JP2003169690A - リグニン含有物抽出方法およびリグニンを用いた抗酸化剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】安全なリグニン含有物抽出方法およびリグニン
を用いた抗酸化剤を提供する。 【解決手段】リグニンを含む原材料をpH4.0-5.0、２５
−４０℃の条件でセルラーゼ複合酵素により分解する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】リグニンを含む原材料からのリグ
ニン含有物抽出方法およびリグニンを用いた抗酸化剤に
関する。

【０００２】

【従来の技術】リグニンを多く含む食品は少ない。その
理由の一つとして食品中からリグニンを純粋な形で抽出
することが困難であったためである。リグニンの構成単
位であるオリゴリグナンの中ではゴマの成分のセサミン
が使用されているにすぎない。しかしながら、現在利用
されている食物繊維が多糖類であるのに対して、リグニ
ンはポリフェノールの重合物であるので、他の食物繊維
とは異なる特徴を有する。さらに、リグニンあるいはオ
リゴリグナンは生体内において新規の抗酸化剤である可
能性がある。一例をあげると、菜食主義者の乳がんの罹
患が少ないのは食物繊維に含まれるリグニンが分解され
たオリゴリグナンが防御的にはたらくためであるとされ
る。これは、抗酸化作用が抗ガンに関与しているとされ
ることを考えあわせると、乳ガン患者では健常な菜食主
義者より尿中のオリゴリグナンが有意に低いことから示
唆される。(H.Adlercreuty et.al., Lancet, No.8311,
1925(1982))

【０００３】従来のリグニン処理の技術としてはアンモ
ニア処理法を用いた加水分解による家畜の飼料化があげ
られるが、分解過程において有害オリゴペプチドの生成
の疑いが示唆されている上、対象が反芻動物であり、食
品の処理法としては適切であると考えられない。その他
の化学的な処理においてもリグニンは分解しにくい物質
であるとされる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
従来の課題に着目してなされたもので、安全なリグニン
含有物抽出方法およびリグニンを用いた抗酸化剤を提供
することを目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】植物バイオマス中のリグ
ニンは、セルロース、ヘミセルロース、フェルラ酸等と
強固で複雑なマトリックス構造を形成している。これに
より、構造性多糖は加水分解に対し著しく抵抗性を増し
ている。そのため、植物バイオマス中のリグニンを利用
するには、人体内においても分解されやすい形のリグニ
ンにする必要がある。

【０００６】本発明者らは、これらの現状に鑑み、リグ
ニン含量の多い素材をセルラーゼ複合酵素によりリグニ
ンと架橋構造をとっているセルロース、ヘミセルロー
ス、ペクチンを分解し、その利用をする手法を鋭意研究
したところ、完成に至ったものである。

【０００７】すなわち、本発明に係るリグニン含有物抽
出方法は、リグニンを含む原材料をセルラーゼ複合酵素
により分解することを特徴とする。なお、リグニン含有
物抽出方法は、リグニン含有物分解方法としてとらえら
れてもよい。分解物からのリグニンの抽出は、一般に公
知の方法を用いることができる。

【０００８】特に、本発明に係るリグニン含有物抽出方
法は、リグニンを含む原材料をpH4.0-5.0、２５−４０
℃の条件でセルラーゼ複合酵素により分解することが好
ましい。本発明に係る抗酸化剤は、リグニンを含む原材
料をpH4.0-5.0、２５−４０℃の条件でセルラーゼ複合
酵素により分解して得られたリグニンを主成分とするこ
とを特徴とする。原材料は、酢酸バッファーによりpH
3.0-7.0、好ましくはpH3.0-4.0の範囲において処理され
ることが好ましい。

【０００９】本発明に係る抗酸化剤では、前記原材料は
カカオ外皮から成ることが好ましい。カカオ外皮などの
原材料は、100メッシュにて粉砕することが好ましい。
しかしながら、原材料には、カカオ外皮以外の材料が用
いられてもよい。本発明に係るリグニン含有物抽出方法
では、原材料は、セルラーゼ複合酵素を用いてリグニン
と架橋構造をとっているセルロース、ヘミセルロース、
ペクチンを分解することにより、リグニン含有物の抽出
を容易にする。

【００１０】本発明に係るリグニン含有物抽出方法は、
化学的な加水分解を行う必要がなく安全である。本発明
に係るリグニン含有物抽出方法により得られたリグニン
は、パン、焼き菓子、乳製品、シリアル、スナック製品
など、健康食品に限らず、幅広い食品分野で添加剤とし
て使用することができる。本発明に係るリグニン含有物
分解方法は、リグニンを含む原材料にヒラタケを植菌し
培養することを特徴とする。原材料は、リグニンを３重
量％以上含むことが好ましい。リグニンを３重量％以上
含む原材料としては、小麦ふすま、サトウキビバガス、
カカオ外皮などを用いることができる。

【００１１】

【実施例１】クロスビーターミルにて粉砕したカカオ外
皮（100g）をセルラーゼ複合酵素（0.5% (w/v)）含有酢
酸バッファー（ph 4.5）に懸濁し、40℃にて 3時間から
24時間反応させた。反応液を蒸留水にて洗浄した後（2
回）、さらに熱風乾燥しカカオ外皮リグニン高含有素
材とした（表 1）。このカカオ外皮リグニン高含有素材
を添加剤として利用する。

【００１２】一方、洗浄した水溶液の抗酸化活性を DPP
H法により測定した結果、アスコルビン酸よりも緩和な
抗酸化活性を示した（表２）。

【００１３】

【表１】

【００１４】

【表２】

【００１５】〔各種粗酵素液の調製法〕各種種菌に 10m
M PBS（4 倍量、pH7.2）を加えて 18 時間冷蔵庫に静置
した後、2 層ガーゼでろ過して得たろ液についてラッカ
ーゼ測定を行った。続いてこのろ液を凍結乾燥に付し粗
酵素とした。また、リグニン分解酵素の活性濃縮には60
% 硫安による沈殿後、セロファン膜（UC36-32-100、Vis
kase Sales Corp）を用いて透析（MW12,000-14,000）を
行い、透析内液を遠心に付し凍結乾燥に付した。

【００１６】〔担子菌種菌の培養とラッカーゼ活性〕次
に、担子菌の種菌の純粋培養により高い活性のラッカー
ゼ粗酵素液を得た。入手した 12 種類の担子菌を液体培
養に付し一定期間培養後（1-3 週間）のラッカーゼ活性
を測定した結果、一例をあげると、ヒラタケH64号のラ
ッカーゼ活性は、1 週間目において強力なラッカーゼ活
性を示し、その後、2 週間目でほぼ最大値に達し（廃菌
床培養の約 50 倍）、3 週間目以降は次第に活性は減少
した。

【００１７】〔ヒラタケH64号の培養とMn-ペルオキシダ
ーゼ活性〕ヒラタケの種菌培養において、Mn-ペルオキ
シダーゼ活性はラッカーゼ活性の消長に 1週間遅れて2
週間目を過ぎてから上昇し、3-4 週間目に最大値を示し
た。以後の試験はラッカーゼ活性が最も高い値を示した
ヒラタケ H64号を用いて行うこととした。ただし、ヒラ
タケ以外の種菌を用いてリグニン分解酵素含有の粗酵素
を得てもよい。

【００１８】〔ラッカーゼの活性測定〕ラッカーゼ測定
法は、Wolfenden らの方法を若干改良して行った。すな
わち、ABTS (0.5 mM) を含む 0.1M 酢酸緩衝液（3mL、p
H4.9）に粗酵素液 (20μL)を添加し、30℃で 10 分間振
盪反応させた後、10mMアジ化ナトリウム溶液 (150μL)
を加えて反応を停止させ、光路長 1cmのセルにて 420nm
の吸光度を測定した。1分間に吸光度を0.001増加させる
時の酵素活性を1 unitとした。

【００１９】〔Mn-ペルオキシダーゼの活性測定〕Mn-ペ
ルオキシダーゼ測定法は、J.K. Glennらの方法に従って
行った。

【００２０】〔カカオ外皮リグニンの作製〕カカオ外皮
は ノボノルディスク社製のセルラーゼ複合酵素を用
い、実験方法に記載した方法によりカカオ外皮のリグニ
ン・多糖体、架橋構造を加水分解してリグニン分解を効
果的に進ませることとした。カカオ外皮のリグニンと結
合している多糖類が切断されていることは反応後の収量
と糖度および 50%エタノール抽出物の味によって判断し
た。

【００２１】すなわち、カカオ外皮抽出物はセルラーゼ
複合酵素と処理することで抽出される物質が増加し（14
4.6%）、抽出物の糖度が 7.6% から 8.6% に上昇した。
次にカカオ外皮とセルラーゼ複合酵素で処理した時の繊
維量の増減を測定した。酵素処理前のカカオ外皮のリグ
ニン含量（ADL: acid detergent lignin）は 24.0%であ
ったのに対し、酵素処理後のカカオ外皮残渣のリグニン
含量は 37.5%となり、リグニンと結合しているヘミセル
ロース類が分解されリグニン含量が上昇した事が推測さ
れた。

【００２２】〔カカオ外皮リグニンとリグニン分解酵素
との反応〕上記において作製したカカオ外皮リグニンに
リグニン分解酵素（至適pH4.5）を無菌的に加え、一定
温度下（30℃）、1 週間反応に付した。リグニン分解酵
素には市販のラッカーゼ（フナコシ社製）、担子菌の培
養により得られたラッカーゼ高含有粗酵素（培養 2週
間）、あるいは Mn-ペルオキシダーゼ高含有粗酵素（培
養 4週間）を用いた。分解反応を培養上清の紫外線吸収
（以下、UV吸収と略す）スペクトルの変化により反応進
行の度合いを調べたところ、280 nmの吸収極大波長と 3
20 nm の吸収極大波長の波形が変化し、カカオ外皮リグ
ニンの分解が起こっていることが推測された。

【００２３】〔カカオ外皮リグニンの分解反応〕上記に
おいて作製したカカオ外皮リグニン（4g）を酢酸バッフ
ァー（pH4.5、50mL）に溶解させ、市販ラッカーゼ（100
μL）あるいは粗酵素（100mg）を混合し、無菌的に反応
させた（30℃、1週間）。反応時に各種不飽和脂肪酸を
添加した。各々について熱水抽出に付し、得られた水溶
性の抽出物の抗酸化試験を行った。

【００２４】〔ヒラタケ種菌を植菌したカカオ外皮のジ
オキサンリグニンの作製〕n-ヘキサンにより脱脂したカ
カオ外皮またはヒラタケを植菌し培養したカカオ外皮を
7 倍量の熱水、熱アセトン、次いで熱ジオキサンによ
り、順次、 2時間還流する事により、ジオキサン可溶画
分からジオキサンリグニンを得た。

【００２５】〔抗酸化試験〕本試験にて行った抗酸化試
験は食品の機能性評価マニュアル集に従って行った。す
なわち、DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, 200μ
L）EtOH溶液、MESバッファー（2-Morpholinoethanesulp
hnic acid, 150μL）50% EtOH溶液、蒸留水（150μL）
の混合液に、50% EtOH（500μL）溶液を順次加えた後、
段階希釈したサンプル溶液（100μL）を加え、2 分間室
温下にて放置した。DPPHの退色は 520nmの吸光度を測定
した。なお、サンプルの着色はサンプル溶液（100μL）
の代わりに50% EtOH（100μL）溶液を入れることにより
補正した。

【００２６】〔ヒラタケ種菌を用いたカカオ外皮の分解
反応〕次に、カカオ外皮に純粋培養したヒラタケ種菌を
植菌し、カカオ外皮を分解させる事とした。4 週間培養
したものを熱水、熱アセトン、ついで熱ジオキサンによ
り抽出して、その抽出物の UV 吸収の比較をしたとこ
ろ、ヒラタケを植菌したカカオ外皮の熱ジオキサン抽出
物は、カカオ外皮の熱ジオキサン抽出物に比べて280 nm
の吸光度が減少し、一方、230 nmの吸光度が上昇した
事からリグニンの消費がなされたことが推測される。

【００２７】〔各種反応物の水溶性成分の抗酸化活性試
験〕カカオ外皮に担子菌粗酵素を作用させた反応物の抗
酸化性は、いずれも 10^-3（g/mL）であり比較対照のア
スコルビン酸の抗酸化性の約 1/10-1/50であった。カカ
オ外皮抽出物に同様に担子菌粗酵素を作用させた前後に
おける抗酸化性も変化はなかった。したがって、カカオ
外皮リグニンおよびリグニンスルホン酸にリグニン分解
酵素を作用させた前後では、分子量の変化は起こってい
るものの、その水溶性成分の抗酸化活性には影響がない
と考えられる。本試験の評価に使用した DPPH は50% エ
タノール系で抗酸化性を評価する系である。

【００２８】〔食品への応用検討〕本試験では、リグニ
ン分解酵素をリグニンに作用させてリグニンの分解物
（オリゴリグナン）を得ることを目的とした。植物バイ
オマスのリグニンは、セルロース、ヘミセルロース、フ
ェルラ酸と架橋結合をし、強固なマトリックス構造を形
成しており、加水分解に著しく抵抗を示していると考え
られた。過去においてもリグニンのモデル化合物にリグ
ニン分解酵素を作用させて分解がなされたという報告は
多々あるが、天然リグニンそのものにリグニン分解酵素
を作用させて分解を確認したという報告はない。したが
って、はじめにリグニンと架橋構造を形成しているこれ
らの構造性多糖との結合を切断する必要があると考え
た。

【００２９】試験材料はカカオ外皮を選択したが、これ
は産業廃棄物であり大量に得ることが可能であること
と、実際に使用されている食品の不用残渣の未利用廃棄
物であり、安全であることが確認されているからであ
る。このカカオ外皮の有効利用が可能となれば原材料の
コストがかからず、産業廃棄物の減少に寄与することが
可能であろう。

【００３０】このカカオ外皮にセルラーゼ複合酵素を作
用させて、糖度の測定と繊維量の増減からリグニン含量
が高まったことを確認し、カカオ外皮リグニンを得た。
このカカオ外皮リグニンに種菌の培養で得られた粗酵素
を処理し、UV吸収の変化によってその反応の様子を検討
した結果、その反応の度合いは大きくはなかった。その
理由としてリグニン分解には電子を伝達する仲介物質が
必要であると報告されており、その候補として各種脂肪
酸が上げられている。また、酸化の供給源として過酸化
水素の添加も検討しなくてはならない。さらに、リグニ
ンを分解したときのラジカル補足を考慮しマンニトール
の添加も検討した。

【００３１】これらの考えをもとにリノール酸、リノレ
ン酸、過酸化水素、マンニトールの組み合わせを検討し
た結果、リノレン酸、過酸化水素を加えたものが最も U
V 吸収の波長の変化が認められた。一方、同様の試験を
市販のリグニンスルホン酸を用いて行ったところ、同様
の結果を得た。

【００３２】さらに、天然のキノコはその菌糸を伸ばす
際にリグニンを分解していることが考えられ、キノコ培
養培地をジオキサンにより抽出してその UV 吸収を比較
した。その結果、芳香環に由来すると考えられる吸収が
減少し、リグニンの消費が行われたということが判断さ
れた。したがって、リグニンの分解物を得る方法として
生菌を使用することも可能であろう。

【００３３】上記方法にて得られた抽出物の抗酸化性を
DPPH 法にて測定した結果、リグニン含有素材を酵素反
応させたものあるいは菌体培養したもの（反応前後の吸
光度の差により評価）の抽出物は、対象であるアスコル
ビン酸に比較して 1/10-1/50の抗酸化活性が認められ、
機能性食品の素材となる可能性が認められた。

【００３４】

【発明の効果】本発明によれば、安全なリグニン含有物
抽出方法およびリグニンを用いた抗酸化剤を提供するこ
とができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｓ 3/04 Ｃ１２Ｓ 3/04 Ｆターム(参考） 4B018 MD07 MD48 ME13 MF01 MF12 4B021 MC03 MK05 MK16 MP01 MP02 4B064 AB07 CA05 CA21 CD22 DA16 4H025 AA15 AC07 BA01

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】リグニンを含む原材料をセルラーゼ複合酵
   素により分解することを特徴とするリグニン含有物抽出
   方法。
2. 【請求項２】リグニンを含む原材料をpH4.0-5.0、２５
   −４０℃の条件でセルラーゼ複合酵素により分解するこ
   とを特徴とするリグニン含有物抽出方法。
3. 【請求項３】リグニンを含む原材料をpH4.0-5.0、２５
   −４０℃の条件でセルラーゼ複合酵素により分解して得
   られたリグニンを主成分とすることを特徴とする抗酸化
   剤。
4. 【請求項４】前記原材料はカカオ外皮から成ることを特
   徴とする請求項３記載の抗酸化剤。
5. 【請求項５】リグニンを３重量％以上含む原材料にヒラ
   タケを植菌し培養することを特徴とするリグニン含有物
   分解方法。