KR20140069622A

KR20140069622A - 최적의 배지 조성을 이용한 글루콘아세토박터 속 kcg326 균주에 의한 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법

Info

Publication number: KR20140069622A
Application number: KR1020120137119A
Authority: KR
Inventors: 박만용; 조영수; 최영훈; 김상숙; 박석만; 박경진; 김광식
Original assignee: 농업회사법인 주식회사 자담
Priority date: 2012-11-29
Filing date: 2012-11-29
Publication date: 2014-06-10
Also published as: KR101435582B1

Abstract

본 발명은 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 이용한 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법을 개시한다. 구체적으로 본 발명은 보조 탄소원으로서 에탄올이나 아세트산을 사용하고 첨가물로서 감귤 착즙액을 사용함으로써 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주에 의한 박테리아 셀룰로오스 생산 수율을 높일 수 있는 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법을 개시한다.

Description

글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 이용한 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법{Method for Producing Bacterial Cellulose Using Gluconacetobacter sp. KCG326 Strain}

본 발명은 글루콘아세토박터 속(Gluconacetobacter sp .) KCG326 균주(KACC 91555P)를 이용한 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법에 관한 것이다.

최근 천연 다당류 생산에 많은 관심이 집중되고 있으며, 이러한 다당류들은 생물고분자(biopolymer) 또는 생분해성 고분자(biodegradable polymer)로 불리고 있다. 특히 이들 고분자들 중에서 미생물 유래의 박테리아 셀룰로오스(bacterial cellulose)는 베타-디-글루코피라노스(β-D-glucopyranose)와 베타-1,4-글루코시드(β-1,4-glucoside)가 결합된 긴 사슬들이 수소결합으로 유지된 리본형 섬유(ribbin-like bundles)형태로, 미세섬유(microfibrils) 묶음(bundles) 형태인 식물 유래의 셀룰로오스와 구조적 차이를 보인다.

박테리아 셀룰로오스는 식물 유래 셀룰로오스와는 다르게 셀룰로오스 외에 다른 성분들을 포함하지 않아 분리 및 정제가 용이하다. 즉 식물의 경우 셀룰로오스 뿐만 아니라 헤미셀룰로오스(hemicellulose)나 리그닌(lignin) 등이 포함되어 있는 결정형 구조를 가지고 있으나, 박테리아 셀룰로오스의 경우에는 박테리아에 의해 생성된 셀룰로오스 외에 다른 불순물이 포함되어 있지 않기 때문에 이에 대한 분리 및 정제가 용이하다. 박테리아 유래 셀룰로오스는 필름상으로 얻을 수 있는 유일한 천연 셀룰로오스로서 그 특성이 주목받게 되어 유용한 소재로서 다양한 연구가 진행되어 왔다.

현재 셀룰로오스를 생산하는 균주로는 아세토박터 속(Acetobacter sp ., 초산균), 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp .), 리조비움 속(Rhizobium sp .), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp .), 사르시나 속(Sarcina sp .) 등이 있으며, 특히 아세토박터 속(Acetobacter sp .) 중에 아세토박터 자이리움(Acetobacter xylium), 아세토박터 파스테우리아누스(A. pasteurinanus) 및 아세토박터 한세니(A. hansenii)가 많이 알려져 있다. 최근 16S rRNA 염기서열을 이용하여 분자계통분류학적으로 재분류하고 있으며, 순도가 높은 셀룰로오스를 생성하는 균주의 특징은 형태학적으로 장간균이고, 내산성력이 강한 세균으로 균체에서 셀룰로오스를 분비하는 것으로 보고되어 있다.

1886년 브라운에 의하여 초산균(acetic acid bacteria)이 박테리아 셀룰로오스를 생성한다는 보고가 있은 이래, 초산균은 셀룰로오스 생산 능력이 뛰어나 주된 연구 대상이 되어 왔다. 박테리아 셀룰로오스는 일반 식물체가 생산한 셀룰로오스에 비하여 결정화도가 높고 기계적 강도와 흡착성, 보수성, 현탁 안정성, 결착성 등의 물리적인 성질이 우수하여 식품 첨가제, 공업용 재료, 의료용 재료 등 다양한 분야에서 소재의 실용화가 진행되고 있다. 이에 따라 정치 배양에서 셀룰로오스 수율이 높은 균주 개발, 통기 배양에 적합한 균주를 개발 및 효과적인 배양 조건을 확립하는 등으로 생산성을 높이기 위한 연구가 진행되고 있다.

박테리아 셀룰로오스를 생산하는 균주들은 생장하는 동안 통상 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose), 당밀(molasses), 프룩토오스(fructose), 만니톨(mannitol), 글리세롤(glycerol) 등을 탄소원으로 사용하고, 감즙 및 감식초, 사과즙, 포도즙, 맥주폐액 및 코코넛 부산물 등을 보조 탄소원으로 사용하며(S. Masaoka et al., J. Ferment. Bioeng. 75, 1993, 18-22), 카제인(casein), 펩톤(peptone), 효모 추출물(yeast extract) 등을 질소원으로 사용하지만(K.V. Ramana et al., World J. Microbial. Biotechnol. 16, 2000, 245-248; Y.K. Yang et al., J. Ferment. Bioeng. 85, 1998, 312-317), 균주에 따라 최적의 탄소원과 보조 탄소원, 질소원이 각각 다르다.

다양한 종류의 탄소원과 보조 탄소원 그리고 질소원 중 최적의 것을 선택하여 적정 농도의 배양조건을 확립하는 것은 비용적 측면에서 중요할 뿐만 아니라 영양분의 부족으로 인한 수율 저하 억제, 과도한 탄소원의 소비로 촉발되는 부산물의 축적 저해 등을 통해 수율 향상 효과를 낼 수 있기 때문에 중요하다. 관련하여, 한국공개특허 제2003-0088596호에서는 아세토박터 자이리움 KJ 균주 배양시에 탄소원으로 0.5% 글루코스, 1.5% 프록토스를 사용하여 수율을 향상시킨 조건을 개시하였으며, 한국공개특허 제1997-0001555호에서는 아세토박터 자이리움 ATCC 53582균주에 초산이 함유된 과일쥬스나 20%의 글루코스를 사용하여 셀룰로오스를 생산하는 배양 방법을 개시하였다. 또한 유럽 등록특허 제279506호에서는 성장단계에 따라 탄소원의 농도를 제한하여 수율을 향상시키는 방법을 개시하였다.

본 발명도 박테리아 셀룰로오스의 생성능이 확인된 글루콘아세토박터 속 KCG326(기탁번호: KACC 91555P)를 이용하여 박테리아 셀룰로오스를 생성할 때, 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율을 높일 수 있는 최적의 탄소원, 질소원, 보조 탄소원, 첨가물 등에 대한 배양 조건을 개시한다.

본 발명의 목적은 글루콘아세토박터 속 KCG326에 의한 박테리아 셀룰로오스 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 이용하여 박테리아 셀룰로오스를 제조하는 데 있어서, 탄소원으로서 수크로오스, 글로코오스, 락토오스, 프룩토오스, 말토오스 및 만니톨을, 효모 추출물 1%(w/w) 및 정제수로 구성된 배지에 10%(w/w)의 농도로 처리하여 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율을 살펴 봤는데, 수크로오스에서 박테리아 셀룰로오스의 생산량이 27.2 g/m²로 가장 수율이 높음을 확인할 수 있었다. 이러한 실험 결과는 박테리아 셀룰로오스 생산에 있어 일반적인 탄소원이 글루코오스로 알려져 있는 것(Masaoka S, et al., J. Fermen. Bioeng., 75, 18-22, 1993)과는 상이한 것으로, 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 이용하여 박테리아 셀룰로오스를 제조할 경우 가장 적합한 탄소원이 수크로오스임을 말해주는 것이라 할 수 있다.

글루콘아세토박터 속 KCG326 균주는 농촌진흥청이 홍차버섯 발효물에서 분리된 균주로 2010년 6월 9일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁번호 KACC 91555P로 기탁되어 있는 균주이다.

나아가 본 발명자들은 상기 실험 결과에 기초하여 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율이 가장 높은 수크로오스의 배지 첨가 농도를 달리하여 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율을 확인하였을 때 9%(w/w)의 첨가 농도에서 박테리아 셀룰로오스 생산량이 33.0g/m²으로 나타나 가장 높았음을 확인하였다.

또 나아가 본 발명자들은 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주에 의한 박테리아 셀룰로오스의 생산에 있어 가장 적합한 질소원을 확인하고자 효모 추출물, 폴리펩톤, 트립톤, 맥아 추출물, 콘 스트립 리커(corn streep liquor) 및 소이톤을, 수크로오스 9%(w/w) 및 정제수로 구성된 배지에 0.1%(w/w)로 첨가하여 박테리아 셀룰로오스 생산 수율을 살펴봤을 때, 효모 추출물 처리 시 40.0g/m²을 나타내고 소이톤 처리 시 33.8g/m²을 나타냄을 확인할 수 있었으며, 이들 질소원의 최적의 처리 농도를 확인하고자 0.05%(w/w) 내지 0.45%(w/w) 범위로 처리했을 때, 효모 추출물의 경우는 0.1%(w/w)의 처리 농도에서 그리고 소이톤의 경우는 0.20%(w/w)의 처리 농도에서 각각 40.0g/m² 및 43.2g/m²의 생산 수율을 보임을 확인할 수 있었다.

또 나아가 본 발명자들은 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주에 의한 박테리아 셀룰로오스의 생산에 있어 가장 적합한 보조 탄소원을 확인하고자 젖산, 시트르산, 숙신산, 아세트산, 에탄올, 포름산, 말산, 및 피부르산을, 수크로오스 9%(w/w), 효모 추출물 0.1%(w/w) 및 정제수로 구성된 배지에 0.5%(w/w)로 첨가하여 박테리아 셀룰로오스 생산 수율을 살펴봤을 때, 에탄올 첨가 시 45.1g/m², 아세트산 첨가 시 43.3g/m²으로 나타남을 확인하였으며, 이들 생산 수율이 우수한 보조 탄소원인 에탄올과 아세트산의 최적의 처리 농도를 확인하고자 0.5%(w/w) 내지 2.0%(w/w)로 처리하였을 때, 에탄올은 1.0%(w/w)의 처리 농도에서 50.2g/m², 아세트산은 1.0%(w/w)의 처리 농도에서 52.4g/m²의 생산 수율을 보임을 확인할 수 있었다.

또 나아가 본 발명자들은 감귤(온주 밀감) 착즙액이 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주에 의한 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율에 미치는 영향을 탐색하였는데, 수크로오스 9%(w/w), 효모 추출물 0.1%(w/w), 에탄올 1%(w/w) 및 정제수로 구성된 배지에 감귤 착즙액 2%(w/w) 내지 14%(w/w) 처리 시 전체적으로 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율이 0.3g/m² 내지 2.7g/m²로 상승하였지만 처리 농도 10%(w/w)에서 최대 2.7g/m² 상승함을 확인하였다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 이용한 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법은 (a) 탄소원, 질소원 및 보조 탄소원을 함유하는 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지를 제조하는 단계, (b) 이 배지에 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 접종하는 단계, (c) 접종 후 호기적 조건에서 배양하는 단계, 및 (d) 그 배양액으로부터 박테리아 셀룰로오스를 수득하는 단계를 포함하되, 상기 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 보조 탄소원으로서 아세트산과 에탄올 중 하나 이상을 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서, "효모 추출물"은 사카로마이세스 속(Saccharomyces spp .) 효모 세포의 기계적·화학적 파괴 후 화학적 분해에 의하여 얻어지는 분해물을 의미한다. 구체적으로 효모 세포의 산 가수분해물 또는 효모 세포의 기계적·화학적 파괴 후 효모의 내인성 효소로 자가 분해하여 얻어진 분해물을 의미하며, 내인성 효소 활성을 높이기 위하여 프로테아제, 펩티다아제, 뉴클레아제 등의 외인성 효소가 첨가되어지는 경우가 있는데, 상기 효모 추출물은 이러한 외인성 효소가 첨가되어 얻어진 효모 분해물을 포함하는 의미이다. 자가 분해에 의하여 얻어진 분해물은 통상 세포 파편이 제거된 후 일반적으로 저온 살균되고 농축되어 이용되고 있다. 효모 추출물은 일반적으로 아미노산, 단백질, 펩타이드, 비타민, 탄수화물, 뉴클레오타이드, 인산 등의 염 등을 포함하고 있으며, 효모 추출물의 제조와 관련한 구체적인 내용은 문헌[Kelly, M. (1982) Yeast Extract (In: Industrial Enzymology, Godfrey, T. ed.)], 문헌[Chae, H. J. et al. (2001), Bioresource Technology 76:253-258] 등을 참조할 수 있다. 바람직하게는 아래의 실시예에서 사용된 효모 세포의 파괴 후 효모의 내인성 효소로 자가 분해하여 얻어지는 분말상의 분해물을 말한다.

또 본 명세서에서, "소이톤"은 대두의 기름을 추출하고 남은 부산물인 탈지 대두박(defatted soybean meal)을 췌장 효소(pancreatic enzymes) 또는 췌액(pancreatic juice)으로 분해한 후 얻어지는 분해물을 말하며, 바람직하게는 아래의 실시예에서 사용된 그 분해물이 농축되어 얻어진 분말상의 분해물을 말한다. 췌장 효소는 리파아제 등의 지방분해효소, 트립신 등의 단백분해효소, α-아밀라아제 등의 당분해효소를 포함하며, 췌액은 대부분 췌장 효소로 이루어져 있다.

본 명세서에서, "감귤 착즙액"은 감귤 과실을 과피를 제거한 기계적으로 분쇄·압착하여 얻어진 것으로 여기서 감귤 과실은 과육과 과피를 포함하는 감귤 원과 또는 과피가 제거된 감귤 과육일 수 있다. 감귤 원과를 사용하였을 경우, 감귤 과피에 함유된 펙틴을 분해함으로써 접종될 미생물인 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주에 의한 이용이 용이하도록 그 펙틴을 분해하기 위한 펙틴분해효소를 압착 전의 감귤 분쇄액에 첨가하여 반응시키는 단계가 추가될 수 있으며, 과육 및/또는 과피의 셀룰로오스를 분해할 목적으로 셀룰라아제를 압착 전의 감귤 분쇄액에 첨가하여 반응시키는 단계도 추가될 수 있다. 여기서 감귤은 유럽 남부 등지에서 재배되는 시트론(citron), 미국 캘리포니아 등지에서 재배되는 레몬(lemon), 열대 지방 등지에서 재배되는 문단이나 자몽 등의 문단류, 미국의 플로리디 등지에 재배되는 문단의 돌연변이종인 그레이프 프루트(grape fruit), 인도, 이탈리아 등지에서 재배되는 광귤(sour orange), 인도 등 세계 각지에서 재배되는 당귤, 중국이나 우리나라에서 재배되는 유자(柚子), 우리나라 제주도 등에서 재배되는 귤, 중국 등에서 재배되는 금감, 기타 탱귤 등을 모두 포함하는 의미이다. 바람직하게는 제주도에서 재배되고 있는 하귤(Citrus natsudaidai Hayata), 온주 밀감(Citrus unshiu), 진귤, 한라봉, 진지향, 천혜향, 당유자 등을 의미하며, 특히 아래의 실시예에서 사용된 온주 밀감(Citrus unshiu)을 의미한다.

또 본 명세서에서, "%(w/w)"는 본 명세서에서 특별히 달리 언급하지 않는 한, 중량 백분율에 의한 농도(w/w) 표현으로서 당업계에 알려진 바와 같이 일정 중량의 용액 중에 녹아 있는 일정 중량의 용질을 의미한다. 예컨대 10%(w/w)는 용액 100g에 용질 10g이 용해되어 있다는 것이 된다. 따라서 본 발명의 방법에 있어서, 수크로오스가 배지에 9%(w/w)로 첨가된다고 할 때 정제수 등의 여타 배지 성분 91 중량%(w/w)와 수크로오스 9 중량%(w/w)가 혼합된다는 의미로서 이해될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지의 탄소원으로서는 글루코오스, 수크로오스, 말토오스, 프룩토오스, 락토오스, 자일로오스, 갈락토오스, 아라비노오스, 글리세롤, 이들 성분이 포함되어 있는 전분, 전분 가수분해물 등이 사용될 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 또는 2종 이상의 혼합물로 상기 배지에 포함될 수 있으며, 단독으로 배지에 포함되든, 2종 이상의 혼합물로 배지에 포함되든 5%(w/w) 내지 20%(w/w)의 범위로 배지에 포함될 수 있다. 전분이나 전분 가수분해물 등 천연물 또는 천연물 가공물을 탄소원으로 사용할 경우 타 미생물에 의한 원치 않는 발효를 방지하기 위해서 이들 탄소원을 멸균하여 사용할 수 있다. 멸균은 고온·고압 멸균법, 자외선 조사 등 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지가 탄소원으로서 수크로오스만을 포함할 때 8%(w/w) 내지 10%(w/w), 전술한 바의 이유에서 특히 9%(w/w)로 포함하여 제조되는 것이 바람직하다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지의 질소원으로서는 효모 추출물(yeast extract), 소이톤(soytone), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 맥아 추출물(malt extract), 콩 분말, 콩 비지 분말, 청국장 분말, 된장 분말 등의 천연 질소원, 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 등의 암모늄염, 질산염, 유레아 등의 유·무기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원도 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 배지에 0.1%(w/w) 내지 8.0%(w/w)의 범위로 포함될 수 있다. 천연 질소원을 사용할 경우 천연 탄소원을 사용할 경우와 관련하여 설명한 바와 동일한 이유에서 멸균하여 사용하는 것이 바람직하다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지가 질소원으로서 효모 추출물만을 포함할 때, 0.05%(w/w) 내지 0.15%(w/w), 마찬가지로 전술한 바의 이유에서 특히 0.10%(w/w)로 포함하여 제조되는 것이 바람직하다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 질소원으로서 소이톤만을 포함할 경우 0.10%(w/w) 내지 0.30%(w/w), 마찬가지로 전술한 바의 이유에서 특히 0.20%(w/w)로 포함하여 제조되는 것이 바람직하다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 보조 탄소원으로서 에탄올만을 포함할 경우 0.5%(w/w) 내지 1.5%(w/w), 마찬가지로 전술한 바의 이유에서 특히 1.0%(w/w)로 포함하여 제조되는 것이 바람직하다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 보조 탄소원으로서 아세트산만을 포함할 경우 0.5%(w/w) 내지 2.0%(w/w), 마찬가지로 전술한 바의 이유에서 특히 1.0%(w/w)로 포함하여 제조되는 것이 바람직하다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율을 향상시키기 위하여 첨가물로서 감귤 착즙액을 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 감귤 착즙액의 첨가 범위는 2%(w/w) 내지 14%(w/w)이며, 전술한 바의 이유에서 특히 10%(w/w)로 첨가되는 것이 바람직하다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 접종될 미생물이 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주인 점을 고려할 때 그 pH는 pH 3 내지 7.0, 특히 pH 3 내지 6 범위인 것이 바람직하다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 무기염류와 미량원소를 추가로 포함하여 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 무기염류로서는 인산수소나트륨, 황산마그네슘, 염화철, 칼슘염, 망간염, 코발트염, 몰리브텐산염, 킬레이트금속염 등을 들 수 있으며, 미량원로소로서는 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 아황산 펄프 폐액 등을 들 수 있다. 이들 무기염류와 미량원소는 1종 이상 혼합하여 사용될 수 있으며, 0.001%(w/w) 내지 3.0%(w/w)의 범위로 배지에 포함될 수 있다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (a) 단계에서 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지가 제조된 후에는 멸균 단계가 추가로 포함될 수 있다. 이러한 멸균 단계는 타 미생물의 오염을 방지하기 위한 것이며, 결과적으로 박테리아 셀룰로오스 생산 수율을 높이기 위한 것이다. 멸균 방법은 고온·고압 멸균법, 자외선 조사 등 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (b) 단계의 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주은 그 접종 전에 그 활성화를 위해서 전 배양 후 접종되는 것이 바람직하다. 전 배양에서 바람직한 배지 성분, 그 성분의 조성, 전 배양 조건, 전 배양 기간, 전 배양액의 접종량 등은 아래의 실시예를 참조할 수 있다.

또 본 발명의 방법에 있어서, 상기 (c) 단계의 배양은 배양 온도는 10 내지 40℃의 범위, 특히 25 내지 35℃ 범위인 것이 바람직하며, 배양 기간은 5일 내지 20일 것이 바람직하다.

또 본 발명의 상기 (c) 단계의 배양에서, 호기적 조건을 만들어주기 위한 산소 농도는 1~100%(w/w), 특히 20 내지 80%(w/w)인 범위인 것이 바람직하다.

또 본 발명의 상기 (c) 단계의 배양에서, 배양 방법은 정치배양법과 연속배양법 모두 가능하며, 바람직하게는 정치배양법을 사용할 수 있다.

본 발명은 전술한 바의 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법에 의하여 얻어진 박테리아 셀룰로오스에 관한 것이다. 본 발명의 박테리아 셀룰로오스는 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주에 의하여 생산된 것으로 일반 바이오 셀룰로오스와 마찬가지로 화상 치료, 창상 치료, 궤양 치료, 염증 치료, 항생제, 마취제 등의 약물 전달 용도 등의 의약품, 보습 용도 등의 화장품, 식감 향상 용도 등의 식품, 충진제 용도 등의 제지 등의 제품 소재로 활용될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 이용한 박테리아 셀룰로오스 제조 방법을 제공할 수 있다. 본 발명에 따르면 탄소원으로서는 수크로오스, 질소원으로서는 효모 추출물이나 소이톤, 보조 탄소원으로서는 에탄올이나 아세트산, 첨가물로서는 감귤 착즙액을 사용함으로써 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주에 의한 박테리아 셀룰로오스 생산 수율을 높일 수 있는 효과가 있다.

도 1은 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주에 의한 박테리아 셀룰로오스 생산 시 탄소원으로서 수크로오스 첨가 농도에 따른 수율을 나타낸 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 탄소원의 종류에 따른 Gluconacetobacter sp . KCG326의 박테리아 셀룰로오스 생산 수율

탄소원의 종류가 Gluconacetobacter sp. KCG326의 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율에 미치는 영향을 실험하였다.

균주의 보존과 전 배양을 위한 기본 배지는 출원인이 자체적으로 제작한 272 배지(총 배지 중 글루코오스 10%(w/w), 효모 추출물 1%(w/w), CaCO₃ 2%(w/w), 아가 1.5%(w/w), 잔량의 정제수, pH 6.8)를 사용하였다.

전 배양은 200㎖의 272 배지가 함유된 식물조직배양용 SPL Incu Tissue 용기에 평판 한천배지에서 보존 중인 균주 한 백금이를 접종하여 27℃에서 48시간 동안 정치배양하였다.

박테리아 셀룰로오스 생산을 위한 본 배양의 배지는 아래 [표 1]의 각종 탄소원 10%(w/w), 효모 추출물 1%(w/w) 및 잔량의 정제수로 제조된 것을 사용하였다. 본 배양은 본 배양액 1,300㎖가 함유된 트레이(tray)에 상기 전 배양액 1%(w/w)를 접종하여 27℃에서 14일간 정치배양 하였다.

박테리아 셀룰로오스의 생성량은 다음과 같이 조사하였다. 생성된 박테리아 셀룰로오스를 회수하여 물로 충분히 세척한 후, 0.5 N NaOH 용액에 침지하여 90℃에서 2시간 동안 처리함으로써 세포를 용해시켰다. 이들을 중성이 될 때까지 증류수로 세척한 후, 105℃에서 항량이 될 때까지 건조하여 건조중량을 측정하였다. 균체 생육은 UV-visible spectrophotometer (Ultrospec 4000, Pharmacia Biotech, England)를 이용하여 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 박테리아 셀룰로오스의 생산량을 g/m²로 나타내었다. 실험은 두 번 반복하였으며 결과값은 그 평균값으로 하였다.

각종 탄소원에 따른 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율을 아래의 [표 1]에 나타내었다.

탄소원의 종류에 따른 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율

탄소원	박테리아 셀룰로오스의 생산량(g/m²)
Sucrose	27.2
Glucose	23.0
Lactose	3.0
Fructose	22.1
Maltose	2.6
Mannitol	2.0

상기 [표 1]의 결과를 참조할 때, 슈코로오스를 첨가한 배지에서 박테리아 셀룰로오스의 생산량이 27.2 g/m²로 가장 높음을 알 수 있는데, 이러한 결과는 박테리아 셀룰로오스 생산에 있어 일반적인 탄소원이 글루코오스로 알려져 있는 것(Masaoka S, et al., J. Fermen. Bioeng., 75, 18-22, 1993)과는 상이한 결과이다.

< 실시예 2> 슈코로오스 처리 농도에 따른 Gluconacetobacter sp . KCG326의 박테리아 셀룰로오스 생산 수율

상기 <실시예 1>에서 수크로오스가 Gluconacetobacter sp. KCG326에 의한 박테리아 셀룰로오스의 생산에 최적의 탄소원임이 확인됨에 따라, 수크로오스의 배지에의 처리 농도가 Gluconacetobacter sp. KCG326의 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율에 미치는 영향을 조사하였다.

본 실험에서, 본 배양을 위한 배지는 수크로오스 1%(w/w) 내지 10%(w/w), 효모 추출물 1%(w/w) 및 잔량의 정제수로 제조된 것을 사용하였다. 나머지 전 배양 조건, 전 배양 기간, 전 배양액의 본 배양액에의 접종량, 본 배양 조건, 본 배양 기간, 박테리아 셀룰로오스의 생성량 측정 방법 등은 모두 상기 <실시예 1>과 동일하다.

결과를 [도 1]에 나타내었다. [도 1]를 참조하여 보면 수크로오스가 9%(w/w)로 첨가될 때가 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율이 가장 높았으며, 그 생성량은 33.0g/m²으로 나타났다.

< 실시예 3> 질소원의 종류에 따른 Gluconacetobacter sp . KCG326의 박테리아 셀룰로오스 생산 수율

질소원의 종류에 따라 Gluconacetobacter sp. KCG326의 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율이 달라지는가 여부를 실험하였다.

본 실험에서, 본 배양을 위한 배지는 수크로오스 9%(w/w), 아래 [표 2]의 각종 질소원 0.1%(w/w) 및 잔량의 정제수로 제조된 것을 사용하였다. 나머지 전 배양 조건, 전 배양 기간, 전 배양액의 본 배양액에의 접종량, 본 배양 조건, 본 배양 기간, 박테리아 셀룰로오스의 생성량 측정 방법 등은 모두 상기 <실시예 1>과 동일하다.

결과를 아래의 [표 2]에 나타내었다.

질소원의 종류에 따른 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율

질소원	박테리아 셀룰로오스의 생산량(g/m²)
Yeast extract	40.0
Polypeptone	12.0
Tryptone	17.6
Malt extract	7.6
Corn streep liquor	22.0
Soytone	33.8
None	1.5

[표 2]를 참조하여 보면, 효모 추출물이 질소원으로 사용될 때가 수율이 40.0g/m²로 가장 높고 다음으로 소이톤(soytone)이 33.8g/m²로 높음을 알 수 있다.

< 실시예 4> 효모 추출물 또는 소이톤의 처리 농도에 따른 Gluconacetobacter sp. KCG326의 박테리아 셀룰로오스 생산 수율

상기 <실시예 3>에서 효모 추출물과 소이톤이 Gluconacetobacter sp. KCG326에 의한 박테리아 셀룰로오스의 생산에 최적의 질소원임이 확인됨에 따라, 효모 추출물 또는 소이톤의 배지에의 처리 농도가 Gluconacetobacter sp. KCG326의 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율에 미치는 영향을 조사하였다.

본 실험에서, 본 배양을 위한 배지는 수크로오스 9%(w/w), 효모 추출물 또는소이톤 0.05%(w/w) 내지 0.45%(w/w) 및 잔량의 정제수로 제조된 배지를 사용하였다. 나머지 전 배양 조건, 전 배양 기간, 전 배양액의 본 배양액에의 접종량, 본 배양 조건, 본 배양 기간, 박테리아 셀룰로오스의 생성량 측정 방법 등은 모두 상기 <실시예 1>과 동일하다.

결과를 [표 3] 및 [표 4]에 나타내었다.

효모 추출물의 처리 농도에 따른 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율

효모 추출물의 처리 농도	박테리아 셀룰로오스의 생산량(g/m²)
0.05	35.8
0.10	40.0
0.15	38.4
0.20	37.2
0.25	37.0
0.30	36.6
0.35	36.2
0.40	35.6
0.45	35.0

소이톤의 처리 농도에 따른 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율

소이톤의 처리 농도	박테리아 셀룰로오스의 생산량(g/m²)
0.05	24.5
0.10	33.8
0.15	38.6
0.20	43.2
0.25	37.4
0.30	34.3
0.35	31.4
0.40	27.6
0.45	23.5

[표 3] 및 [표 4]를 참조하여 보면 효모 추출물은 0.1%(w/w)로 첨가될 때가 수율이 40.0g/m²로 가장 높게 나타났음을 알 수 있으며, 소이톤의 경우는 0.20%(w/w)로 첨가될 때가 43.2g/m²로 가장 높게 나타났음을 알 수 있다.

< 실시예 5> 보조 탄소원의 종류에 따른 Gluconacetobacter sp . KCG326의 박테리아 셀룰로오스 생산 수율

보조 탄소원의 종류에 따라 Gluconacetobacter sp. KCG326의 박테리아 셀룰로오스 생산 수율이 달라지는가 여부를 실험하였다.

본 실험에서, 본 배양을 위한 배지는 수크로오스 9%(w/w), 효모 추출물 0.1%(w/w), 아래 [표 3]의 각 보조 탄소원 0.5%(w/w) 및 잔량의 정제수로 구성되어 있다. 나머지 전 배양 조건, 전 배양 기간, 전 배양액의 본 배양액에의 접종량, 본 배양 조건, 본 배양 기간, 박테리아 셀룰로오스의 생성량 측정 방법 등은 모두 상기 <실시예 1>과 동일하다.

결과를 아래의 [표 5]에 나타내었다.

보조 탄소원의 종류에 따른 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율

보조 탄소원	박테리아 셀룰로오스의 생산량(g/m²)
Lactic acid	36.3
Succinic acid	34.5
Citric acid	35.2
Acetic acid	43.3
Ethanol	45.1
Formic acid	36.9
Malic acid	31.8
Pyruvic acid	39.5
None	31.1

상기 [표 5]를 참조하여 보면, 에탄올과 아세트산이 첨가될 때가 각각 45.1g/m² 및 43.3g/m²로 높게 나타났음을 알 수 있다.

< 실시예 6> 에탄올 및 아세트산의 처리 농도에 따른 Gluconacetobacter sp . KCG326 의 박테리아 셀룰로오스 생산 수율

상기 <실시예 5>에서 에탄올과 시트르산이 최적의 보조 탄소원임이 확인됨에 따라, 에탄올 또는 아세트산의 배지에의 처리 농도가 Gluconacetobacter sp. KCG326의 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율에 미치는 영향을 조사하였다.

본 실험에서, 본 배양을 위한 배지는 수크로오스 9%(w/w), 효모 추출물 0.1%(w/w), 0.5%(w/w) 내지 2.0%(w/w)의 에탄올 또는 아세트산 및 잔량의 정제수로 구성되어 있다. 나머지 전 배양 조건, 전 배양 기간, 전 배양액의 본 배양액에의 접종량, 본 배양 조건, 본 배양 기간, 박테리아 셀룰로오스의 생성량 측정 방법 등은 모두 상기 <실시예 1>과 동일하다.

결과를 아래의 [표 6] 및 [표 7]에 나타내었다.

에탄올의 처리 농도에 따른 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율

에탄올 처리 농도	박테리아 셀룰로오스의 생산량(g/m²)
0.5	45.1
1.0	50.2
1.5	43.2
2.0	41.3

아세트산의 처리 농도에 따른 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율

아세트산 처리 농도	박테리아 셀룰로오스의 생산량(g/m²)
0.5	43.3
1.0	52.4
1.5	46.6
2.0	44.1

[표 6]을 참조하여 보면 에탄올의 처리 농도가 1.0%(w/w)에서 박테리아 셀룰로오스 생산 수율이 50.2g/m²로 최대의 생산능을 보였음을 알 수 있으며, [표 7]을 참조하여 보면 아세트산의 경우 그 처리 농도가 1.5%(w/w)에서 박테리아 셀룰로오스 생산 수율이 52.4g/m²로 나타났다.

< 실시예 7> 감귤 착즙액의 처리 농도에 따른 Gluconacetobacter sp . KCG326 의 박테리아 셀룰로오스 생산 수율

감귤 착즙액의 처리 농도가 Gluconacetobacter sp. KCG326의 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율에 미치는 영향을 조사하였다.

본 실험에서, 본 배양을 위한 배지는 수크로오스 9%(w/w), 효모 추출물 0.1%(w/w), 에탄올 1%(w/w), 2%(w/w) 내지 14%(w/w)의 감귤 착즙액 및 잔량의 정제수로 구성되어 있다. 나머지 전 배양 조건, 전 배양 기간, 전 배양액의 본 배양액에의 접종량, 본 배양 조건, 본 배양 기간, 박테리아 셀룰로오스의 생성량 측정 방법 등은 모두 상기 <실시예 1>과 동일하다.

결과를 아래의 [표 8]에 나타내었다.

감귤 착즙액의 처리 농도에 따른 박테리아 셀룰로오스의 생산 수율

감귤 착즙액 함량	박테리아 셀룰로오스의 생산량(g/m²)
2	50.5
4	52.4
6	55.7
8	57.3
10	62.9
12	58.4
14	56.7
None	50.2

[표 8]을 참조하여 보면, 감귤 착즙액이 10%(w/w)로 첨가될 때가 박테리아 셀룰로오스 생산 수율이 62.9g/m²로 나타났음을 알 수 있다.

Claims

(a) 탄소원, 질소원 및 보조 탄소원을 함유하는 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지를 제조하는 단계,
(b) 이 배지에 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 접종하는 단계,
(c) 접종 후 호기적 조건에서 배양하는 단계, 및
(d) 그 배양액으로부터 박테리아 셀룰로오스를 수득하는 단계를 포함하되,
상기 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 보조 탄소원으로서 시트르산과 에탄올 중 하나 이상을 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 이용한 박테리아 셀룰로오스.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 보조 탄소원으로서 에탄올만을 포함하고, 그 에탄올을 0.5%(w/w) 내지 1.5%(w/w)로 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 이용한 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 보조 탄소원으로서 아세트산만을 포함하고, 그 아세트산을 0.5%(w/w) 내지 2.0%(w/w)로 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 이용한 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 감귤 착즙액을 추가로 포함하고 그 감귤 착즙액을 2%(w/w) 내지 14%(w/w)로 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 이용한 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법.
제4항에 있어서,
상기 감귤은 온주 밀감인 것을 특징으로 하는 글루콘아세토박터 속 KCG326 균주를 이용한 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 박테리아 셀룰로오스 제조용 배지는 무기염류 및 미량원소 중 하나 이상을 추가로 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (c) 단계의 배양 단계는 배양 온도에서 10 내지 40℃의 범위에서 5일 내지 20일 동안 정치배양에 의하여 수행되는 것을 특징으로 하는 박테리아 셀룰로오스의 제조 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항 기재의 제조 방법에 의하여 얻어진 박테리아 셀룰로오스.