CN102286555A - 可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可制成静息细胞的连续发酵生产聚苹果酸的方法，实施步骤如下：（1）斜面菌种制备；（2）种子液制备；（3）上述种子液用于接种至5L无菌发酵罐中发酵；（4）发酵前期不控制pH，直至有菌丝球出现后连续流加NaOH控制发酵液pH为5.0-5.5；（5）发酵55-60h后，发酵液中的葡萄糖浓度为8-10g/L时，停止发酵，重新添加新鲜培养基，进行重复发酵；（6）静息细胞制备；（7）采用相同的发酵方法进行静息细胞法发酵；（8）发酵液用截留分子量为6000Da的中空纤维膜过滤，加入等体积的无水乙醇沉淀，烘干称重；聚苹果酸的产量为50-57g/L。该方法可有效减少发酵过程中的非最优经济阶段，达到了缩短发酵时间，提高设备利用率，降低产品生产成本的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵生产聚苹果酸的方法，特别涉及一种可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法。
背景技术
聚苹果酸（polymalic acid，PMLA）是一种具有优良生物相容性、生物可降解性和生物可吸收性的聚合物，最初由Shimada等于1969年研究一种圆弧青霉菌时发现。它作为一种水溶性脂肪族聚酯，具有高度水溶性、化学衍生性，聚苹果酸可在水溶液中自发或酶促降解生成小分子L-苹果酸，该L-苹果酸单体可被人体吸收并无任何毒副作用。聚苹果酸分解和燃烧后，最终产物是二氧化碳和水，可被植物吸收，对环境无毒无害。聚苹果酸的诸多特性使其在医学和药学等领域的研究中得到日益广泛的关注。理论研究表明，聚苹果酸及其衍生物可望作为手术缝合线、组织工程支架材料、药物控制释放体系等在生物医药领域获得重要应用。
目前已经可以用化学合成或从特定的微生物中得到这种高分子。国内利用微生物发酵生产聚苹果酸一般采用的是一步发酵法或补料发酵法，生产周期为9天，最高产量为37g/L；日本采用静息细胞法发酵，历时5天，最高产量是80g/L。
由于生产成本非常高，合成的聚苹果酸和天然的聚苹果酸还是比较难得到，因此提供一种高效的、低成本的可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法，是该技术领域科研人员急需开发的新课题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足之处，提供一种高效可行并可降低聚苹果酸生产成本，减小投资，降低成本，益于生产应用的可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法。
为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下：一种可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法，该方法是出芽短梗霉经一级种子培养后转移到无菌发酵培养基中，发酵初期不控制pH，当菌丝球出现后控制发酵液pH促进聚苹果酸的合成，然后放出发酵罐中的无菌体发酵液，后加入新鲜的无菌发酵培养基进行重复发酵，重复发酵次数为4-5批次；用无菌的磷酸缓冲液洗涤发酵罐中的菌体制成静息细胞，加入无菌的无氮源发酵培养基进行静息细胞法发酵生产聚苹果酸。
具体实施步骤如下：
（1）斜面菌种制备：将出芽短梗霉TJZKBIO153接种到无菌斜面上，在28-30℃恒温培养48-60h，直至出现黑色孢子；斜面培养基组成包括，单位1L：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，用蒸馏水定容至1L，pH值5.6；其中所用菌种：出芽短梗酶（Aureobasidium）TJZKBA10326；
（2）种子液制备：挑取一环上述的出芽短梗霉TJZKBIO153斜面菌种接入种子培养基，在28-30℃培养48-60h后出现3-5mm菌丝球，用2-6层无菌纱布过滤除去菌丝球获得滤液即种子液，种子液浓度为106-107个/mL；种子培养基中的碳源为葡萄糖，碳源浓度为6%-8%；有机氮源为玉米浆、酵母粉、蛋白胨、玉米浆粉中的一种或其两种以上的组合物，无机氮源为丁二酸铵，总氮源浓度为0.35%-0.5%；种子培养基中含有锌、镁、钾无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐，使用量分别为5mg/L-0.5g/L，添加合成聚苹果酸的前体物质为丁二酸、马来酸的一种或两种的组合，总使用量为0.2-0.5%，115℃、15min灭菌；500ml规格的摇瓶装液量是100ml，转速为200-230rpm；
（3）发酵培养基灭菌：5L发酵罐中加入2.5L发酵培养基，115℃、15min灭菌后，pH5.0-5.5，冷却至28-30℃后备用；发酵培养基中的碳源为葡萄糖，碳源浓度为12%-16%；有机氮源为玉米浆、酵母粉、蛋白胨、玉米浆粉中的一种或其两种以上的组合物，无机氮源为丁二酸铵，总氮源浓度为0.35%-0.5%；发酵培养基中含有锌、镁无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐，使用量分别为5mg/L-0.1g/L，添加合成聚苹果酸的前体物质为丁二酸、马来酸的一种或两种的组合，总使用量为0.2-0.5%；
（4）发酵：上述种子液用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，接种量为8%-12%，发酵前期的12-16h不控制发酵液的pH，直至有直径为3mm-5mm的菌丝球长出，后通过连续流加质量浓度为5%-10%NaOH无菌溶液控制发酵液pH5.0-5.5，控制整个发酵过程中的温度为28-30℃，通气量为3-3.5L/min，发酵48h后每隔2-4h检测发酵中葡萄糖的含量；
（5）放料、加料：发酵55-60h后，取样测定发酵液中葡萄糖的浓度为8-10g/L时，从发酵罐中放出发酵液，然后加入3L新鲜的无菌发酵培养基进行重复发酵，发酵4-5批次以后，菌体产酸能力下降，消耗氢氧化钠的能力明显减弱，停止发酵；
（6）静息细胞制备：发酵结束放出全部发酵液后用无菌的0.1-0.2mol/L pH7.0磷酸缓冲液洗涤菌体两次，制成静息细胞，磷酸盐缓冲液为钠盐或钾盐的磷酸盐缓冲液；
（7）静息细胞发酵：将2.5L无氮源发酵培养液添加到5L发酵罐中，控制发酵温度28℃-30℃，通气量为3-3.5L/min，待pH下降到4.8-5.0后通过连续流加NaOH控制发酵液的pH值至5.0-5.5；发酵48h后每隔2-4h检测发酵中葡萄糖的含量，至发酵液中葡萄糖浓度为8-10g/L，结束发酵；静息细胞发酵培养基的碳源为葡萄糖，碳源浓度为12%-16%；静息细胞发酵培养基中含有锌、镁无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐，使用量分别为5mg/L-0.1g/L，溶剂为0.1-0.2mol/L pH7.0的钠盐或钾盐的磷酸盐缓冲液，此培养基经115℃、15min灭菌；
（8）聚苹果酸的提取：发酵液使用截留分子量为6000Da的中空纤维膜过滤，滤液用等体积的无水乙醇沉淀，烘干称重，得到聚苹果酸的产量为50-57g/L。
本发明的有益效果是：一次制种可维持5个发酵批次，有效减短了发酵过程中的制种时间，比普通发酵的时间减少了至少180小时，提高了设备的利用率；在第一次发酵后可制成静息细胞，减省了氮源的使用，降低了产品的生产成本；本发明采用发酵一段时间后加入碳酸钙的方法，可使菌体在合适浓度范围中最大程度的增殖，从而达到提高发酵产量的目的。本发明工艺简单，效果非常显著；使发酵效率提高了30%，同时降低成本35%，产量比采用普通发酵的产量提高了46%。
具体实施方式
以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式详述如下：
实施例1
（1）斜面菌种制备
按以下配比制备斜面培养基：
马铃薯：200g/L，
葡萄糖：20g/L，
琼脂：20g/L，
用10%氢氧化钠调pH至5.6；115℃、15min灭菌制成斜面后，从平板上挑取单菌落划线接种，即将出芽短梗霉TJZKBIO153接种到无菌斜面上，在30℃恒温培养48h，出现黑色孢子。
（2）种子液制备
按以下配比制备种子培养基：
葡萄糖：60g/L，
丁二酸铵：3g/L，
玉米浆：0.5g/L，
丁二酸：2g/L，
磷酸二氢钾：0.1g/L，
碳酸钠：0.4g/L，
硫酸镁：0.1g/L，
硫酸锌：0.005g/L，
用10%氢氧化钠调pH至5.0，115℃、15min灭菌，降至30℃时，挑取一环上述的出芽短梗霉TJZKBIO153斜面菌种接入种子培养基， 500mL规格三角瓶装液量为100mL，培养温度30℃，旋转式摇床转速为200rpm，培养48h，出现3mm菌丝球。用灭菌的6层纱布过滤到无菌容器中，得到种子液待用。种子液的菌浓为106个/mL。
（3）发酵培养基灭菌
发酵罐容量为5L，装液量为2.5L，按照如下配比制备发酵培养基：
葡萄糖：120g/L，
丁二酸铵：3g/L，
玉米浆：0.5g/L，
丁二酸：2g/L，
硫酸镁：0.1g/L，
硫酸锌：0.005g/L，
用5%盐酸调至pH至5.0，115℃、15min灭菌，降至30℃备用。
（4）发酵
按照10%接种量接入种子液开始发酵，控制整个发酵过程中的温度为30℃，通气量为3L/min。发酵前的16h不控制发酵液的pH，直至有直径3mm的菌丝球长出，后通过连续流加质量浓度为5%NaOH无菌溶液控制发酵液pH5.0，发酵48h后每隔2h检测发酵中葡萄糖的含量。
（5）放料、加料
发酵60h后，取样测定发酵液中葡萄糖的浓度为10g/L，停止发酵，从发酵罐中放出发酵液。然后加入2.5L新鲜的无菌发酵培养基进行重复发酵，发酵4批次以后，菌体产酸能力下降，消耗氢氧化钠的能力明显减弱，停止发酵。
（6）静息细胞制备
第一次发酵结束后，从发酵罐中放出发酵液，用无菌的0.1mol/L pH7.0磷酸钠缓冲液洗涤菌体两次，制成静息细胞。
（7）静息细胞发酵
发酵罐容量为5L，装液量为2.5L，按照如下配比制备静息细胞发酵培养基：
葡萄糖：120g/L，
丁二酸：2g/L，
硫酸镁：0.1g/L，
硫酸锌：0.005g/L，
用0.1mol/L pH7.0磷酸钾缓冲液定容至1L，115℃、15min灭菌，降至30℃时补加到发酵罐中开始发酵，控制整个发酵过程中的温度为30℃，通气量为3.0L/min。待pH下降到5.0后通过连续流加NaOH控制发酵液的pH值至5.0；发酵48h后每隔2h检测发酵液中葡萄糖的含量，发酵60h后发酵液中葡萄糖浓度为10g/L，结束发酵。
（8）聚苹果酸的提取
发酵液使用截留分子量为6000Da的中空纤维膜过滤，滤液用等体积的无水乙醇沉淀，烘干称重，平均每批次得到聚苹果酸的产量为50g/L。
具体制备中：
从种子液到发酵罐的接种量为8%-12% v/v，菌种浓度为106-107个/mL。
所述种子培养基中的碳源为葡萄糖，碳源浓度为6%-8%；所述种子培养基中的有机氮源为玉米浆、酵母粉、蛋白胨、玉米浆粉中的一种或其两种以上的任意配比组合物，无机氮源为丁二酸铵，总氮源浓度为0.35%-0.5%；所述种子培养基中含有锌、镁、钾无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐，使用量分别为5mg/L-0.5g/L，添加合成聚苹果酸的前体物质为丁二酸、马来酸的一种或两种的组合，总使用量为0.2-0.5%，此培养基经115℃、15min灭菌后，pH5.0-5.5，冷却至28-30℃。
所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖，碳源浓度为12%-16%；所述发酵培养基中含有锌、镁无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐，使用量分别为5mg/L-0.1g/L，添加合成聚苹果酸的前体物质为丁二酸、马来酸的一种或两种的组合，总使用量为0.2-0.5%，此培养基经115℃、15min灭菌后，pH5.0-5.5，冷却至28-30℃。
所述的发酵前期的12-16h不控制发酵液的pH，直至有直径为3mm-5mm的菌丝球长出，后通过连续流加质量浓度为5%-10%NaOH无菌溶液控制发酵液pH5.0-5.5。
所述的发酵时间55-60h，发酵液中的葡萄糖浓度为8-10g/L时开始放料，放出全部的发酵液后重新加入新鲜无菌的发酵培养基进行发酵，所述的发酵是在发酵液pH降至4.8-5.0，后通过连续流加质量浓度为5%-10%NaOH无菌溶液控制发酵液pH5.0-5.5的条件下重复发酵，所述的重复发酵次数为4-5批次。
所述的静息细胞的制备是在第一次发酵结束放出全部发酵液后，用0.1-0.2mol/L pH7.0的磷酸缓冲液洗涤菌体1-2次，所述的磷酸盐缓冲液为钠盐或钾盐的磷酸盐缓冲液。
所述的静息细胞发酵培养基的碳源为葡萄糖，碳源浓度为12%-16%；所述的静息细胞发酵培养基中含有锌、镁无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐，使用量分别为5mg/L-0.1g/L，溶剂为0.1-0.2mol/L pH7.0的钠盐或钾盐的磷酸盐缓冲液，此培养基经115℃、15min灭菌后，pH7.0，冷却至28-30℃。
实施例2
（1）斜面菌种制备
按以下配比制备斜面培养基：
马铃薯：200g/L，
葡萄糖：20g/L，
琼脂：20g/L，
用10%氢氧化钠调pH至5.6；115℃、15min灭菌制成斜面后，从平板上挑取单菌落划线接种，在28℃恒温培养60h，出现黑色孢子。
（2）种子液制备
按以下配比制备种子培养基：
葡萄糖：80g/L，
丁二酸铵：3.5g/L，
蛋白胨：1.5g/L，
马来酸：5g/L，
磷酸二氢钾：0.1g/L，
碳酸钠：0.4g/L，
硫酸镁：0.1g/L，
硫酸锌：0.005g/L，
用10%氢氧化钠调pH至5.5，115℃、15min灭菌，降至28℃时，接入斜面菌种，500mL规格三角瓶装液量为100mL，培养温度28℃，旋转式摇床转速为230rpm，培养60h，出现5mm菌丝球。用灭菌的6层纱布过滤到无菌容器中，得到种子液待用。种子液的菌浓为107个/mL。
（3）发酵培养基灭菌
发酵罐容量为5L，装液量为2.5L，按照如下配比制备发酵培养基：
葡萄糖：160g/L，
丁二酸铵：3.5g/L，
蛋白胨：1.5g/L，
马来酸：5g/L，
硫酸镁：0.1g/L，
硫酸锌：0.005g/L，
用5%盐酸调至pH至5.5，115℃、15min灭菌，降至28℃备用。
（4）发酵
按照12%接种量接入种子液开始发酵，控制整个发酵过程中的温度为28℃，通气量为3.5L/min。发酵前的12h不控制发酵液的pH，直至有直径5mm的菌丝球长出，后通过连续流加质量浓度为10%NaOH无菌溶液控制发酵液pH5.5，发酵48h后每隔4h检测发酵中葡萄糖的含量。
（5）放料、加料
发酵55h后，取样测定发酵液中葡萄糖的浓度为8g/L，停止发酵，从发酵罐中放出发酵液。然后加入2.5L新鲜的无菌发酵培养基进行重复发酵，发酵5批次以后，菌体产酸能力下降，消耗氢氧化钠的能力明显减弱，停止发酵。
（6）静息细胞制备
第一次发酵结束后，从发酵罐中放出发酵液，用无菌的0.2mol/L pH7.0磷酸钠缓冲液洗涤菌体两次，制成静息细胞。
（7）静息细胞发酵
发酵罐容量为5L，装液量为2.5L，按照如下配比制备静息细胞发酵培养基：
葡萄糖：160g/L，
丁二酸：2g/L，
硫酸镁：0.1g/L，
硫酸锌：0.005g/L，
用0.2mol/L pH7.0磷酸钾缓冲液定容至1L，115℃、15min灭菌，降至30℃时补加到发酵罐中开始发酵，控制整个发酵过程中的温度为28℃，通气量为3.0L/min。待pH下降到5.0后通过连续流加NaOH控制发酵液的pH值至5.5；发酵48h后每隔4h检测发酵液中葡萄糖的含量，发酵55h后发酵液中葡萄糖浓度为8g/L，结束发酵。
（8）聚苹果酸的提取
发酵液使用截留分子量为6000Da的中空纤维膜过滤，滤液用等体积的无水乙醇沉淀，烘干称重，平均每批次得到聚苹果酸的产量为57g/L。
其它同实施例1。
实施例3
（1）斜面菌种制备
按以下配比制备斜面培养基：
马铃薯：200g/L，
葡萄糖：20g/L，
琼脂：20g/L，
用10%氢氧化钠调pH至5.6；115℃、15min灭菌制成斜面后，从平板上挑取单菌落划线接种，在30℃恒温培养50h，出现黑色孢子。
（2）种子液制备
按以下配比制备种子培养基：
葡萄糖：80g/L，
丁二酸铵：3.0g/L，
蛋白胨：0.5g/L，
丁二酸：2g/L，
磷酸二氢钾：0.1g/L，
碳酸钠：0.4g/L，
硫酸镁：0.1g/L，
硫酸锌：0.005g/L，
用10%氢氧化钠调pH至5.3，115℃、15min灭菌，降至30℃时，接入斜面菌种，500mL规格三角瓶装液量为100mL，培养温度30℃，旋转式摇床转速为220rpm，培养50h，出现4mm菌丝球。用灭菌的2层纱布过滤到无菌容器中，得到种子液待用。种子液的菌浓为106个/mL。
（3）发酵培养基灭菌
发酵罐容量为5L，装液量为2.5L，按照如下配比制备发酵培养基：
葡萄糖：160g/L，
丁二酸铵：3.0g/L，
蛋白胨：0.5g/L，
丁二酸：2g/L，
硫酸镁：0.1g/L，
硫酸锌：0.005g/L，
用5%盐酸调至pH至5.3，115℃、15min灭菌，降至30℃备用。
（4）发酵
按照10%接种量接入种子液开始发酵，控制整个发酵过程中的温度为30℃，通气量为3.0L/min。发酵前的16h不控制发酵液的pH，直至有直径4mm的菌丝球长出，后通过连续流加质量浓度为10%NaOH无菌溶液控制发酵液pH5.3，发酵48h后每隔4h检测发酵中葡萄糖的含量。
（5）放料、加料
发酵57h后，取样测定发酵液中葡萄糖的浓度为8g/L，停止发酵，从发酵罐中放出发酵液。然后加入2.5L新鲜的无菌发酵培养基进行重复发酵，发酵4批次以后，菌体产酸能力下降，消耗氢氧化钠的能力明显减弱，停止发酵。
（6）静息细胞制备
第一次发酵结束后，从发酵罐中放出发酵液，用无菌的0.2mol/L pH7.0磷酸钠缓冲液洗涤菌体两次，制成静息细胞。
（7）静息细胞法发酵
发酵罐容量为5L，装液量为2.5L，按照如下配比制备静息细胞发酵培养基：
葡萄糖：120g/L，
丁二酸：2g/L，
硫酸镁：0.1g/L，
硫酸锌：0.005g/L，
用0.1mol/L pH7.0磷酸钾缓冲液定容至1L，115℃、15min灭菌，降至30℃时补加到发酵罐中开始发酵，控制整个发酵过程中的温度为30℃，通气量为3.0L/min。待pH下降到5.0后通过连续流加NaOH控制发酵液的pH值至5.3；发酵48h后每隔4h检测发酵液中葡萄糖的含量，发酵60h后发酵液中葡萄糖浓度为8g/L，结束发酵。
（8）聚苹果酸的提取
发酵液使用截留分子量为6000Da的中空纤维膜过滤，滤液用等体积的无水乙醇沉淀，烘干称重，得到聚苹果酸的产量为55g/L。
其它同实施例1。
在上述发酵条件范围内，不同的发酵条件对聚苹果酸的产量影响不大，平均每批次可发酵得到54g/L的聚苹果酸，一次制种平均可得发酵液10L，发酵效率比分批发酵效率提高30%。
上述参照实施例对用可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可根据所限定范围例举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于
具体实施步骤如下：
（1）斜面菌种制备：将出芽短梗霉TJZKBIO153接种到无菌斜面上，在28-30℃恒温培养48-60h，直至出现黑色孢子；
（2）种子液制备：挑取一环出芽短梗霉TJZKBIO153斜面菌种接入种子培养基，在28-30℃培养48-60h后，用无菌纱布过滤菌丝体获得滤液即种子液；
（3）发酵培养基灭菌：5L发酵罐中加入2.5L发酵培养基，115℃、15min灭菌后冷却至28-30℃；
（4）发酵：发酵前期不控制发酵液pH，直至有菌丝球出现后连续流加NaOH控制发酵液的pH值至5.0-5.5，控制整个发酵过程中的温度为28-30℃，通气量为3-3.5L/min，发酵48h后每隔2-4h检测发酵中葡萄糖的含量；
（5）放料、加料：发酵55-60h后，取样测定发酵液中葡萄糖的浓度为8-10g/L时，从发酵罐中放出发酵液，然后加入2.5L新鲜的无菌发酵培养基进行重复发酵；
（6）静息细胞制备：发酵结束放出全部发酵液后用无菌的磷酸缓冲液洗涤菌体两次，制成静息细胞；
（7）静息细胞发酵：将2.5L无氮源发酵培养液添加到5L发酵罐中，控制发酵温度28℃-30℃，通气量为3-3.5L/min，待pH下降到4.8-5.0后通过连续流加NaOH控制发酵液的pH值至5.0-5.5 发酵48h后每隔2-4h检测发酵中葡萄糖的含量，至发酵液中葡萄糖浓度为8-10g/L，结束发酵；
（8）聚苹果酸的提取：发酵液使用截留分子量为6000Da的中空纤维膜过滤，滤液用等体积的无水乙醇沉淀，烘干称重，得到聚苹果酸的产量为50-57g/L。
2.根据权利要求1所述的可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于：从种子液到发酵罐的接种量为8%-12% v/v，菌种浓度为106-107个/mL。
3.根据权利要求1所述的可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于：所述种子培养基中的碳源为葡萄糖，碳源浓度为6%-8%；所述种子培养基中的有机氮源为玉米浆、酵母粉、蛋白胨、玉米浆粉中的一种或其两种以上的任意配比组合物，无机氮源为丁二酸铵，总氮源浓度为0.35%-0.5%；所述种子培养基中含有锌、镁、钾无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐，使用量分别为5mg/L-0.5g/L，添加合成聚苹果酸的前体物质为丁二酸、马来酸的一种或两种的组合，总使用量为0.2-0.5%，此培养基经115℃、15min灭菌后，pH5.0-5.5，冷却至28-30℃。
4.根据权利要求1所述的可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于：所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖，碳源浓度为12%-16%；所述发酵培养基中含有锌、镁无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐，使用量分别为5mg/L-0.1g/L，添加合成聚苹果酸的前体物质为丁二酸、马来酸的一种或两种的组合，总使用量为0.2-0.5%，此培养基经115℃、15min灭菌后，pH5.0-5.5，冷却至28-30℃。
5.根据权利要求1所述的可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于：所述的发酵前期的12-16h不控制发酵液的pH，直至有直径为3mm-5mm的菌丝球长出，后通过连续流加质量浓度为5%-10%NaOH无菌溶液控制发酵液pH5.0-5.5。
6.根据权利要求1所述的可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于：所述的发酵时间55-60h，发酵液中的葡萄糖浓度为8-10g/L时开始放料，放出全部的发酵液后重新加入新鲜无菌的发酵培养基进行发酵，所述的发酵是在发酵液pH降至4.8-5.0，后通过连续流加质量浓度为5%-10%NaOH无菌溶液控制发酵液pH5.0-5.5的条件下重复发酵，所述的重复发酵次数为4-5批次。
7.根据权利要求1所述的可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于：所述的静息细胞的制备是在第一次发酵结束放出全部发酵液后，用0.1-0.2mol/L pH7.0的磷酸缓冲液洗涤菌体1-2次，所述的磷酸盐缓冲液为钠盐或钾盐的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的可制成静息细胞的重复发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于：所述的静息细胞发酵培养基的碳源为葡萄糖，碳源浓度为12%-16%；所述的静息细胞发酵培养基中含有锌、镁无机盐元素的盐酸盐、硫酸盐，使用量分别为5mg/L-0.1g/L，溶剂为0.1-0.2mol/L pH7.0的钠盐或钾盐的磷酸盐缓冲液，此培养基经115℃、15min灭菌后，pH7.0，冷却至28-30℃。
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