骤S17中，停止向发酵罐输入培养基的同时停止向中空纤维超滤器输入发酵菌液。在本实施例中，在第一蠕动泵21处安装了感应器，当感应器感应到第一蠕动泵21处于空转状态，即会立刻停止第一蠕动泵21、第二蠕动泵22和第三蠕动泵23，使得培养基高压罐停止向发酵罐200输入培养基并且停止从发酵罐200输出发酵菌液。

可以理解的是，使用本领域所知的其他检测培养基罐300内培养基用完的方式都包含在本申请的保护范围内。例如，在培养基罐300的底部安装感应器，用以感应培养基罐300内培养基的高度。

高温灭菌的温度不局限于121℃，其温度范围为116℃-121℃，灭菌时间不局限于30min，可以在30-40min范围变动。

本发明提供的一种用发酵罐灌流培养细菌的方法，通过将种子液及发酵用营养液导入灭菌后的发酵罐200内；开始发酵后检测发酵罐200内细菌的OD值和溶氧值是否达到细菌进入对数生长期末对应的OD值或溶氧值范围；当达到预定范围后将该信息发送给控制装置400；控制装置400接收细菌进入对数生长期末的信息后，控制培养基罐300向发酵罐200输入培养基。如此，为快速增长的细菌提供足够的营养，使得发酵罐200内的细菌长期处于对数生长期末，进而将细菌连续且快速的培养出来，提高了生产效率和细菌的质量。在输入培养基的同时，通过输出装置中的中空纤维超滤器31分离出废液和除去废液后的发酵菌液，将废液排出并将除去废液的发酵菌液重新注入发酵罐200，可以在较长的时间段连续的对细菌进行培养，进而进一步的节约了生产成本。

以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (7)

1.一种细菌用发酵罐灌流培养系统(10)，包括用于培养细菌的发酵罐(200)，其特征在于，还包括供给单元(300)、检测单元(100)、过滤单元(31)和控制装置(400)，

所述供给单元(300)与所述发酵罐(200)连接以便为所述发酵罐(200)提供培养基；

过滤单元(31)与所述发酵罐(200)连接以过滤发酵菌液并将废液排出；

所述控制装置(400)与所述检测单元(100)连接，所述检测单元(100)用于检测发酵罐(200)内发酵菌液的OD值和溶氧值并当OD值和溶氧值均在预设范围内时发送信息至所述控制装置(400)；

所述控制装置(400)用于接收所述信息，并控制供给单元(300)向所述发酵罐(200)输入培养基的同时控制过滤单元(31)排出废液，以使得所述发酵罐(200)内的发酵菌液处于动态平衡状态；

所述预设范围为细菌处于对数生长期的末期时对应的OD值和溶氧值的范围；

所述供给单元(300)与所述发酵罐(200)之间设有三通装置，所述三通装置包括T形通(16)和阀门，所述T形通(16)分别与输入支管(17)、供给单元(300)和发酵罐(200)连通，所述T形通(16)的三个出口端分别与第一阀门(11)、第二阀门(12)和第三阀门(13)连接；

所述T形通(16)与所述发酵罐(200)之间设置第一蠕动泵(21)，控制向所述发酵罐(200)输入培养基的速度；

所述过滤单元(31)的进口端通过第三蠕动泵(23)和第五阀门(15)连接至所述发酵罐(200)的底部，所述过滤单元(31)的出口端通过第二蠕动泵(22)和第四阀门(14)连接至所述发酵罐(200)的顶部。

2.如权利要求1所述的细菌用发酵罐灌流培养系统(10)，其特征在于，所述控制装置(400)连接有驱动单元，所述驱动单元包括设置于所述培养系统(10)各连接管路上的蠕动泵，通过所述蠕动泵控制连接管路内介质的流速。

3.一种使用如权利要求1所述细菌用发酵罐灌流培养系统进行灌流培养细菌的方法，其特征在于，在进行细菌发酵时，检测单元(100)实时检测发酵罐(200)内发酵菌液的OD值和溶氧值，判断OD值和溶氧值是否均在预设范围内，

是，则供给单元(300)向发酵罐(200)内输入新的培养基，并通过过滤单元(31)将发酵罐(200)内的发酵菌液过滤，将废液排出，过滤后的发酵菌液流回发酵罐(200)内，以使得OD值和溶氧值维持在所述预设范围内；

否则继续进行OD值和溶氧值的实时检测。

4.如权利要求3所述的灌流培养细菌的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下几个步骤：

A.同时开启第一阀门(11)、第二阀门(12)和第三阀门(13)，第四阀门(14)和第五阀门(15)处于关闭状态，通过输入支管(17)向供给单元(300)和发酵罐(200)注入细菌用培养基，进行高温灭菌后关闭第一阀门(11)、第二阀门(12)和第三阀门(13)，并将培养基降温至37℃-37.5℃的温度区间内；

B.关闭第二阀门(12)，将种子液与发酵用营养液通过输入支管(17)导入所述发酵罐(200)后关闭第一阀门(11)和第三阀门(13)；

C.发酵开始后，检测装置实时检测发酵罐(200)内发酵菌液的OD值和溶氧值；

D.判断OD值和溶氧值是否均在预设范围内，是，则执行步骤E，否则返回步骤C；

E.开启第二阀门(12)、第三阀门(13)、第四阀门(14)和第五阀门(15)，所述控制装置(400)控制供给单元向所述发酵罐(200)输入无菌新鲜培养基，同时控制过滤单元将发酵罐(200)内的发酵菌液过滤，将废液排出，过滤后的发酵菌液流回发酵罐(200)内。

5.如权利要求4所述的灌流培养细菌的方法，其特征在于，步骤D中所述的预设范围为细菌处于对数生长期的末期时对应的OD值和溶氧值的范围。

6.如权利要求4所述的灌流培养细菌的方法，其特征在于，步骤E中，所述控制装置(400)根据检测的OD值和溶氧值控制调整第一蠕动泵(21)、第二蠕动泵(22)和第三蠕动泵(23)的转速，进而调整相应管路内介质流速，以使得OD值和溶氧值维持在所述预设范围内。

7.如权利要求4所述的灌流培养细菌的方法，其特征在于，步骤A中所述高温灭菌的温度范围为116℃-121℃，灭菌时间为30-40min。