CN103740774A - 高密度发酵生产聚苹果酸的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种高密度发酵生产聚苹果酸的方法，属于微生物发酵领域。所述高密度发酵生产聚苹果酸的方法是通过两阶段调控pH和溶氧，第一阶段使菌体大量生长，；第二阶段改变pH和溶氧，使聚苹果酸大量积累。本发明提供了一种生产聚苹果酸的方法，操作简单，效果明显，既缩短了发酵周期，又大大提高了聚苹果酸的生产效率；高密度发酵采用两阶段工艺,一方面可以减少菌体培养阶段的设备规模,节省大型发酵罐在发酵过程中的功率消耗和能量消耗,另一方面可以提高细胞培养和聚苹合成的生产强度,使生产过程达到节能降耗的目的。

Description

高密度发酵生产聚苹果酸的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种高密度发酵生产聚苹果酸的方法，特别涉及一种两阶段调控pH和溶氧来生产聚苹果酸的方法。
背景技术
现在，大部分合成高分子是石油化学产品，对环境产生了深远的影响。而随着人们环境保护知识的积累，引起了传统的不可降解高分子生产的改变。目前，人们关注的重点是环境友好型的生物可降解高分子，这些高分子聚合物的生产有利于节约能源和资源，从而减缓温室效应，发展生态协调的工艺过程和产品。
聚苹果酸（聚羟基丁二酸酯，Poly malic acid或Poly malate,简称为PMLA）是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物。苹果酸是一种含有羟基的二羧酸，它是一种很好的食品添加剂，其水溶解性很强,在体内主要参与三羧酸(TCA)循环。聚合时通过其羟基和羧基酯化连接而成为高分子化合物。苹果酸含有两个羧基和一个羟基，其相互酯化的产物主要有三种，即α型、β型、γ型PMLA，唯一存在于人体内的只有β型PMLA（结构如下图）。
Figure BDA0000446213350000011
图2聚L-β–苹果酸的立体结构
聚苹果酸（聚羟基丁二酸酯）属于聚酯类聚合物，是完全生物降解高分子。生物降解性材料是指通过自然界微生物（细菌、真菌等）作用而发生降解的高分子物质。该种材料降解的产物无毒无害,不会对环境产生二次污染,近年来这种高分子材料的开发研究得到了飞速发展。在国外，有关聚苹果酸的研究开始于上世纪60年代，对于其性质、用途、合成方法都有一定的研究和报道，聚苹果酸主要应用于药物载体和微胶囊材料，其合成方法主要集中于化学合成，β型聚苹果酸已有商业产品。而国内还刚刚起步，对聚苹果酸的研究非常少，几乎为空白。因此加强聚苹果酸的研究，构建可降解生物高分子的一个研究的平台，具有重要的理论价值和应用价值。
关于聚苹果酸发酵，文献中大多都是通过菌种诱变、培养基优化来提高聚苹果酸产量，很少提到通过控制发酵条件来调控提高聚苹果酸产量，只有在公开号为CN101696434A的发明专利中公开了一种微生物发酵法生产β-聚苹果酸的新工艺，文中提到发酵过程中要控制通风量、罐压、搅拌速率及溶解氧浓度，因此，寻求一种新的方法，来进一步提高聚苹果酸的产量，是当前要解决的重大问题。
发明内容
为解决上述现有技术中聚苹果酸产量的问题，本发明通过两阶段调控pH和溶氧，实现高密度发酵，以提高聚苹果酸的产量。
本发明所述高密度发酵生产聚苹果酸的方法，通过两阶段调控pH和溶氧，第一阶段使菌体大量生长；第二阶段改变pH和溶氧，使聚苹果酸大量合成积累。
具体包括如下步骤：
（1）将出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）CGMCC.NO.3336菌株进行活化6-8h，将其从蔗糖斜面培养基转接到500ml的挡板瓶中，装液量为50ml，25℃恒温,200r/min培养72h，制得种子液；
所述种子培养基组成为：蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵1g/L、丁二酸2g/L、玉米浆1g/L、K2CO30.4g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、KH2PO41g/L、ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0。
（2）将所得种子液以10%（v/v）的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体OD600值对pH和溶氧进行调控：
第一阶段发酵：当菌体OD600＜0.7（种子干重小于15g/L）时，将溶氧降至55—65%，与搅拌串联，使溶氧维持至50-60%之间，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至6.0-7.0，促进菌体大量生长；
第二阶段发酵：当菌体OD600≥0.7（种子干重大于或等于15g/L）时，将溶氧降至30-35%之间，温度25℃，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至4.8-5.2之间，发酵96-120小时，促进菌体大量合成聚苹果酸；
所述盐酸浓度为3mol/L，氢氧化钠浓度为3mol/L；
（3）每隔8小时取样记录测定各项指标：pH、溶氧、菌体干重、发酵液残糖、聚苹果酸产量。
所述菌体干重测定：取发酵液2ml，加3mol/L盐酸除去残留的碳酸钙，5000rpm离心20min,去除上清液，菌体经蒸馏水洗涤离心2-3次，然后进行抽滤，80℃烘箱烘干称重，此质量乘以1000除以2即得粗干重，以g/L记。
所述的发酵液残糖测定：取发酵液5ml，15000rpm离心10min，取1ml上清液用蒸馏水稀释100倍，SBA-40E生物传感器检测发酵液残糖。
所述的聚苹果酸产量测定：取发酵液10ml，15000rpm离心10min，取上清液5ml加20ml无水甲醇进行醇沉，5000rpm离心20min，倒掉上清液，沉淀加5ml蒸馏水复溶，复溶后加蒸馏水定容至10ml，取5ml定容好的复溶液加5ml1mol/L硫酸水解过夜，水解液用流动相稀释10—20倍，至苹果酸浓度在1～10g/L，使用C18柱采用高效液相色谱法检测产量，以g/L记。
有益效果
本发明提供了一种生产聚苹果酸的方法，操作简单，效果明显，既缩短了发酵周期，又大大提高了聚苹果酸的生产效率；高密度发酵采用两阶段工艺,一方面可以减少菌体培养阶段的设备规模,节省大型发酵罐在发酵过程中的功率消耗和能量消耗,另一方面可以提高细胞培养和聚苹合成的生产强度,使生产过程达到节能降耗的目的。
具体实施方式
实施例1
（1）将出芽短梗霉（Aureobsidium pullulans）CGMCC.NO.3336菌株进行活化6—8h，即将其从蔗糖斜面培养基转接到500ml的挡板瓶中，装液量为50ml，25℃恒温,200r/min培养72h，制得种子液；
所述种子培养基组成为：蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵1g/L、丁二酸2g/L、玉米浆1g/L、K2CO30.4g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、KH2PO41g/L、ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0。
（2）将所得种子液以10%（v/v）的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体OD600值对pH和溶氧进行调控：
第一阶段发酵：当菌体OD600为0.67时，将溶氧降至55%，与搅拌串联，使溶氧维持在50%，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至7.0，促进菌体大量生长；
第二阶段发酵：当菌体OD600为0.7时，将溶氧降至30%，温度25℃，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至4.8，发酵96小时，促进菌体大量合成聚苹果酸；
所述盐酸浓度为3mol/L，氢氧化钠浓度为3mol/L；
经测定，菌体干重为：22.14g/L，聚苹果酸产量为：43.27g/L。
实施实例2
菌种的活化和种子液的制备同实施例1
（2）将所得种子液以10%（v/v）的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体OD600值对pH和溶氧进行调控：
第一阶段发酵：当菌体OD600为0.65时，将溶氧降至60%，与搅拌串联，使溶氧维持在55%，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至6.8，促进菌体大量生长；
第二阶段发酵：当菌体OD600为0.75时，将溶氧降至32%，温度25℃，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至5.0，发酵104小时，促进菌体大量合成聚苹果酸；
所述盐酸浓度为3mol/L，氢氧化钠浓度为3mol/L；
经测定，菌体干重为：25.38g/L，聚苹果酸产量为：45.79g/L。
实施实例3
菌种的活化和种子液的制备同实施例1
（2）将所得种子液以10%（v/v）的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体OD600值对pH和溶氧进行调控：
第一阶段发酵：当菌体OD600为0.63时，将溶氧降至62%，与搅拌串联，使溶氧维持在58%，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至6.0，促进菌体大量生长；
第二阶段发酵：当菌体OD600为0.72时，将溶氧降至35%，温度25℃，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至4.9，发酵112小时，促进菌体大量合成聚苹果酸；
所述盐酸浓度为3mol/L，氢氧化钠浓度为3mol/L；
经测定,菌体干重为：27.18g/L，聚苹果酸产量为：49.96g/L。
实施实例4
菌种的活化和种子液的制备同实施例1
（2）将所得种子液以10%（v/v）的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体OD600值对pH和溶氧进行调控：
第一阶段发酵：当菌体OD600为0.69时，将溶氧降至65%，与搅拌串联，使溶氧维持在60%，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至6.5，促进菌体大量生长；
第二阶段发酵：当菌体OD600为0.71时，将溶氧降至35%，温度25℃，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至5.2，发酵120小时，促进菌体大量合成聚苹果酸；
所述盐酸浓度为3mol/L，氢氧化钠浓度为3mol/L；
经测定，菌体干重为：24.94g/L，聚苹果酸产量为：46.75g/L。

Claims (5)

1.一种高密度发酵生产聚苹果酸的方法，通过两阶段调控pH和溶氧，第一阶段使菌体大量生长；第二阶段改变pH和溶氧，使聚苹果酸大量合成积累，具体包括如下步骤：
（1）将出菌株活化培养后，制得种子液；
（2）将所得种子液以10%（v/v）的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体OD600值对pH和溶氧进行调控：
第一阶段发酵：当菌体OD600＜0.7（种子干重小于15g/L）时，将溶氧降至55-65%，与搅拌串联，使溶氧维持至50-60%之间，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至6.0-7.0；
第二阶段发酵：当菌体OD600≥0.7（种子干重大于或等于15g/L）时，将溶氧降至30-35%之间，温度25℃，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至4.8-5.2之间，发酵96-120小时；
所述盐酸浓度为3mol/L，氢氧化钠浓度为3mol/L；
（3）每隔8小时取样记录测定各项指标：pH、溶氧、菌体干重、发酵液残糖、聚苹果酸产量。
2.如权利要求1所述的高密度发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于，所述种子培养基组成为：蔗糖140g/L、酵母膏3g/L、硫酸铵1g/L、丁二酸2g/L、玉米浆1g/L、K2CO30.4g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、KH2PO41g/L、ZnSO4·7H2O0.05g/L，其余为水，pH7.0。
3.如权利要求1所述的高密度发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于，将所得种子液以10%（v/v）的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体OD600值对pH和溶氧进行调控：
第一阶段发酵：当菌体OD600为0.63时，将溶氧降至62%，与搅拌串联，使溶氧维持在58%，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至6.0；
第二阶段发酵：当菌体OD600为0.72时，将溶氧降至35%，温度25℃，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至4.9，发酵112小时；
所述盐酸浓度为3mol/L，氢氧化钠浓度为3mol/L。
4.如权利要求1所述的高密度发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于，将所得种子液以10%（v/v）的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体OD600值对pH和溶氧进行调控：
第一阶段发酵：当菌体OD600为0.69时，将溶氧降至65%，与搅拌串联，使溶氧维持在60%，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至6.5；
第二阶段发酵：当菌体OD600为0.71时，将溶氧降至35%，温度25℃，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至5.2，发酵120小时；
所述盐酸浓度为3mol/L，氢氧化钠浓度为3mol/L。
5.如权利要求1所述的高密度发酵生产聚苹果酸的方法，其特征在于，将所得种子液以10%（v/v）的量接于5L发酵罐中进行发酵培养，根据菌体OD600值对pH和溶氧进行调控：
第一阶段发酵：当菌体OD600为0.65时，将溶氧降至60%，与搅拌串联，使溶氧维持在55%，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至6.8；
第二阶段发酵：当菌体OD600为0.75时，将溶氧降至32%，温度25℃，同时用盐酸和氢氧化钠调控pH至5.0，发酵104小时；
所述盐酸浓度为3mol/L，氢氧化钠浓度为3mol/L。
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