CN102816810A - 一种控制细菌纤维素聚合度的细菌纤维素微生物制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制细菌纤维素聚合度的细菌纤维素微生物制备方法。本发明以细菌纤维素产生菌--葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149作为发酵菌株，通过调整发酵培养基配方、培养方式、发酵时间等方式达到控制细菌纤维素聚合度，使得细菌纤维素平均聚合度在1361～2350范围内，因此可根据实际应用需要制备不同平均聚合度的细菌纤维素。本发明提供了一种有别于物理或化学因素控制细菌纤维素平均聚合度的方法，该控制方法简单，通过调节细菌纤维素平均聚合度以适应各种工业加工的需求，拓宽了细菌纤维素的应用范围。

Description

一种控制细菌纤维素聚合度的细菌纤维素微生物制备方法

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种控制细菌纤维素聚合度的细菌纤维素微生物制备方法。

背景技术：

在1886年，A.J.Brown就首次报道由木醋杆菌合成一种凝胶物质，并用化学分析方法确定为纤维素。但直到20世纪下半叶细菌纤维素（BC）具有许多独特性质才引起人们广泛关注。细菌纤维素是小分子的碳水化合物经微生物发酵形成的纤维类物质。与传统植物纤维素相比，细菌纤维素有许多优良性能，如高纯度、高聚合度、高结晶度、高亲水性、高杨氏模量、高强度和较好的生物相容性。因此，细菌纤维素作为一种天然的生物聚合物受到科学界的广泛关注，在食品工业、生物医学、造纸、声学器材和石油开采等方面应用前景广阔。

聚合度是高聚物重要的性能指标，同样聚合度也是细菌纤维素的一项重要性能。纤维素聚合度表征纤维素分子链的长短，一般来见，细菌纤维素具有高聚合度的特征，具有较高的机械强度、高结晶度、高亲水性、高杨氏模量和良好的生物相容性，故可应用于食品、造纸、医药等领域。聚合度上升时，纤维素强度加大。但高聚合度也使细菌纤维素的溶解成为一大难题，使其应用受到较大的限制；低聚合度的细菌纤维素其机械强度下降、还原性增强、碱溶能力增加，生物活性更强，吸湿能力也发生改变，低聚合度的细菌纤维素更适合做细菌纤维素的原料。

细菌纤维素的聚合度在500-18000左右，木醋杆菌产生的细菌纤维素结晶度高于普通高等植物纤维，而低于藻类(valinia)和动物纤维(tunicin)。据测定，Ax菌纤维素的聚合度为16000,优质棉纤维为13000~14000，棉短绒为5000左右,木浆纤维素为7000~10000,植物中聚合度最高的为单球囊藻纤维达26500~44000；天然纤维中精制棉的平均聚合度为250-200，未漂白亚硫酸盐木浆400-250；漂白亚硫酸盐木浆280-200，漂白硫酸盐木浆190-140，球磨木制纤维素100-80；再升纤维中的丝线20-30；轮胎帘子线30-15；。纤维素的聚合度低于700时,断裂强度急剧降低,低于200时多碎裂成粉末,不再具有纤维特性。

有学者研究表明，聚合度对纤维素表面性能是有影响的。结果表明：纤维素的表面能随分子量（聚合度）的增加而增大。研究还发现纤维素的表面能γS与聚合度DP之间的关系大致可以描述为：γs＝37.56＋0.02DP，而纤维素的极性率P与聚合度DP之间的关系则是一种非线性关系，如：P＝11.88－0.02DP＋9.10DP²。DP约在1000左右时有可能导致极性率最小。

由于细菌纤维素具有高聚合度的特征，从而使细菌纤维素的溶解成为一大难题，也使其应用受到较大的限制。因此，目前国内外有少数研究者有少量关于细菌纤维素溶解的研究，通过采用不同的溶解或降解方法达到降低细菌纤维素聚合度的目的。采用的方法有在化学或物理因素的作用下，细菌纤维素发生功能基转化，聚合度下降并引起葡萄糖基中碳－碳键、碳－氧键断裂，直至完全裂解转化，生成各种小分子化合物的反应称为纤维素的降解。方式有水解、氧化降解、机械降解、热降解、光化学降解等。研究较多的纤维素溶剂主要有强碱、N-甲基吗啉-N-氧化物(NMMO)、氯化锂-二甲基乙酰胺(LiCl DMAC)等,这些溶剂存在着不稳定、有毒害、不易回收、价格昂贵等缺点。如论文“细菌纤维素在NMMO·H₂O中的溶解性能”【《分子材料科学与工程》，2011年第06期，27（6）：80-83】研究的细菌纤维素在NMMO·H₂O中的溶解行为，发现细菌纤维素由Ⅰ型转变为Ⅱ型；论文“细菌纤维素在室温离子液体中的溶解性能”【《功能高分子学报》，2009，2（4）：349-355】研究了[AMIM]Cl对BC的溶解作用，发现AMIM]Cl对细菌纤维素的溶解作用是直接溶解。溶解过程中，BC细菌纤维素的结晶度下降，分子间的氢键作用力削弱，结晶结构受到破坏，发生了从纤维素

到纤维素

的晶型转变,且再生后的细菌纤维素无定型区增多。发明专利201010598451.1“一种高聚合度细菌纤维素的溶解方法”（东华大学），就是将聚合度为1500-1600的细菌纤维素用NaOH水溶液水煮，之后用蒸馏水洗涤至中性，真空干燥，再用质量分数为65%-80%的ZnCl₂水溶液进行溶解；发明专利200910046940.3“一种高聚合度细菌纤维素纤维的制备方法”描述的是一种高聚合度细菌纤维素纤维的制备方法，包括，(1)将细菌纤维素溶解在溶剂中，配成质量分数为1～30%的细菌纤维素溶液，过滤，静置脱泡，得纺丝溶液：(2)将步骤(1)纺丝溶液经喷丝孔喷出后固化成型，再经过拉伸，水洗，定型和干燥这几道常规工序后制成成品。

通常将纤维素分子链包含单体的平均数称为聚合度(DP)。聚合度的测定方法有很多，如渗透压法、光散射法、超速离心法和粘度法等。目前较常用的是粘度法，以毛细管粘度计和落球式粘度计为主。通常用铜氨、铜乙二铵和铬乙二铵溶液为溶剂，效果较好，而且装置简单，便于操作，适合在生产中随时检测。本发明中采用粘度法测定细菌纤维素的聚合度。具体方法如下：

称取干细菌纤维素溶于铜-乙二胺溶液中，配制成纤维素浓度为c的溶液。测细菌纤维素在铜-乙二胺溶液中的相对粘度η_r，增比粘度η_sp。根据单点法测定高聚物溶液特性粘度[η]的通用公式： $\left[n\right]=\frac{\sqrt{2({\mathrm{\η}}_{\mathrm{sp}}-\ln {\mathrm{\η}}_r)}}{c}.$

根据Mark-Houwink经验方程：[η]=kM^α，k、α为常数。由《Polymer Data Handbook》查的得k、α值，求得粘均分子量M。由平均聚合度

公式，求得纤维素的平均聚合度。

目前，国内主要集中研究在发酵优化提高细菌纤维素产量方面。细菌纤维素的发酵生产一般是在含葡萄糖的复杂营养介质中进行的，Son HJ等采用Acetobacter sp.V6、在如下培养基[1.5%葡萄糖,0.2%(NH₄)₂SO₄,0.3%KH2PO4,0.3%Na₂HPO₄·12H₂O,0.08%MgSO4·7H₂O,0.0005%FeSO₄·7H₂O,0.0003%H₃BO₃,0.00005%烟酰胺,和0.6%乙醇]中摇瓶发酵8天、转速200r/m，BC的产量最高达4.16g/L。而采用Acetobacter sp.A9、在如下培养基[4%葡萄糖,0.1%酵母膏，0.7%蛋白胨，0.8%Na₂HPO₄·12H₂O]，pH6.5，温度30℃，发酵7天，BC产量达3.8g/l，如果在上述培养基中加入1.4%(v/v)的乙醇，摇瓶发酵8天，BC产量大幅度提高到15.2g/l。台湾吴文腾等用Acetobacter xylinum以改进的气升式反应器取代传统反应器发酵72小时，BC产率提高3倍，达0.107g/l/h，产量达7.72g/l。马霞等采用木醋杆菌静止培养条件下，在基本培养基（胰蛋白胨0.5%，酵母粉0.5%，葡萄糖2.0%，Na₂HPO4 0.5%，pH6.0。121℃灭菌20min）中添加醋酸、柠檬酸和乳酸，使细菌纤维素的产量得到提高。其中，添加0.1％的醋酸，细菌纤维素的产量为2.75g/L；加入0.2％的柠檬酸时细菌纤维素产量为2.15g/L；加入0.1％的乳酸，细菌纤维素的产量为2.76g/L。Joseph Gerard等发现添加聚丙烯酰胺-丙烯酸也可显著提高木醋杆菌的BC产率。在BC发酵中，无论是摇瓶或者发酵罐培养，pH的准确控制是很重要的，通常采用缓冲液、pH传感器或人工手段来控制pH，显然这种办法是很麻烦的，而Noro N等发现只要在培养基中加入生化级玉米浆，即使不采取上述手段控制，BC的产量几乎是一样的。

发明内容：

本发明的目的是提供一种能够控制细菌纤维素的平均聚合度为1361~2350之间的控制细菌纤维素聚合度的细菌纤维素微生物制备方法，以适应各种工业加工的需求，拓宽了细菌纤维素的应用范围。

本发明的控制细菌纤维素聚合度的细菌纤维素微生物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）菌种的液体活化：葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M208149经固体斜面活化后，再接种于液体活化培养基中，于28-32℃往复式摇床振荡培养18～36小时，摇床转速为80-110r/m，冲程为65-75mm，由此获得液体活化种子液，所述的液体活化培养基为每升含有葡萄糖80～120g，酵母膏8～12g，蛋白胨5～10g，余量为水，pH值6.0~7.0；

（b）发酵：将液体活化种子液按照5~10%的接种量，接入发酵培养基中进行动态发酵培养或者静态发酵培养，得到目标细菌纤维素；

所述的动态发酵培养为在温度28-32℃，冲程65-80mm，转速60-100r/m的往复式摇床振荡培养6~12天；

所述的静态发酵培养为在温度28-32℃静止放置6-12天；

所述的发酵培养基为以下培养基中的一种：

发酵培养基A：每升含有葡萄糖30-50g，酵母膏0.8-1.2g，蛋白胨6-8g，Na₂HPO₄·12H₂O6-10g，生化级玉米浆4-8g，乙酸0.8-1.2g，无水乙醇8-12g，余量为水，pH值5.8-6.2，由此发酵培养基发酵得到的细菌纤维素产物的平均聚合度为2150~2350；

发酵培养基B：每升含有甘油或木糖30-50g，酵母膏0.8-1.2g，蛋白胨6-8g，Na₂HPO₄·12H₂O 6-10g，生化级玉米浆4-8g，乙酸0.8-1.2g，无水乙醇8-12g，余量为水，pH值5.8-6.2，由此发酵培养基发酵得到的细菌纤维素产物的平均聚合度为1361～1380；

发酵培养基C：每升含有葡萄糖15-25g，酵母膏4-6g，蛋白胨4-6g，Na₂HPO₄·12H₂O2.5-3.0g，柠檬酸1.2-1.8g，余量为水，pH值4.8-5.2，由此发酵培养基发酵得到的细菌纤维素产物的平均聚合度为1550~1650。

所述的葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149经固体斜面活化后，再接种于液体活化培养基中优选为将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobactersp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于固体培养基斜面上，28~32℃培养24~48小时，再冷藏于4℃3~5天，然后再按1cm²面积上述斜面上的菌种接种于20ml的液体活化培养基的量接种，所述的固体培养基为：每升含有葡萄糖80~120g，酵母膏8~12g，碳酸钙15~25g，琼脂15~22g，余量为水，pH值6.5~7.2。

细菌纤维素微生物合成方法有动态发酵或静态发酵法，而多数菌种只能采用动态发酵或静态发酵中的一种进行细菌纤维素的合成。动态发酵法耗能相对较高、工艺也较复杂，但比较适合大规模生产，且细菌纤维素产量可能较高；静态发酵法耗能低、工艺简单、废液排放极少，但产量可能不高，较适合小规模生产。而本发明可以根据实际需要选择动态发酵或静态发酵法来制备平均聚合度为1361~2350的细菌纤维素。

本发明以细菌纤维素产生菌--葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149作为发酵菌株，通过调整发酵培养基配方、培养方式、发酵时间等方式达到控制细菌纤维素聚合度，使得细菌纤维素平均聚合度在1361～2350范围内，因此可根据实际应用需要制备不同平均聚合度的细菌纤维素。

本发明提供了一种有别于物理或化学因素控制细菌纤维素平均聚合度的方法，该控制方法简单，通过调节细菌纤维素平均聚合度以适应各种工业加工的需求，拓宽了细菌纤维素的应用范围。

本发明的葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149，于2008年10月9日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），编号为：CCTCC NO：M 208149。该菌株在专利号为：200810218500.7，发明名称为：细菌纤维素产生菌及利用该菌株制备细菌纤维素的方法中也公开过。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明的控制细菌纤维素聚合度的细菌纤维素微生物制备方法，包括以下步骤：

（1）斜面菌种活化：将培养好的保藏斜面种葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobactersp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于新配制的固体培养基斜面上，固体培养基斜面配方组成如下：葡萄糖80~120g，酵母膏8~12g，碳酸钙15~25g，琼脂15~22g，自来水1L，调pH值至6.5~7.2。28~32℃培养24～48小时，再冷藏于4℃3~5天。

（2）菌种的液体活化：将上述冷藏于4℃的斜面上约1cm²面积的菌种刮下，接种于20ml液体活化培养基中，液体活化培养基配方组成如下：葡萄糖80～120g，酵母膏8～12g，蛋白胨5~10g，自来水1L，调pH值至6.0~7.0.。液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于28-32℃往复式摇床振荡培养18～36小时，摇床转速为80-110r/m，冲程为65-75mm，由此得到液体活化种子液。

（3）发酵：取培养好的液体活化种子液，按5-10%接种量，接入发酵培养基中。采用不同发酵培养基和发酵方式，所制备得到的细菌纤维素的平均聚合度是不同的，分别描述如下：

a、发酵培养基A：配方组分如下（按每升培养基所含克重g/L计算）：葡萄糖30-50g，酵母膏0.8-1.2g，蛋白胨6-8g，Na₂HPO₄·12H₂O 6-10g，生化试剂级玉米浆4-8g，乙酸0.8-1.2g，无水乙醇8-12g，其余成分为水。培养基于灭菌前调pH值至5.8-6.2，可用NaOH及HCl调节。然后于121℃灭菌15分钟，备用。如果采用动态发酵培养，可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于28-32℃，冲程65-80mm，转速60-100r/m的往复式摇床振荡培养6-12天，停止发酵，得发酵液；如果采用静态发酵培养，则其他步骤与动态发酵培养相同，但不必振荡培养，而是于28-32℃静止放置6-12天后，停止发酵，得发酵液。

b、发酵培养基B：配方组分如下（按每升培养基所含克重g/L计算）：甘油或木糖30-50g，酵母膏0.8-1.2g，蛋白胨6-8g，Na₂HPO₄·12H₂O 6-10g，生化试剂级玉米浆4-8g，乙酸0.8-1.2g，无水乙醇8-12g，其余成分为水。培养基于灭菌前调pH值至5.8-6.2，可用NaOH及HCl调节。然后于121℃灭菌15分钟，备用。如果采用动态发酵培养，可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于28-32℃，冲程65-80mm，转速60-100r/m的往复式摇床振荡培养6-12天，停止发酵，得发酵液；如果采用静态发酵培养，则其他步骤与动态发酵培养相同，但不必振荡培养，而是于28-32℃静止放置6-12天后，停止发酵，得发酵液。

c、发酵培养基C：配方组分如下（按每升培养基所含克重g/L计算）：葡萄糖15-25g，酵母膏4-6g，蛋白胨4-6g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.5-3.0g，柠檬酸1.2-1.8g，其余成分为水。培养基于灭菌前调pH值至4.8-5.2，可用NaOH及HCl调节。然后于121℃灭菌15分钟，备用。如果采用动态发酵培养，可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于28-32℃，冲程65-80mm，转速60-100r/m的往复式摇床振荡培养6-12天，停止发酵，得发酵液；如果采用静态发酵培养，则其他步骤与动态发酵培养相同，但不必振荡培养，而是于28-32℃静止放置6-12天后，停止发酵，得发酵液。

（4）细菌纤维素产物分离纯化：

发酵液经固液分离，固体为细菌纤维素凝胶，液体为发酵废液，取出细菌纤维素凝胶，蒸馏水冲洗多次，除去表面杂质。将细菌纤维素凝胶浸入0.1mol／L的NaOH溶液中，80℃保温60min，除去残存的菌体和培养基。然后用去离子水反复冲洗，再将细菌纤维素凝胶浸入0.1mol/L的NaOH溶液中，100℃水浴至凝胶呈乳白色半透明状。然后用去离子水反复冲洗，使凝胶膜pH值为7.0，105℃烘干至恒重，得干的细菌纤维素。

（5）细菌纤维素产物平均聚合度测定：

称取干的细菌纤维素溶于铜-乙二胺溶液中，配制成细菌纤维素浓度为c的溶液。测细菌纤维素在铜-乙二胺溶液中的相对粘度η_r，增比粘度η_sp。根据单点法测定高聚物溶液特性粘度[η]的通用公式： $\left[\mathrm{\η}\right]=\frac{\sqrt{2({\mathrm{\η}}_{\mathrm{sp}}-\ln {\mathrm{\η}}_r)}}{c}.$

根据Mark-Houwink经验方程：[η]=kM^α，k、α为常数。由《Polymer Data Handbook》查的得k、α值，求得粘均分子量M。由平均聚合度

公式，求得细菌纤维素的平均聚合度。

实施例1：

将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于新配制的固体培养基斜面上，固体培养基斜面配方组成如下(g/L)：葡萄糖80g，酵母膏8g，碳酸钙15g，琼脂15g，其余成分为水，pH6.5，灭菌备用。28℃培养24小时，再冷藏于4℃5天。取4℃冰箱内保藏5天的斜面种，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的20ml液体活化培养基中［液体活化培养基的配方组成(g/L)：葡萄糖80g，酵母膏8g，蛋白胨5g，其余成分为水，调pH值至6.0，灭菌备用。］，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于28℃往复式摇床振荡培养18小时，摇床转速为80r/m，冲程为65mm，得到液体活化种子液。取上述培养好的液体活化种子液按5%接种量（2.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基上，发酵培养基的组成(g/L)如下：

葡萄糖30g，酵母膏0.8g，蛋白胨6g，Na₂HPO₄·12H₂O 6g，生化级玉米浆4g，乙酸0.8g，无水乙醇8g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至5.8。然后于121℃灭菌15分钟，备用。可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于28℃，冲程65mm，转速60r/m的往复式摇床振荡培养6天，停止发酵，得到发酵液；发酵液经固液分离，固体为细菌纤维素凝胶，液体为发酵废液，取出细菌纤维素凝胶，蒸馏水冲洗2次，将细菌纤维素凝胶浸入0.1mol／L的NaOH溶液中，80℃保温60min，然后用去离子水冲洗2次后，再将细菌纤维素凝胶浸入0.1mol/L的NaOH溶液中，100℃水浴至凝胶呈乳白色半透明状。然后用去离子水反复冲洗，使凝胶膜pH值为7.0，105℃烘干至恒重，得干的细菌纤维素。然后采用粘度法测定细菌纤维素的聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为2180。

实施例2：

将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于新配制的固体培养基斜面上，固体培养基斜面配方组成如下(g/L)：葡萄糖80g，酵母膏8g，碳酸钙15g，琼脂15g，其余成分为水，pH6.5，灭菌备用。28℃培养24小时，再冷藏于4℃5天。取4℃冰箱内保藏5天的斜面种，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的20ml液体活化培养基中［液体活化培养基的配方组成(g/L)：葡萄糖80g，酵母膏8g，蛋白胨5g，其余成分为水，调pH值至6.0。］，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于28℃往复式摇床振荡培养18小时，摇床转速为80r/m，冲程为65mm，由此得到液体活化种子液。取上述培养好的液体活化种子液按5%接种量（2.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基中，发酵培养基的配方组成(g/L)如下：

葡萄糖30g，酵母膏0.8g，蛋白胨6g，Na₂HPO₄·12H₂O 6g，生化级玉米浆4g，乙酸0.8g，无水乙醇8g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至5.8。然后于121℃灭菌15分钟，备用。可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于28℃静止放置6天后，停止发酵，得到发酵液。

发酵液经固液分离，固体为细菌纤维素凝胶，液体为发酵废液，取出细菌纤维素凝胶，蒸馏水冲洗2次，将细菌纤维素凝胶浸入0.1mol／L的NaOH溶液中，80℃保温60min，然后用去离子水冲洗2次后，再将细菌纤维素凝胶浸入0.1mol/L的NaOH溶液中，100℃水浴至凝胶呈乳白色半透明状。然后用去离子水反复冲洗，使凝胶膜pH值为7.0，105℃烘干至恒重，得干的细菌纤维素。然后采用粘度法测定细菌纤维素的聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为2150。

实施例3：

将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于新配制的固体培养基斜面上，固体培养基斜面配方组成如下(g/L)：葡萄糖100g，酵母膏10g，碳酸钙25g，琼脂18g，其余成分为水，pH7.2，灭菌备用。32℃培养36小时，再冷藏于4℃3天。取4℃冰箱内保藏3天的斜面种，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的20ml液体活化培养基中［液体活化培养基的配方组成(g/L)：葡萄糖100g，酵母膏10g，蛋白胨7.5g，其余成分为水，调pH值至7.0，灭菌备用。］，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于32℃往复式摇床振荡培养28小时，摇床转速为90r/m，冲程为75mm，得到液体活化种子液。取上述培养好的液体活化种子液按7%接种量（3.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基上，发酵培养基的配方组成(g/L)如下：

葡萄糖50g，酵母膏1.2g，蛋白胨8g，Na₂HPO₄·12H₂O 10g，生化级玉米浆8g，乙酸1.2g，无水乙醇12g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至6.2。然后于121℃灭菌15分钟，备用。可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于32℃，冲程80mm，转速100r/m的往复式摇床振荡培养12天，停止发酵，得到发酵液；

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为2350。

实施例4：

本实施例与实施例3基本相同，只是实施例3采用动态发酵（于32℃，冲程80mm，转速100r/m的往复式摇床振荡培养12天，停止发酵，得到发酵液），而本实施例采用静态发酵，将液体活化种子液按7%接种量（3.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基中，于32℃，静置培养12天，停止发酵，得到发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为2289。

实施例5：

将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于新配制的固体培养基斜面上，固体培养基斜面配方组成如下(g/L)：葡萄糖120g，酵母膏12g，碳酸钙20g，琼脂22g，其余成分为水，pH7.0，灭菌备用。30℃培养48小时，再冷藏于4℃3天。取4℃冰箱内保藏3天的斜面种，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的20ml液体活化培养基中［液体活化培养基的配方组成(g/L)：葡萄糖120g，酵母膏12g，蛋白胨10g，其余成分为水，调pH值至6.0。］，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于30℃往复式摇床振荡培养36小时，摇床转速为110r/m，冲程为70mm，由此得到液体活化种子液。取上述培养好的液体活化种子液按10%接种量（5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基中，发酵培养基的配方组成(g/L)如下：

葡萄糖40g，酵母膏1.0g，蛋白胨7.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 8.0g，生化级玉米浆6.0g，乙酸1.0g，无水乙醇10g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至6.0。然后于121℃灭菌15分钟，备用。可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于30℃，冲程70mm，转速85r/m的往复式摇床振荡培养9天，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为2301。

实施例6：

本实施例与实施例5基本相同，只是实施例5采用动态发酵（于30℃，冲程70mm，转速85r/m的往复式摇床振荡培养9天，停止发酵，得发酵液。），而本实施例采用静态发酵，将液体活化种子液按10%接种量（5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基中，于30℃，静置培养9天，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为2255。

实施例7：

将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于新配制的固体培养基斜面上，固体培养基斜面配方组成如下(g/L)：葡萄糖80g，酵母膏8g，碳酸钙15g，琼脂15g，其余成分为水，pH6.5，灭菌备用。28℃培养24小时，再4℃保藏5天。取4℃冰箱内保藏5天的斜面种，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的20ml液体活化培养基中［液体活化培养基的配方组成(g/L)：葡萄糖80g，酵母膏8g，蛋白胨5g，其余成分为水，调pH值至6.0。］，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于28℃往复式摇床振荡培养18小时，摇床转速为80r/m，冲程为65mm，由此得到液体活化种子液。取上述培养好的液体活化种子液按5%接种量（2.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基中，发酵培养基的组成(g/L)如下：

甘油30g，酵母膏0.8g，蛋白胨6g，Na₂HPO₄·12H₂O 6g，生化级玉米浆4g，乙酸0.8g，无水乙醇8g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至5.8。然后于121℃灭菌15分钟，备用。可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于28℃，冲程65mm，转速60r/m的往复式摇床振荡培养6天，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为1365。

实施例8：

本实施例与实施例7基本相同，只是实施例7采用动态发酵（于28℃，冲程65mm，转速60r/m的往复式摇床振荡培养6天，停止发酵，得发酵液。），而本实施例采用静态发酵，将液体活化种子液按5%接种量（2.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基中，于28℃静止放置6天后，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为1361。

实施例9：

将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于新配制的固体培养基斜面上，固体培养基斜面配方组成如下(g/L)：葡萄糖100g，酵母膏10g，碳酸钙25g，琼脂18g，其余成分为水，pH7.2，灭菌备用。32℃培养36小时，4℃冷藏3天。取4℃冰箱内保藏3天的斜面种，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的20ml液体活化培养基中［液体活化培养基的配方组成(g/L)：葡萄糖100g，酵母膏10g，蛋白胨7.5g，其余成分为水，调pH值至7.0。］，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于32℃往复式摇床振荡培养28小时，摇床转速为90r/m，冲程为75mm，由此得到液体活化种子液。取上述培养好的液体活化种子液按7%接种量（3.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基上，发酵培养基的配方组成(g/L)如下：

甘油50g，酵母膏1.2g，蛋白胨8g，Na₂HPO₄·12H₂O 10g，生化级玉米浆8g，乙酸1.2g，无水乙醇12g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至6.2。然后于121℃灭菌15分钟，备用。可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于32℃，冲程80mm，转速100r/m的往复式摇床振荡培养12天，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为1380。

实施例10：

本实施例与实施例9基本相同，只是实施例9采用动态发酵（于32℃，冲程80mm，转速100r/m的往复式摇床振荡培养12天，停止发酵，得发酵液），而本实施例采用静态发酵，将液体活化种子液按7%接种量（3.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基上，于32℃，静置培养12天后，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为1375。

实施例11：

将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于新配制的固体培养基斜面上，固体培养基斜面配方组成如下(g/L)：葡萄糖120g，酵母膏12g，碳酸钙20g，琼脂22g，其余成分为水，pH7.0，灭菌备用。30℃培养48小时，4℃保藏3天。取4℃冰箱内保藏3天的斜面种，用接种针将上述斜面上约1cm2面积的菌种刮下，转接到新配置的20ml液体活化培养基中［液体活化培养基的配方组成(g/L)：葡萄糖120g，酵母膏12g，蛋白胨10g，其余成分为水，调pH值至6.0。］，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于30℃往复式摇床振荡培养36小时，摇床转速为110r/m，冲程为70mm，由此得到液体活化种子液。取上述培养好的液体活化种子液按10%接种量（5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基上，发酵培养基的配方组成(g/L)如下：

甘油40g，酵母膏1.0g，蛋白胨7.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 8.0g，生化级玉米浆6.0g，乙酸1.0g，无水乙醇10g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至6.0。然后于121℃灭菌15分钟，备用。可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于30℃，冲程70mm，转速85r/m的往复式摇床振荡培养9天，停止发酵，得到发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为1375。

实施例12：

本实施例与实施例11基本相同，只是实施例11采用动态发酵（于30℃，冲程70mm，转速85r/m的往复式摇床振荡培养9天，停止发酵，得到发酵液），而本实施例采用静态发酵，将液体活化种子液按10%接种量（5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基上，于30℃，静置培养9天后，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为1372。

实施例13：

本实施例与实施例7基本相同，只是发酵培养基不同，发酵培养基的配方组成(g/L)：木糖30g，酵母膏0.8g，蛋白胨6g，Na₂HPO₄·12H₂O 6g，生化级玉米浆4g，乙酸0.8g，无水乙醇8g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至5.8。然后于121℃灭菌15分钟，备用。得到细菌纤维素的平均聚合度为1370。

实施例14：

本实施例与实施例8基本相同，只是发酵培养基不同，发酵培养基的配方组成(g/L)：木糖30g，酵母膏0.8g，蛋白胨6g，Na₂HPO₄·12H₂O 6g，生化级玉米浆4g，乙酸0.8g，无水乙醇8g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至5.8。然后于121℃灭菌15分钟，备用。得到细菌纤维素的平均聚合度为1362。

实施例15：

本实施例与实施例9基本相同，只是发酵培养基不同，发酵培养基的配方组成(g/L)：木糖50g，酵母膏1.2g，蛋白胨8g，Na₂HPO₄·12H₂O 10g，生化级玉米浆8g，乙酸1.2g，无水乙醇12g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至6.2。然后于121℃灭菌15分钟，备用。得到的细菌纤维素的平均聚合度为1378。

实施例16：

本实施例与实施例10基本相同，只是发酵培养基不同，发酵培养基的配方组成(g/L)：木糖50g，酵母膏1.2g，蛋白胨8g，Na₂HPO₄·12H₂O 10g，生化级玉米浆8g，乙酸1.2g，无水乙醇12g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至6.2。然后于121℃灭菌15分钟，备用。得到的细菌纤维素的平均聚合度为1375。

实施例17：

本实施例与实施例11基本相同，只是发酵培养基不同，发酵培养基的配方组成(g/L)：木糖40g，酵母膏1.0g，蛋白胨7.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 8.0g，生化级玉米浆6.0g，乙酸1.0g，无水乙醇10g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至6.0。然后于121℃灭菌15分钟，备用。得到的细菌纤维素的平均聚合度为1369。

实施例18：

本实施例与实施例12基本相同，只是发酵培养基不同，发酵培养基的配方组成(g/L)：木糖40g，酵母膏1.0g，蛋白胨7.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 8.0g，生化级玉米浆6.0g，乙酸1.0g，无水乙醇10g，其余成分为水。培养基于灭菌前用NaOH及HCl调节pH值至6.0。然后于121℃灭菌15分钟，备用。得到的细菌纤维素的平均聚合度为1365。

实施例19：

将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于新配制的固体培养基斜面上，固体培养基斜面配方组成如下(g/L)：葡萄糖80g，酵母膏8g，碳酸钙15g，琼脂15g，其余成分为水，pH6.5，灭菌备用。28℃培养24小时，4℃冷藏5天。取4℃冰箱内保藏5天的斜面种，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的20ml液体活化培养基中［液体活化培养基的配方组成(g/L)：葡萄糖80g，酵母膏8g，蛋白胨5g，其余成分为水，调pH值至6.0。］，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于28℃往复式摇床振荡培养18小时，摇床转速为80r/m，冲程为65mm，由此得到液体活化种子液。取上述培养好的液体活化种子液按5%接种量（2.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基中，发酵培养基的配方组成(g/L)如下：

葡萄糖15g，酵母膏4g，蛋白胨4g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.5g，柠檬酸1.2g，其余成分为水。培养基于灭菌前调pH值至4.8，可用NaOH及HCl调节。然后于121℃灭菌15分钟，备用。可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于28℃，冲程65mm，转速60r/m的往复式摇床振荡培养6天，停止发酵，得到发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为1562。

实施例20：

本实施例与实施例19基本相同，只是实施例19采用动态发酵（于28℃，冲程65mm，转速60r/m的往复式摇床振荡培养6天，停止发酵，得到发酵液），而本实施例采用静态发酵，将液体活化种子液按5%接种量（2.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基中，于28℃静止放置6天后，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得出细菌纤维素的平均聚合度为1550。

实施例21：

将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于新配制的固体培养基斜面上，固体培养基斜面配方组成如下(g/L)：葡萄糖100g，酵母膏10g，碳酸钙25g，琼脂18g，其余成分为水，pH7.2，灭菌备用。32℃培养36小时，4℃保藏3天。取4℃冰箱内保藏3天的斜面种，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的20ml液体活化培养基中［液体活化培养基的组成(g/L)：葡萄糖100g，酵母膏10g，蛋白胨7.5g，其余成分为水，调pH值至7.0。］，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于32℃往复式摇床振荡培养28小时，摇床转速为90r/m，冲程为75mm，由此得到液体活化种子液。取上述培养好的液体活化种子液按7%接种量（3.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基上，发酵培养基的配方组成(g/L)如下：

葡萄糖25g，酵母膏6g，蛋白胨6g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.0g，柠檬酸1.8g，其余成分为水。培养基于灭菌前调pH值至5.2，可用NaOH及HCl调节。然后于121℃灭菌15分钟，备用。可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于32℃，冲程80mm，转速100r/m的往复式摇床振荡培养12天，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得到的细菌纤维素的平均聚合度为1650。

实施例22：

本实施例与实施例21基本相同，只是实施例21采用动态发酵（于32℃，冲程80mm，转速100r/m的往复式摇床振荡培养12天，停止发酵，得发酵液），而本实施例采用静态发酵，将液体活化种子液按7%接种量（3.5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基上，于32℃，静置培养12天，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得到的细菌纤维素的平均聚合度为1630。

实施例23：

将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于新配制的固体培养基斜面上，固体培养基斜面配方组成如下(g/L)：葡萄糖120g，酵母膏12g，碳酸钙20g，琼脂22g，其余成分为水，pH7.0，灭菌备用。30℃培养48小时，4℃冷藏3天。取4℃冰箱内保藏3天的斜面种，用接种针将上述斜面上约1cm²面积的菌种刮下，转接到新配置的20ml液体活化培养基中［液体活化培养基的配方组成(g/L)：葡萄糖120g，酵母膏12g，蛋白胨10g，其余成分为水，调pH值至6.0。］，液体活化培养基装于250ml三角瓶中，三角瓶装量为20ml，于30℃往复式摇床振荡培养36小时，摇床转速为110r/m，冲程为70mm，由此得液体活化种子液。取上述培养好的液体活化种子液按10%接种量（5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基上，发酵培养基的配方组成(g/L)如下：

葡萄糖20g，酵母膏5g，蛋白胨5g，Na₂HPO₄·12H₂O 2.8g，柠檬酸1.5g，其余成分为水。培养基于灭菌前调pH值至5.0，可用NaOH及HCl调节。然后于121℃灭菌15分钟，备用。可用500ml（更大体积也可）的三角瓶装发酵培养基，装量为三角瓶体积的10%，如果用500ml三角瓶，则装发酵培养基50ml，于30℃，冲程70mm，转速85r/m的往复式摇床振荡培养9天，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得到的细菌纤维素的平均聚合度为1604。

实施例24：

本实施例与实施例23基本相同，只是实施例23采用动态发酵（于30℃，冲程70mm，转速85r/m的往复式摇床振荡培养9天，停止发酵，得发酵液），而本实施例采用静态发酵，将液体活化种子液按10%接种量（5ml）接种到新配置、121℃灭菌15分钟并已冷却至室温的50ml发酵培养基上，于30℃，静置培养9天，停止发酵，得发酵液。

发酵液按照实施例1的方法分离纯化得到干的细菌纤维素，再采用粘度法测定细菌纤维素的平均聚合度，得到的细菌纤维素的平均聚合度为1590。

Claims (2)

1.一种控制细菌纤维素聚合度的细菌纤维素微生物制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（a）菌种的液体活化：葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M208149经固体斜面活化后，再接种于液体活化培养基中，于28-32℃往复式摇床振荡培养18～36小时，摇床转速为80-110r/m，冲程为65-75mm，由此获得液体活化种子液，所述的液体活化培养基为每升含有葡萄糖80～120g，酵母膏8～12g，蛋白胨5～10g，余量为水，pH值6.0~7.0；

（b）发酵：将液体活化种子液按照5~10%的接种量，接入发酵培养基中进行动态发酵培养或者静态发酵培养，得到目标细菌纤维素；

所述的动态发酵培养为在温度28-32℃，冲程65-80mm，转速60-100r/m的往复式摇床振荡培养6~12天；

所述的静态发酵培养为在温度28-32℃静止放置6-12天；

所述的发酵培养基为以下培养基中的一种：

发酵培养基A：每升含有葡萄糖30-50g，酵母膏0.8-1.2g，蛋白胨6-8g，Na₂HPO₄·12H₂O6-10g，生化级玉米浆4-8g，乙酸0.8-1.2g，无水乙醇8-12g，余量为水，pH值5.8-6.2；

发酵培养基B：每升含有甘油或木糖30-50g，酵母膏0.8-1.2g，蛋白胨6-8g，Na₂HPO₄·12H₂O 6-10g，生化级玉米浆4-8g，乙酸0.8-1.2g，无水乙醇8-12g，余量为水，pH值5.8-6.2；

发酵培养基C：每升含有葡萄糖15-25g，酵母膏4-6g，蛋白胨4-6g，Na₂HPO₄·12H₂O2.5-3.0g，柠檬酸1.2-1.8g，余量为水，pH值4.8-5.2。

2.根据权利要求1所述的细菌纤维素微生物制备方法，其特征在于，所述的葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149经固体斜面活化后，再接种于液体活化培养基中为将葡糖酸醋酸杆菌(Gluconacetobacter sp.)GD-BC-1CCTCC M 208149划线于固体培养基斜面上，28~32℃培养24~48小时，再冷藏于4℃3~5天，然后再按1cm²面积上述斜面上的菌种接种于20ml的液体活化培养基的量接种，所述的固体培养基为：每升含有葡萄糖80~120g，酵母膏8~12g，碳酸钙15~25g，琼脂15~22g，余量为水，pH值6.5~7.2。