CN112522345B - 一种发酵、工业化生产细菌纤维素的方法 - Google Patents

一种发酵、工业化生产细菌纤维素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物领域，具体涉及一种快速发酵、工业化生产细菌纤维素的方法，该方法在种子培养基中添加纤维素酶，利用发酵罐大量快速地进行菌株培养，在静置发酵产膜阶段添加纤维素酶抑制剂，使菌株产生的纤维素可以快速大量累积，进而形成纤维素膜。本发明通过改良培养基成分，使用发酵罐在减少纤维素产生的情况下快速增加菌体量，在静置发酵时通过抑制纤维素酶的作用，保证了纤维素膜的快速产生，并可以保证纤维素膜表面平整，大幅度减少发酵时间，可广泛应用于工业化生产之中。

Description

一种发酵、工业化生产细菌纤维素的方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种缩短木醋杆菌发酵周期，大规模、工业化生产细菌纤维素膜的一种方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
纤维素是地球上最为丰富的生物大分子之一，也是一种宝贵的可再生自然资源，自然界存在的纤维素根据其来源分为植物纤维素和微生物纤维素。植物纤维素构成植物体主要的组成部分，微生物纤维素是某些微生物细胞的初级代谢特定产物，主要起保护层的作用。细菌纤维素(Bacterial Cellulose，BC)是由醋杆菌属(Acetobacter)、根瘤菌属(Rhizobium)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和八叠球菌属(Sarcina)等一些属的细菌合成的，细菌纤维素与植物纤维素具有相同的化学结构单元，是由吡喃型葡萄糖残基经β-1,4-糖苷键链接而形成的大分子高聚物，经研究发现其宏观结构和某些特性与植物纤维素有很大的不同，细菌纤维素具有极高的结晶度、聚合度及化学纯度，不含有植物纤维中存在的难以去除的半纤维素、木质素等杂多糖，这使其在造纸、纺织、化妆品、医疗等领域具有广阔的应用前景。但现有的细菌纤维素生产企业无法大规模、工业化生产细菌纤维素，并且产生的细菌纤维素膜质量不可控，无法达到较为统一的标准。
目前，细菌纤维素的发酵均采用静置发酵的方法，周期一般在5～10天，主要集中于广东、福建等地，通过将刚产生的纤维素膜切割再放入椰浆培养基中再继续培养，以此来不断产生细菌纤维素膜。此方法培养周期时间长，接种量以及菌株活力无法确定，从而产生的细菌纤维素膜的质量无法进行很好的控制。
有研究显示，在种子扩培阶段的种子培养基中添加纤维素酶以扩大菌株量，用于扩大培养。但发明人发现：该方法对添加的纤维素酶的浓度有限制，同时种子培养液中的纤维素酶会影响后期静置培养成膜的韧性，对纤维素膜的质量产生较大影响。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷和不足，本发明提供了一种高密度培养木醋杆菌，高质量产生细菌纤维素膜的方法，该方法在种子培养基中添加纤维素酶，利用发酵罐大量快速地进行菌株培养，在静置发酵产膜阶段添加纤维素酶抑制剂，使菌株产生的纤维素可以快速大量累积，进而形成纤维素膜。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一个方面，提供了一种发酵、工业化生产细菌纤维素的方法，包括：种子扩培阶段和静置发酵阶段；在种子扩培阶段添加纤维素酶，在静置发酵阶段添加纤维素酶抑制剂。
本发明通过改良培养基成分，使用发酵罐在减少纤维素产生的情况下快速增加菌体量，在静置发酵时通过抑制纤维素酶的作用，保证了纤维素膜的快速产生，并可以保证纤维素膜表面平整，大幅度减少发酵时间，可广泛应用于工业化生产之中。
本发明的第二个方面，提供了任一上述的方法制备的细菌纤维素膜。
本发明制备的纤维素膜不仅快速产生，而且表面平整，大幅度减少发酵时间，可广泛应用于工业化生产之中。
本发明的第三个方面，提供了上述的细菌纤维素膜在在造纸、纺织、化妆品或医疗领域中的应用。
由于本发明可以高密度培养木醋杆菌，高质量快速产生细菌纤维素膜，因此，有望在造纸、纺织、化妆品或医疗领域中得到广泛的应用。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供了一种高密度培养木醋杆菌，高质量产生细菌纤维素膜的方法，该方法在种子培养基中添加纤维素酶，利用发酵罐大量快速地进行菌株培养，在静置发酵产膜阶段添加纤维素酶抑制剂，使菌株产生的纤维素可以快速大量累积，进而形成纤维素膜。
(2)本发明提供了一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法，包括种子扩培和静置发酵两个阶段，在种子扩培阶段添加纤维素酶，在静置发酵阶段添加不同的纤维素酶抑制剂，用于抑制纤维素酶的作用，保证细菌纤维素膜可以快速生成。
(3)本发明通过改良培养基成分，使用发酵罐在减少纤维素产生的情况下快速增加菌体量，在静置发酵时通过抑制纤维素酶的作用，保证了纤维素膜的快速产生，并可以保证纤维素膜表面平整，大幅度减少发酵时间，可广泛应用于工业化生产之中。
(4)本发明研究发现：胃蛋白酶抑制剂可以与纤维素酶活性中心上的一些基团进行结合，使纤维素酶活力下降，甚至消失，羧甲基纤维素、透明质酸钠及燕麦葡聚糖等中有可以与酶活性中心相结合的基团，引起酶构象分子发生不利于结合纤维素的变化；同时，上述几种物质对细菌纤维素膜的不良影响小，成膜速率和强度较优。
(5)本发明的方法简单、操作方便、实用性强，易于推广。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的技术方案提供了一种缩短细菌纤维素发酵周期的培养方法，包括种子扩培和静置发酵两个阶段，在种子扩培阶段添加纤维素酶，在静置发酵阶段添加不同的纤维素酶抑制剂，用于抑制纤维素酶的作用，保证细菌纤维素膜可以快速生成。
所述纤维素酶抑制剂为胃蛋白酶抑制剂、羧甲基纤维素钠溶液、透明质酸钠或燕麦葡聚糖。
研究发现：某些抑制剂虽然可以抑制纤维素酶的活性，但对细菌纤维素膜的生成也会产生不良影响。为了获得较优的细菌纤维素膜生成速率，本发明对各种纤维素酶抑制剂进行系统研究和实验筛选，发现：胃蛋白酶抑制剂、羧甲基纤维素、透明质酸钠及燕麦葡聚糖等对细菌纤维素成膜的不良影响小，成膜速率和强度较优。这可能是由于胃蛋白酶抑制剂可以与纤维素酶活性中心上的一些基团进行结合，使纤维素酶活力下降，甚至消失。羧甲基纤维素、透明质酸钠及燕麦葡聚糖等中有可以与酶活性中心相结合的基团，引起酶构象分子发生不利于结合纤维素的变化。
本发明的一些实施方式中，纤维素酶的添加量为1‰，酶活性为500～1000EGU/mL，除菌方式为过滤除菌。
本发明的一些实施方式中，种子扩培为先将斜面菌种接种于含纤维素酶的培养基中培养，再将培养后的菌液接种于种子罐中培养，同时添加纤维素酶。
本发明的一些实施方式中，摇瓶培养的转速为100～300rpm，温度为25～35℃，培养时间为16～24h。
本发明的一些实施方式中，菌种选自木醋杆菌。
本发明的一些实施方式中，种子罐培养的搅拌转速为100～300r/min，温度为28～32℃，通气量为2-5vvm，培养时间为16～24h。
本发明的一些实施方式中，待菌株发酵结束，将适合的浓度纤维素酶抑制剂加入到发酵好的种子液中。
在本发明的一些实施方式中，静置发酵产膜阶段是指将发酵结束添加有纤维素酶抑制剂的种子液接种到静置发酵产纤维素的培养基混匀，然后，灌注到浅盘中进行静置发酵，发酵时间到后进行发酵终止，将膜捞出。
在本发明的一些实施方式中，静置发酵产膜培养阶段，在洁净度为百级的环境下进行。
在本发明的一些实施方式中，浅盘培养时在28～32℃条件下，静置发酵培养72～96h，浅盘中发酵液的添加深度为2cm～3cm。
在本发明的一些实施方式中，种子培养基各个组分的培养基成分(g/L)葡萄糖，15；蛋白胨，15；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。150rpm，30℃，24h。发酵培养基的组成成分为(g/L)葡萄糖，20；蔗糖，10；蛋白胨，5；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。
下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
以下对照例和实施例中，纤维素酶的活性为700EGU/mL。
木醋杆菌的菌种编号：ATCC23767，购置于中国微生物菌种查询网。
对照例
配制摇瓶种子培养基6L，配制种子罐培养基60L。
其中种子摇瓶和种子罐的培养基配方是一致的，培养基成分(g/L)均为：葡萄糖，15；蛋白胨，15；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。种子摇瓶采用1L的三角瓶装液量300mL，种子罐采用100L机械搅拌发酵罐装液量60L。
配制静置发酵产纤维素培养基配方如下：
培养基成分(g/L)葡萄糖，20；蔗糖，10；蛋白胨，5；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。
首先活化菌株，将一支木醋杆菌试管斜面菌苔用接种铲全部接种到一瓶装有已灭菌的100mL种子培养基摇瓶中，30℃振荡培养12h后，以1％的接种量接种入20瓶300mL种子培养基摇瓶中，作为一级种子液，30℃振荡培养12h后，接种到装有已经灭好菌的60L静置发酵培养基的发酵罐中，对已经灭菌彻底的培养基添加纤维素酶添加经过过滤除菌的纤维素酶溶液，添加浓度为1‰。种子罐中的通气量为2vvm，罐压为0.05MPa，搅拌速度为150r/min，培养24h后，将种子液停止发酵，转接至灭菌的静置发酵产纤维素培养基，接种量为6％，同时对种子液进行平板计数，经混合罐混匀后在无菌环境下，注入到浅盘中，浅盘中静置发酵液厚度控制在3cm左右，培养3天后观察，所有浅盘的纤维素膜厚度，并进行收膜处理，同时随机留4-5个浅盘培养4天收膜。
实验结果见表1
实施例1：添加胃蛋白酶抑制剂。
培养基的配制：
配制摇瓶种子培养基6L，配制种子罐培养基60L。
其中种子摇瓶和种子罐的培养基配方是一致的，均为：培养基成分(g/L)葡萄糖，20；蛋白胨，5；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。种子摇瓶采用1L的三角瓶装液量300mL，种子罐采用100L机械搅拌发酵罐装液量60L。
配制静置发酵产纤维素培养基配方如下：
培养基成分(g/L)葡萄糖，20；蔗糖，10；蛋白胨，5；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。
胃蛋白酶抑制剂溶液制备：称取胃蛋白酶抑制剂(购置于索莱宝公司，CAS号26305-03-3)，1mg/mL溶于甲醇中，溶解后，放入4℃条件下稳定一周。添加剂量为1mL/L，60L种子发酵液中添加60mL胃蛋白酶抑制剂溶液。
使用0.22μm的滤膜对纤维素酶和胃蛋白酶抑制剂溶液进行过滤除菌，此操作在超净台内进行。
首先活化菌株，将一支木醋杆菌试管斜面菌苔用接种铲全部接种到一瓶装有已灭菌的100mL种子培养基摇瓶中，30℃振荡培养12h后，以1％的接种量接种入20瓶300mL种子培养基摇瓶中，作为一级种子液，30℃振荡培养12h后，接种到装有已经灭好菌的60L静置发酵培养基的发酵罐中，对已经灭菌彻底的培养基添加纤维素酶添加经过过滤除菌的纤维素酶溶液，添加浓度为1‰。在100L的发酵罐中添加纤维素酶，种子罐中的通气量为2vvm，罐压为0.05MPa，搅拌速度为150r/min，培养24h后，将种子液停止发酵，加入经过滤除菌的胃蛋白酶抑制剂，混合均匀后，转接至灭菌的静置发酵产纤维素培养基，接种量为6％，同时对种子液进行平板计数，在混合罐混匀后在无菌环境下，注入到浅盘中，浅盘中静置发酵液厚度控制在3cm左右，培养3天观察所有浅盘的纤维素膜厚度，此时所有的培养基被利用完，收膜处理，同时随机留4-5个浅盘再培养4天收膜。
实验结果见表1
实施例2：添加羧甲基纤维素钠溶液。
配制摇瓶种子培养基6L，配制种子罐培养基60L。
其中种子摇瓶和种子罐的培养基配方是一致的，培养基成分(g/L)为：葡萄糖，20；蛋白胨，5；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。种子摇瓶采用1L的三角瓶装液量300mL，种子罐采用100L机械搅拌发酵罐装液量60L。
配制静置发酵产纤维素培养基配方如下：
培养基成分(g/L)葡萄糖，20；蔗糖，10；蛋白胨，5；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。
配制羧甲基纤维素钠溶液，首先称取63g羧甲基纤维素钠，先使用一定量的纯化水将其进行溶解，再放置于60℃水浴锅中加速溶解，待溶解完全后，冷却，使用纯化水定容至3L。将配制好的羧甲基纤维素钠溶液灭菌后加入到发酵结束后的种子液中，最终的羧甲基纤维素钠的添加量为1g/L。
首先活化菌株，将一支木醋杆菌试管斜面菌苔用接种铲全部接种到一瓶装有已灭菌的100mL种子培养基摇瓶中，30℃振荡培养12h后，以1％的接种量接种入20瓶300mL种子培养基摇瓶中，作为一级种子液，30℃振荡培养12h后，接种到装有已经灭好菌的60L静置发酵培养基的发酵罐中，对已经灭菌彻底的培养基添加纤维素酶添加经过过滤除菌的纤维素酶溶液，添加浓度为1‰。在100L的发酵罐中添加纤维素酶，种子罐中的通气量为2vvm，罐压为0.05MPa，搅拌速度为150r/min，培养24h后，将种子液停止发酵，加入经灭菌的羧甲基纤维素钠溶液，混合均匀后，转接至灭菌的静置发酵产纤维素培养基，接种量为6％，同时对种子液进行平板计数，在混合罐混匀后在无菌环境下，注入到浅盘中，浅盘中静置发酵液厚度控制在3cm左右，培养3天后观察所有浅盘的纤维素膜厚度，此时所有的培养基被利用完，收膜处理，同时随机留4-5个浅盘再培养3天收膜。
实施例3：添加透明质酸钠。
配制摇瓶种子培养基6L，配制种子罐培养基60L。
其中种子摇瓶和种子罐的培养基配方是一致的，培养基成分(g/L)为：葡萄糖，20；蛋白胨，5；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。种子摇瓶采用1L的三角瓶装液量300mL，种子罐采用100L机械搅拌发酵罐装液量60L。
配制静置发酵产纤维素培养基配方如下：
培养基成分(g/L)葡萄糖，20；蔗糖，10；蛋白胨，5；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。
配制透明质酸钠溶液，首先称取63g透明质酸钠，先使用一定量的纯化水将其进行溶解，不断搅拌，待其完全溶解后，使用纯化水定容至3L。将配制好的透明质酸钠溶液灭菌后加入到发酵结束后的种子液中，最终的透明质酸钠的添加量为1g/L。
首先活化菌株，将一支木醋杆菌试管斜面菌苔用接种铲全部接种到一瓶装有已灭菌的100mL种子培养基摇瓶中，30℃振荡培养12h后，以1％的接种量接种入20瓶300mL种子培养基摇瓶中，作为一级种子液，30℃振荡培养12h后，接种到装有已经灭好菌的60L静置发酵培养基的发酵罐中，对已经灭菌彻底的培养基添加纤维素酶添加经过过滤除菌的纤维素酶溶液，添加浓度为1‰。在100L的发酵罐中添加纤维素酶，种子罐中的通气量为2vvm，罐压为0.05MPa，搅拌速度为150r/min，培养24h后，将种子液停止发酵，加入经灭菌的透明质酸钠溶液，混合均匀后，转接至灭菌的静置发酵产纤维素培养基，接种量为6％，同时对种子液进行平板计数，在混合罐混匀后在无菌环境下，注入到浅盘中，浅盘中静置发酵液厚度控制在3cm左右，培养3天观察所有浅盘的纤维素膜厚度，此时所有的培养基被利用完，收膜处理，同时随机留4-5个浅盘再培养3天收膜。
实施例4：添加燕麦葡聚糖。
配制摇瓶种子培养基6L，配制种子罐培养基60L。
其中种子摇瓶和种子罐的培养基配方是一致的，培养基成分(g/L)为：葡萄糖，20；蛋白胨，5；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。种子摇瓶采用1L的三角瓶装液量300mL，种子罐采用100L机械搅拌发酵罐装液量60L。
配制静置发酵产纤维素培养基配方如下：
培养基成分(g/L)葡萄糖，20；蔗糖，10；蛋白胨，5；磷酸氢钠，2.7；一水合柠檬酸，1.15；使用HCl或NaOH调节pH值到5。
配制燕麦葡聚糖溶液，首先称取63g燕麦葡聚糖，先使用一定量的纯化水将其进行溶解，不断搅拌，待其完全溶解后，使用纯化水定容至3L。将配制好的燕麦葡聚糖溶液灭菌后加入到发酵结束后的种子液中，最终的燕麦葡聚糖的添加量为1g/L。
首先活化菌株，将一支木醋杆菌试管斜面菌苔用接种铲全部接种到一瓶装有已灭菌的100mL种子培养基摇瓶中，30℃振荡培养12h后，以1％的接种量接种入20瓶300mL种子培养基摇瓶中，作为一级种子液，30℃振荡培养12h后，接种到装有已经灭好菌的60L静置发酵培养基的发酵罐中，对已经灭菌彻底的培养基添加纤维素酶添加经过过滤除菌的纤维素酶溶液，添加浓度为1‰。在100L的发酵罐中添加纤维素酶，种子罐中的通气量为2vvm，罐压为0.05MPa，搅拌速度为150r/min，培养24h后，将种子液停止发酵，加入经灭菌的燕麦葡聚糖溶液，混合均匀后，转接至灭菌的静置发酵产纤维素培养基，接种量为6％，同时对种子液进行平板计数，在混合罐混匀后在无菌环境下，注入到浅盘中，浅盘中静置发酵液厚度控制在3cm左右，培养3天观察所有浅盘的纤维素膜厚度，此时所有的培养基被利用完，收膜处理，同时随机留4-5个浅盘再培养3天收膜。
以上对照例及实施例相关收膜后处理方式：先用清水将膜表面的杂质洗干净，然后放到1％氢氧化钠溶液浸泡24h，期间换碱液三次，再使用稀盐酸调节至中性，最后使用纯化水清洗，所得细菌纤维素膜。
平板计数方法：将菌液用无菌生理盐水(0.85％)进行10倍稀释，然后涂布固体种子平板培养基，30℃静置培养5天后计数，最后换算为单位体积菌液所含菌量。
杨氏模量检测方法：使用CH-1-SST型塑料薄膜薄片测厚仪测定BC膜的多处厚度取平均值。用微机控制电子万能试验机(RG-5)来测定BC膜的拉伸强度和断裂伸长率，首先截取长度为10cm、宽度为1cm的BC，速度为5mm/s，当BC片拉伸后开始记录为零应力。拉伸强度采用下面公式计算：
Figure GDA0003569996180000121
若记录仪器在操作过程中的断裂伸长率为
Figure GDA0003569996180000122
根据胡克定律，在物体的弹性限度内，应力与应变成正比，其比例系数为杨氏模量，用E表示，则：
Figure GDA0003569996180000123
实验结果见表1
表1培养过程中各项参数测试结果如下：
Figure GDA0003569996180000124
Figure GDA0003569996180000131
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (7)

1.一种发酵、工业化生产细菌纤维素的方法，其特征在于，包括：种子扩培阶段和静置发酵阶段；在种子扩培阶段添加纤维素酶，菌株发酵结束后，将纤维素酶抑制剂加入到发酵好的种子液中；将添加有纤维素酶抑制剂的种子液接种到静置发酵产纤维素的培养基混匀，然后，灌注到浅盘中进行静置发酵，产膜；
所述纤维素酶抑制剂为胃蛋白酶抑制剂，所述菌株为木醋杆菌。
2.如权利要求1所述的发酵、工业化生产细菌纤维素的方法，其特征在于，种子发酵液中，纤维素酶抑制剂的浓度为1～1.5g/L。
3.如权利要求1所述的发酵、工业化生产细菌纤维素的方法，其特征在于，静置发酵产膜培养阶段，在洁净度为百级的环境下进行。
4.如权利要求1所述的发酵、工业化生产细菌纤维素的方法，其特征在于，浅盘培养时在28～32℃条件下，静置发酵培养72～96h，浅盘中发酵液的添加深度为2cm～3cm。
5.如权利要求1所述的发酵、工业化生产细菌纤维素的方法，其特征在于，种子扩培阶段，培养基中，纤维素酶的添加量为1～1.5‰。
6.权利要求1-5任一项所述的方法制备的细菌纤维素膜。
7.权利要求6所述的细菌纤维素膜在造纸、纺织、化妆品或医疗领域中的应用。
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