CN101696434A - β-聚苹果酸发酵新工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物发酵法生产β-聚苹果酸的新工艺。通过下述方案予以实现：在控制pH及溶解氧条件下，在含碳源、氮源、无机盐及微量元素的培养基中培养出芽短梗霉ipe-1；采用碱溶液控制发酵pH；调节通风量、罐压及搅拌速率控制溶解氧浓度。pH5.5-7.0，有机氮源与无机氮源复配使用，发酵前16h控制溶解氧浓度大于70％，之后控制溶解氧浓度10-80％适于大量积累β-聚苹果酸。
Description
技术领域
本发明的技术方案属于发酵工程技术领域，具体涉及采用碱溶液控制发酵pH，调节罐压、通风量及搅拌速率控制溶解氧浓度的发酵新工艺。
背景技术
1969年，研究圆弧青霉菌(Pencillium cyclopium)的微生物学家Shimada和Matsushima等首次在该菌的培养基中发现了聚苹果酸。1979年，Vert等首次合成了水溶性脂肪族聚酯——聚苹果酸，它以聚苹果酸为唯一单体。1989年，Fisher等从黏菌(Physarum Polycephalum)细胞中分离出聚苹果酸，并发现它是DNA聚合酶α的抑制剂。迄今为止，以Vert、Cammas、Kajiyama等为代表的国外学者已对聚苹果酸性能和应用做了较深入的研究。
聚苹果酸是一种特殊的脂肪族聚酯，以苹果酸为唯一单体、相互通过酯键联接而成。它是天然多聚物中新近开发的一种生物多聚物。与许多其它天然多聚物不同，聚苹果酸分子中有许多自由羧基和非对称碳原子，这些自由羧基赋予了它许多特别的性质，它除了具有良好的水溶性、可生物降解性、生物相容性和生物可吸收性之外，还具有两个显著的优点：(1)易代谢性。由于L-苹果酸是生物体内克雷伯氏三羧酸循环的中间体，β-聚苹果酸容易在生物体内通过正常的三羧酸循环代谢途径除去；(2)易修饰性。聚苹果酸具有悬挂羧基，容易与其它官能团反应而制得聚苹果酸衍生物，或引入功能基团或小分子药物，从而制得许多具有特殊功能的产物。因此，聚苹果酸及其衍生物可作为手术缝合线、组织工程支架材料、药物载体或原生药物、药物控制释放体系、食品包装材料、化妆品等，在生物医药、食品、化妆品等领域获得重要的应用。
目前国内外有关利用微生物发酵生产聚苹果酸的专利及文献非常少，已有的发酵生产或人工合成聚苹果酸(苹果酸聚合物)的专利有：1995年公开的日本专利“生产苹果酸聚合微生物的培养方法(JP7308188A2)”、1991年公开的日本专利“酶法生产L-苹果酸聚合物(JP4341189A2)”和1992年公开的日本专利“微生物合成L-苹果酸聚合物(JP4211385A2)”，这些专利着重描述了产聚苹果酸菌株的培养方法，及醇析获得聚苹果酸的方法；美国专利US4320753，主要是合成聚苹果酸和相应β-内酯的衍生物；中国专利CN101100687，公开了采用不同乙醇浓度醇析，同时获得普鲁兰和聚苹果酸的方法；中国专利CN101487034，公开了采用膜技术制备聚苹果酸及其盐的方法。而关于聚苹果酸应用的专利较多，如：US05811032、US05324519、US5702716等多达90余项。已有的发酵生产聚苹果酸(苹果酸聚合物)的文献有：Nagata(1993)用菌株Aureobasidium sp.A-91摇瓶发酵，丁二酸铵做氮源，CaCO3调节pH6.8发酵7d，获得聚苹果酸钙61g/L；Nakajima-k(1996)用非生长型细胞菌株Aureobasidium sp.A-91，磷酸缓冲液控制pH7.0，30℃，摇瓶发酵5d，获得聚苹果酸80g/L；刘双江(1997)用菌株Aureobasidiumpullulans 591.75，NaOH调节pH4.0，NaNO3做氮源，用发酵反应器发酵9天获得聚苹果酸9.8g/L；Holler(1999)用菌株Physarum polycephalum摇瓶发酵，1％蛋白胨做氮源，CaCO3调节pH5.5，摇瓶发酵6d，获得聚苹果酸钙2.7g/L。专利及文献聚苹果酸发酵工艺中关于溶解氧控制未有报道，pH调节存在较大差异，摇瓶发酵虽然产量较高，但不适宜规模化生产。
到目前为止，发酵法生产β-聚苹果酸没有大规模的应用，其主要原因是：没有适宜大规模生产β-聚苹果酸的发酵工艺，发酵周期过长，产率低，生产成本过高。
发明内容
本发明所解决的技术问题是：流加碱溶液精确控制发酵液pH，解决因碳酸钙调节pH造成的pH波动、溶氧传质困难及Ca离子易与其它培养基成份起反应造成沉淀的问题；采用有机氮源与无机氮源复配使用，解决菌体生长缓慢及发酵周期过长的问题；调节罐压、通气量及搅拌速率控制发酵过程溶解氧浓度。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：
1.β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：
将出芽短梗霉ipe-1经活化和种子培养后接种于发酵培养基中，在控制pH及溶解氧条件下，在含碳源、氮源、无机盐及微量元素的培养基中培养出芽短梗霉ipe-1；采用碱溶液控制发酵pH；调节通风量、罐压及搅拌速率控制溶解氧浓度。
说明：
(1)第1步所采用的活化培养基：马铃薯葡萄糖培养基，121℃灭菌15min；
(2)第1步所采用的发酵培养基(w/v)：8-15％ glucose，0.2％ NaNO3，0.01％KH2PO4，0.02％MgSO4·7H2O，0.05％KCl，0.1-2％有机氮源，pH 4.0～7.0，121℃灭菌15min；
(3)第1步菌种活化方法
将出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans ipe-1)采用活化培养基在20-28℃进行活化培养48-96小时；
(4)第1步采用的种子培养方法
将斜面上活化的种子培养物接种于发酵培养基中，在20-28℃，200r/min条件下振荡培养48-96h小时。
2.根据步骤1所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：发酵前16h控制溶解氧浓度大于70％，之后控制溶解氧浓度在10-80％。
3.根据步骤1所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：发酵过程使用有机氮源与无机氮源复配使用，提供微生物生长所需氮源。
4.根据步骤1所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：发酵过程采用碱溶液控制发酵pH5.5-7.0。
5.根据步骤2所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：发酵罐罐压在0.01-0.1Mpa，通风量在0.25-2.5vvm，搅拌速率根据所控制的溶解氧值进行调节。
6.根据步骤3所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：所采用的有机氮源为蛋白胨、酵母粉等，无机氮源为硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵等。
7.根据步骤4所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：所采用的碱溶液为氢氧化钠、碳酸钠、氨水、液氨或其复配溶液。
本发明与现有技术相比，有益效果是：第一，采用流加碱溶液精确控制发酵液pH值，避免用碳酸钙调节发酵液pH的波动及溶氧传质困难的问题；第二，添加适量的有机氮源促进菌体生产，解决菌体生长缓慢，发酵周期过长的问题；第三，调节罐压、通气量及搅拌速率控制溶解氧浓度，使菌体处于大量分泌β-聚苹果酸阶段。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，本发明所涉及的主题保护范围并非仅限于这些实施例。
实施例1
按如下步骤发酵生产β-聚苹果酸：
第一步，培养基配制
①活化培养基：马铃薯葡萄糖培养基，121℃灭菌15min；
②种子培养基的配制(w/v)：8％glucose，0.2％NaNO3，0.01％KH2PO4，0.02％MgSO4·7H2O，0.05％KCl，1g/l蛋白胨，pH 4.0～4.5，121℃灭菌15min。
③发酵培养基的配制(w/v)：8-15％glucose，0.2％NaNO3，0.01％KH2PO4，0.02％MgSO4·7H2O，0.05％KCl，121℃灭菌15min。
第二步，菌种活化
将4℃保存的出芽短梗霉菌株(Aureobasidium pullulans ipe-1)，转接于活化培养基斜面上，在25℃进行活化培养72小时。
第三步，种子培养
将斜面上活化的种子培养物接种于装100ml发酵培养基的500ml三角瓶中，在25℃，200r/min条件下振荡培养48小时。
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％的接种量接种于装4L发酵培养基的7L发酵罐中，pH5.5，温度25℃，转速600r/min，0.75vvm，溶解氧自然，培养7天。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为3.55g/L，菌体干重6.17g/l。
实施例2
按如下步骤发酵生产β-聚苹果酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％的接种量接种于装4L发酵培养基的7L发酵罐中，pH6.0，温度25℃，转速600r/min，0.75vvm，溶解氧自然，培养7天。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为7.50g/L，菌体干重8.38g/l。
实施例3
按如下步骤发酵生产β-聚苹果酸：
第一步，培养基配制
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％的接种量接种于装4L发酵培养基的7L发酵罐中，pH7.0，温度25℃，转速600r/min，0.75vvm，培养7天。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为2.64g/L，菌体干重7.08g/l。
实施例4
按如下步骤发酵生产β-聚苹果酸：
第一步，培养基配制
发酵培养基中添加1g/l蛋白胨，其他同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％的接种量接种于装4L发酵培养基的7L发酵罐中，pH6.0，温度25℃，转速300-700r/min，0.25-2.5vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，发酵前16h控制溶解氧浓度大于70％，之后控制溶解氧浓度在30％，培养7天。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为8.81g/L，菌体干重17.01g/l。
实施例5
按如下步骤发酵生产β-聚苹果酸：
第一步，培养基配制
发酵培养基中添加15g/l蛋白胨，葡萄糖为150g/l，其他同实施例1
同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％的接种量接种于装4L发酵培养基的7L发酵罐中，pH6.0，蛋白胨15g/l，温度25℃，转速300-800r/min，0.25-2.5vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，发酵前16h控制溶解氧浓度大于70％，之后控制溶解氧浓度在30％，培养4天。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为24.19g/L，菌体干重39.57g/l。
实施例6
按如下步骤发酵生产β-聚苹果酸：
第一步，培养基配制
发酵培养基中添加20g/l蛋白胨，葡萄糖为150g/l，其他同实施例1
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％的接种量接种于装4L发酵培养基的7L发酵罐中，pH6.0，蛋白胨20g/l，温度25℃，转速300-1000r/min，0.25-2.5vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，发酵前16h控制溶解氧浓度大于70％，之后控制溶解氧浓度在30％，培养4天。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为24.42g/L，菌体干重55.05g/l。
实施例7
按如下步骤发酵生产β-聚苹果酸：
第一步，培养基配制
同实施例6
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％的接种量接种于装4L发酵培养基的7L发酵罐中，pH6.0，蛋白胨15g/l，温度25℃，转速300-800r/min，0.25-2.5vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，发酵前16h控制溶解氧浓度大于70％，之后控制溶解氧浓度在10％，培养4天。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为24.71g/L，菌体干重41.6g/l。
实施例8
按如下步骤发酵生产β-聚苹果酸：
第一步，培养基配制
同实施例6
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％的接种量接种于装4L发酵培养基的7L发酵罐中，pH6.0，蛋白胨15g/l，温度25℃，转速300-1200r/min，0.25-2.5vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，发酵前16h控制溶解氧浓度大于70％，之后控制溶解氧浓度在40％，培养4天。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为22.78g/L，菌体干重44.24g/l。
实施例9
按如下步骤发酵生产β-聚苹果酸：
第一步，培养基配制
同实施例6
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％的接种量接种于装4L发酵培养基的7L发酵罐中，pH6.0，蛋白胨15g/l，温度25℃，转速300-1200r/min，0.25-2.5vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，发酵前16h控制溶解氧浓度大于70％，之后控制溶解氧浓度在70％，培养4天。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为35.17g/L，菌体干重54.96g/l。
实施例10
按如下步骤发酵生产β-聚苹果酸：
第一步，培养基配制
同实施例6
第二步，菌种活化
同实施例1
第三步，种子培养
同实施例1
第四步，接种发酵
将第三步制得的培养物以10％的接种量接种于装4L发酵培养基的7L发酵罐中，pH6.0，蛋白胨15g/l，温度25℃，转速300-1200r/min，0.25-2.5vvm，罐压在0.01-0.1Mpa，发酵前16h控制溶解氧浓度大于70％，之后控制溶解氧浓度在80％，培养4天。最后得发酵液中β-聚苹果酸含量为32.27g/L，菌体干重60.21g/l。
Claims (7)
1.β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：
将出芽短梗霉ipe-1经活化和种子培养后接种于发酵培养基中，在控制pH及溶解氧条件下，在含碳源、氮源、无机盐及微量元素的培养基中培养出芽短梗霉ipe-1；采用碱溶液控制发酵pH；调节通风量、罐压及搅拌速率控制溶解氧浓度。
2.根据权利要求1所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：发酵前16h控制溶解氧浓度大于70％，之后控制溶解氧浓度在10-80％。
3.根据权利要求1所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：发酵过程使用有机氮源与无机氮源复配使用，提供微生物生长所需氮源。
4.根据权利要求1所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：发酵过程采用碱溶液控制发酵pH5.5-7.0。
5.根据权利要求2所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：发酵罐罐压在0.01-0.1Mpa，通风量在0.25-2.5vvm，搅拌速率根据所控制的溶解氧值进行调节。
6.根据权利要求3所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：所采用的有机氮源为蛋白胨、酵母粉等，无机氮源为硝酸钠、硝酸铵、硫酸铵等。
7.根据权利要求4所述的β-聚苹果酸发酵新工艺，其特征在于：所采用的碱溶液为氢氧化钠、碳酸钠、氨水、液氨或其复配溶液。
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2009
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