KR100892359B1 - 감귤박을 탄소원으로 첨가한 배지에서 스클레로티움 속의 배양을 통한 스클레로글루칸의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 감귤박을 이용하여 스클레로글루칸을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 감귤박을 탄소원으로 이용하여 스클레로티움 속의 액상배양을 통하여 스클레로글루칸을 생산하는 배양기술에 관한 것이다. 또한 본 발명은 폐기처리가 곤란한 감귤박을 탄소공급원으로 이용하여 경제적인 기능성식품 및 의약품을 생산하는 방법을 제공함으로써, 배지비용을 절감함과 동시에 환경오염원인 감귤박을 경제적으로 이용하고 처리하는 획기적인 방법을 제시한다.

스클레로글루칸, 감귤박, 스클레로티움, 탄소원

Description

감귤박을 탄소원으로 첨가한 배지에서 스클레로티움 속의 배양을 통한 스클레로글루칸의 제조방법{Method for production of scleroglucan through cultivation of Sclerotium sp. in culture medium including mandarin peels as carbon sources}

본 발명은 제주산 감귤박 (감귤착즙박 포함)을 이용하여 고농도의 스클레로글루칸을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii)를 배양하여 스클레로글루칸을 제조하는 방법에 있어서 탄소원으로 감귤박을 이용함으로써 고농도의 스클레로글루칸을 제조하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 폐기처리가 곤란한 감귤박을 탄소공급원으로 이용하여 경제적인 스클레로글루칸을 생산하는 방법을 제공하여, 배지비용을 절감함과 동시에 환경오염원인 감귤박을 재활용하여 배양 단가를 낮추고 환경오염을 줄이는 이점을 갖는다.

스클레로글루칸은 스클레로티움 속에 속하는 S. glucanicum, S. rolfsii, S. delphinii 등과 같은 담자균류가 생합성하여 세포외로 분비하는 바이오폴리머이다.

고등균류인 스클레로티움 롤프시에 의해 생합성되는 바이오폴리머인 스클레로글루칸은 비이온성, 중성의 수용성 다당체로 베타-1,6-글루코피라노실 그룹과 베타-1,3-글루코피라노실 그룹의 선형의 체인으로 구성되어 있으며 평균 분자량은 1×10⁵ ~ 1×10⁶ Da이다.

스클레로글루칸은 인체에 무해하며, 뛰어난 유동학적 특성과 넓은 범위의 pH, 염도 및 온도에서 매우 높은 안정성을 나타내며, 식품, 의약, 화장품산업에서 그 기술적인 적용 가능성으로 인해 최근 몇 년 동안 그 수요 및 관심이 증폭되고 있다. 또한 스클레로글루칸은 타 글루칸에 비해 항종양 및 항생력이 높다고 평가될 뿐만 아니라 피부화상 및 상처 치유에 필수적인 피부세포 성장인자의 생성을 촉진해 주며 콜라겐의 생합성을 촉진하여 피부재생 능력을 증가시킨다는 것이 입증되어 매우 효과적인 기능성 화장품 소재로 각광받고 있다[참조: Shrikant A et al. Scleroglucan: Fermentative Production, Downstream Processing and Application. 2007.Food Technol. Biotechnol. 45 (2) 107~118].

제주 감귤농업은 면적, 농가수 및 농업 조수익 등 전분야에서 1위 작목으로 제주의 생명산업이다. 제주지역에서는 감귤유통명령제와 품질향상 및 생산량 조절 등 감귤산업의 안정적 발전을 위해 다각적으로 노력한 결과, 연간 50~60 만톤의 감귤이 생산되고 있으나, 최근 각국의 자유무역협정 등과 같은 국제적인 협약에 의해 감귤산업이 위축되고 있는 실정이다. 최근 감귤 가공산업이 활성화되어 감귤가공비율이 약 20% 내외의 점유율을 보이고 있고, 본 감귤가공산업에서 발생되는 감귤 박은 연간 10만여톤으로 추정된다. 감귤박은 그 양이 막대할 뿐만 아니라, 잘 부패하지 않아 국내 최대의 관광지인 제주도의 환경오염의 중요한 원인 중 하나로 지적되고 있다. 그동안에는 가축사료와 한약재 및 각종 생활용품 생산에 첨가하는 등 재활용 방법을 개발하고자 하였으나, 별다른 효과를 보지 못하였고, 많은 비용을 들여 해양 투기하여 왔다. 그러나 국제적 환경규제 조약으로 인하여 해양투기마저 어려워져 감귤 산업뿐만 아니라 제주도의 전체 산업을 저해하는 요인이 되었다.

2005년까지 3년간 제주도 내 감귤박 발생량 및 처리현황을 살펴보면 2003년 71,884톤, 2004년 55,405톤, 2005년 44,480톤으로 발생량이 점차 줄어드는 추세이나 처리되지 못한 감귤박의 양이 막대할 뿐만 아니라, 국내외적 규제 및 환경보호단체들의 거센 발발로 인해 해양투기가 갈수록 어려워지고 있다.

감귤주스 가공폐기물인 감귤박의 수분함량은 채취시기에 따라 약간의 차이는 있으나 약 82%로 많은 수분을 유지하고 있고 건조중량으로 10~15%의 펙틴과 셀룰로오스 및 1~3%의 플라보노이드가 다량 함유되어 있다. 본 조성은 적절한 조절하에서 미생물 배양의 탄소원으로의 이용이 가능한 구성이다. 이에 의해 본 원에는 적절하게 처리된 감귤박을 탄소원으로 사용하여 스크렐로글루칸을 고생산하는 제조방법을 발명하였다.

본 발명은 최근 식품, 의약, 화장품 산업 분야의 소재로써 각광받고 있는 스클레로글루칸의 개선된 생산 방법을 제공하는 데 그 목적이 있으며, 종래 스클레로글루칸의 제조 방법에 있어서 생산 단가는 높으나 생산 효율이 떨어지는 문제점을 개선하여, 보다 수율은 높이면서 생산 단가는 낮은 스클레로글루칸의 신규 제조 방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명의 목적은 폐기 대상으로 환경 오염원이었던 감귤박의 새로운 용도를 제공하는 데 있으며, 감귤박의 새로운 이용법을 개발함으로써 감귤박을 폐기처리하는 데 드는 시간과 비용 및 감귤박으로 인한 환경 오염을 줄이고, 폐기물인 감귤박을 사용함으로써 생산단가를 낮춤을 목적으로 한다.

본 발명에 있어서, 폐기물인 감귤박을 탄소원으로 이용함으로써 스클레로티움 롤프시의 액상 배양을 통한 고농도의 스클레로글루칸의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 탄소원으로 사용되는 감귤박은 임의로 산 처리 단계 및/또는 효소 처리 단계를 거쳐 당화되어 배양 배지에 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른, 감귤박을 탄소원으로 이용한 스클레로티움 속 배양의 스클레로글루칸 생산성은 탄소원으로 포도당을 사용한 대조군에 비해 크게 향상되었다. 또한, 본 발명은 폐기처리가 곤란한 감귤박을 탄소공급원으로 재활용함으로써 배지 비용을 절감함과 동시에 환경오염원인 감귤박을 경제적으로 이용하고 처리하는 획기적인 방법을 제시한다.

나아가, 본 발명에 따른 스클레로글루칸의 제조 방법은, 탄소원으로 포도당을 사용한 대조군에 비해 탄소원으로 감귤박을 사용한 경우의 균체 성장률은 낮음에도 불구하고 스클레로글루칸의 생산성이 2.5배 높게 나타났다. 따라서, 본 발명에 의해 식품, 화장품 및 의약품의 원료인 스클레로글루칸의 대량공급이 가능하다.

본 발명은 감귤박을 스클레로티움 롤프시 배양의 탄소원으로 이용하여 스클레로글루칸을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 당해 방법은 감귤박의 산 처리 단계, 감귤박의 효소 처리 단계, 당화된 감귤박을 탄소원으로 포함한 배지에서 스클레오티움 롤프시를 배양시키는 단계, 및 스클레로글루칸의 정량 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 스클레로글루칸의 생산 방법에 있어서 가공처리되지 않은 감귤박 자체를 탄소원으로 사용할 수도 있으나, 보다 효율적으로 탄소원으로 이용되기 위해서는 당화 과정을 거치는 것이 바람직하다. 감귤박의 당화는 감귤박을 산 처리, 효소 처리 또는 이들 둘 다의 처리 단계를 거침으로써 달성될 수 있으나, 산처리 후 효소 처리하여 당화시키는 것이 바람직하다.

본 발명의 한 양태에 있어서, 산 처리 단계는 감귤박과 증류수를 혼합하고, 산을 이용하여 pH를 산성으로 조절한 후, 100 내지 140℃에서 멸균시킴을 포함한다.

본 발명의 한 양태에 있어서, 감귤박과 증류수의 비율은 바람직하게 1:1 내지 1:4, 가장 바람직하게는 1:2이다.

본 발명의 한 양태에서 있어서, 감귤박의 당화를 위해 사용될 수 있는 산은 HCl, H₂SO₄, HNO₃, CH₃COOH 및 NH₄Cl을 포함하며, 바람직하게는 H₂SO₄이다.

본 발명의 한 양태에 있어서, 산 처리 단계의 pH는 1.5 내지 4.5이고, 바람 직하게는 3.0이다.

본 발명의 한 양태에 있어서, 위 멸균 온도는 바람직하게 121℃이고, 반응 시간은 5 내지 25분으로, 바람직하게는 20분이다.

본 발명의 한 양태에 있어서, 감귤박의 효소 처리 단계는 염기를 이용하여 pH를 3.0 내지 7.0으로 조절한 후 적정농도의 효소를 첨가한 후, 30 내지 60℃에서 6 내지 16시간 동안 반응시킴을 포함한다.

상기 염기는 바람직하게 NH₄OH, KOH 및 NaOH로 이루어진 그룹으로부터 선택되며, 바람직하게는 NaOH이다.

상기 효소 처리 단계에서 pH는 바람직하게 4.5이고, 반응 온도는 바람직하게 45℃이다. 추가로, 상기 효소 처리 단계에서, 반응시간은 바람직하게 12시간이다.

상기 효소 처리 단계에서 당화 효소는 펙티넥스(pectinex), 비스코자임(viscozyme), 노보펌(novoferm), 시트로짐(citrozym) 또는 울트라짐(ultrazym)이고, 이 중 노보펌이 바람직하게 사용된다.

상기 효소 처리 단계에 사용되는 당화 효소의 양은 0.01 내지 0.1 중량%로, 바람직하게는 0.03 중량%이다.

본 발명의 한 양태에 있어서, 상기 산 처리 단계 및/또는 효소 처리 단계를 거친 감귤박을 탄소원으로 적정량 첨가하고, 다른 추가적인 성분을 첨가하여 스클레로글루칸 생산배지를 제조한 뒤 121℃, 15분간 멸균시킨 후 생산균주인 스클레로티움 롤프시를 접종하여 3일 내지 6일간 24 내지 32℃에서 150 내지 220rpm으로 진 탕배양한다.

본 발명의 한 양태에 있어서, 위 스클레로티움 롤프시의 배양 기간은 바람직하게 4일이며, 배양 온도는 28℃이며, 바람직하게 220rpm에서 진탕배양한다.

추가로, 본 발명의 한 양태에 있어서, 위에서 수득된 배양액으로부터 알콜정제를 통해 스클레로글루칸을 회수하고 임의로 수율을 높이기 위해 증류수와 에탄올을 반복적으로 첨가할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

<실시예 1> 감귤박의 산처리 단계의 당화정도 측정

섬유소와 펙틴이 주성분인 감귤박을 스클레로티움 롤프시 배양의 탄소원으로 이용하기 위해 우선 이들을 최소 단위로 분해하는 당화과정 (saccharification)이 필요하다. 본 실시예에서는 산을 이용하여 감귤박을 분해하고자 하였다. 황산 (H₂SO₄)을 이용해 감귤박 용액 (감귤박:증류수 = 1:2)을 pH 3.0으로 조절하고 121℃에서 0, 5, 10, 15, 20분간 멸균한 뒤 환원당을 측정하였다 (표 1 참조). 황산을 첨가하지 않은 대조군에서도 약 9%의 환원당이 존재하는 것을 확인하였다. 황산을 첨가하고 멸균시간을 달리하여 환원당을 측정해본 결과, 10분 이상은 거의 유사한 것을 확인하였다. 20분 멸균하였을 때 약 0.36 g 환원당/g 건조감귤박 농도의 환원당이 생성되었다.

멸균시간에 따른 감귤박의 당화정도 비교

멸균시간	환원당 농도 (g 환원당/g 건조감귤박)	변환율 (%)
0 (황산 무첨가)	0.9	9
5	0.21	21
10	0.27	27
15	0.32	32
20	0.36	36

<실시예 2> 감귤박의 효소처리 단계의 당화 정도 측정

실시예 1에서 20분간 멸균 처리된 감귤박 용액에 각종 효소를 첨가하고 12시간동안 pH 3, 4, 7에서 당화 정도를 측정하였고 그 결과를 표 2에 제시하였다. 전반적으로 모든 조건에서 pH 4 이상 증가하였을 때 당화정도는 감소하였고, pH 4 부근에서 최고점을 나타내었다. 이중 노보펌의 효소 활성이 가장 높았고 pH 4에서 0.68 g 환원당/g 감귤박의 당화를 보였다. 각 조건의 당화정도 사진을 도면 1에 제시하였다.

효소 종류와 pH에 따른 감귤박의 당화정도 비교

	펙티넥스	비스코자임	노보펌	시트로짐	울트라짐
pH 3	0.4	0.5	0.6	0.48	0.5
pH 4	0.45	0.55	0.68	0.52	0.45
pH 7	0.42	0.45	0.5	0.56	0.44

(g 환원당/g 건조감귤박)

<실시예 3> 감귤박을 탄소원으로 첨가한 스클레로티움 롤프시 배양

탄소원으로 30 g/L의 포도당을 첨가한 대조군과 황산 처리 그리고 분해효소를 처리한 상이한 농도의 감귤박이 첨가된 배양 배지에서 스클레로티움 롤프시 배양을 수행하였다. 표 3에는 기본 합성 액상배지의 조성을 제시하였다. 배양 방법은 다음과 같다. 각각의 조건으로 처리한 감귤박 용액을 2000 rpm, 10분간 원심분리하여 상등액만 취하였다. 그리고 표 3에 제시한 기본 합성 액상배지를 조제하여 감귤박 상등액을 첨가하였다. 본 배지를 250 ml 삼각플라스크에 30 ml씩 나누어 담고 멸균한 뒤, 액상 YPD 배지에서 약 24시간 배양한 스클레로티움 롤프시를 5 % (v/v)으로 접종하였다. 그리고 30℃, 약 4일간 배양하여 건조균체량을 확인하였다 (도 2).

기본 합성 액상 배지 조성

성분	농도 (g/L)
황산암모늄 인산수소이칼륨 황산마그네슘 염화칼슘 미세원소	7 0.5 0.35 0.2 1 ml

* 미세원소 : 황산아연 3.5 g, 염화망간 0.1 g, 몰리브덴산나트륨 0.01 g, 황산구리 0.02 g/ 100 ml

대조군으로 30 g/L의 포도당을 첨가한 배양과 비교하였을 때, 산 및 효소분해한 감귤박 농도가 높게 첨가된 배양일수록 건조균체량이 증가하였다. 30 g/L의 감귤박을 첨가한 배양의 경우 83 %의 건조균체량을 보였다. 이로써 단계적 처리를 거친 감귤박이 포도당을 대체하는 탄소원으로 이용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 감귤박을 탄소원으로 이용한 스클레로티움 롤프시 배양을 통한 스크레로글루칸 생산

스클레로글루칸 회수 및 정량방법

스클레로티움 롤프시 배양액을 압축여과장치로 여과하여 균사체 일부가 제거된 스클레로글루칸 용액을 얻는다. 상기 용액을 다시 1um 및 0.45um 크기의 미세공을 가진 여과막에 차례로 통과시켜 균사체를 완전히 제거한 후, 3~4배량, 바람직하게는 3.5배량의 에틸알코올을 서서히 첨가하여 고분자의 스클레로글루칸을 결집시켜 회수하며, 회수된 스클레로글루칸은 다시 초기 용액과 동량의 물에 용해시키고, 점차 에틸알코올의 사용량을 적게는 1배량까지 줄여가면서, 동일한 방법으로 에틸알코올을 1~4회 더 첨가하여 보다 정제되고 균일한 스클레로글루칸을 회수한다. 재차 회수된 스클레로글루칸은 20~100℃ 온도로 열풍건조하여 알코올성분을 휘발시킨 후, -70℃에서 동결시키고 동결건조기를 이용하여 건조한다. 건조된 스클레로글루칸은 분쇄기로 분쇄하여 분말 시료를 제조한다.

감귤박을 탄소원으로 이용한 배양 방법

감귤박을 탄소원으로 이용한 스클레로티움 롤프시 배양의 스클레로글루칸 생산성을 확인하는 실험을 수행하였다. 생산배지의 조성은 표 4에 제시하였다.

스클레로글루칸 생산 기본배지

조 성	농 도(%)
포도당 스킴 밀크 맥아 추출물 NaNO3 FeSO4 CaCO3	3 2 2 0.15 0.23 0.02

표 4의 조성을 이용하여 스클레로티움 롤프시 배양을 통한 스클레로글루칸 생산을 수행하였다. 실험 방법은 실시예 3과 동일하고, 탄소원으로 대조군은 포도당 30 g/L로 첨가하고, 실험군은 황산과 분해효소인 노보펌을 처리한 감귤박을 30g/L의 농도로 첨가하여 약 4일간 30℃에서 배양하였다. 본 배양의 결과를 도 3 에 제시하였다. 30 g/L의 포도당을 탄소원으로 첨가한 배양의 스클레로글루칸 농도를 100%로 봤을때 노보펌을 처리한 배양의 스클레로글루칸이 약 2.5배 증가한 250%를 나타냈다. 또한 다른 효소를 처리한 배양의 경우 또한 120, 200%로 대조군보다 월등히 높은 스클레로글루칸 생산성을 나타냈다.

당해 결과는 당화된 감귤박이 세포성장에 이용되고 추가적으로 미생물에 의해 천천히 분해된 탄소원이 지속적으로 세포대사에 공급되었기 때문으로 생각된다.

본 발명에 따른 감귤원을 탄소원으로 사용하는 제조 방법은 탄소원으로 포도당을 사용하는 대조군에 비해 균체 성장률은 낮음에도 불구하고 스클레로글루칸의 생산성은 최대 2.5배 높게 나타났다. 따라서, 본 결과를 통해 감귤박을 탄소원으로 이용하여 스클레로티움 롤프시를 배양할 경우, 감귤산업의 폐기물을 효과적으로 이용할 뿐만 아니라 유용물질인 스클레로글루칸 또한 고생산할 수 있다는 것을 보여준다.

도 1은 본 발명에 따른 감귤박의 각종효소 처리 사진 (A는 대조군이고 B, C, D는 각각 novoferm, citrozym, ultrazym 처리한 사진)

도 2는 탄소원으로 포도당 30 g/L와 농도별 감귤박 첨가 스클레로티움속 배양의 건조균체량 비교도

도 3은 본 발명에 따라 전처리한 감귤박을 첨가한 스클레로티움속의 스클레로글루칸 생산성 비교도

Claims (6)

1. (1) 감귤박을 산 처리하여 당화시키는 단계, (2) (1)에서 수득된 당화된 감귤박 용액에 당화 효소를 첨가하여 추가 당화시키는 단계, (3) (2) 단계에서 수득된 당화액을 포함하는 배양 배지 중에서 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii)를 배양시키는 단계, 및 (4) (3) 단계에서 수득된 배양물로부터 스클레로글루칸을 회수하는 단계를 포함하는, 스클레로글루칸의 생산 방법.
2. 제1항에 있어서, 산 처리 단계가, 감귤박과 증류수의 비율을 1:1 내지 1:4의 부피비로 하여 혼합하고, HCl, H₂SO₄, HNO₃, CH₃COOH 및 NH₄Cl로 이루어진 그룹으로부터 선택된 산을 이용하여 pH를 1.5 내지 4.5로 조절한 후, 100 내지 140℃에서 5분 내지 25분 동안 멸균시키는 단계를 포함하는, 스클레로글루칸의 생산 방법.
3. 제1항에 있어서, 효소 처리 단계가, NH₄OH, KOH 및 NaOH로 이루어진 그룹으로부터 선택된 염기를 이용하여 pH를 3.0 내지 7.0으로 조절한 후, (1)에서 수득한 당화액 총중량에 대하여 당화 효소를 0.01 내지 0.1 중량%로 첨가한 후, 30 내지 60℃에서 6 내지 16시간 동안 반응시킴을 특징으로 하는, 스클레로글루칸의 생산 방법.
4. 삭제
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스클레로티움 롤프시(Sclerotium rolfsii)의 배양이, 당해 균주 접종 후 3일 내지 6일간 24 내지 32℃에서 150 내지 220rpm으로 진탕 배양함으로써 이루어지는, 스클레로글루칸의 생산 방법.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 스클레로글루칸의 회수가 알콜을 사용한 정제를 통하여 이루어지는 스클레로글루칸의 제조 방법.

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