CN103045662A - 一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基，属于生物发酵工程领域。所述发酵培养基由蔗糖，硝酸钠，磷酸二氢钾，氯化钾，硫酸锰，七水合硫酸镁，碳酸钙，硝酸铵，天门冬氨酸，亮氨酸，苏氨酸，缬氨酸，组氨酸，胞嘧啶，腺嘌呤，胆碱复配组成，通过氨基酸、胆碱和嘌呤嘧啶生长因子的优化复配，取代原半合成培养基中的蛋白胨，得到一种全新的合成培养基，可降低提取过程中脱色难度，发酵液中的β-聚苹果酸含量达到33-40g/L，纯度可达80-90％，同时也为以后的代谢组学研究奠定了坚实的实践基础。

Description

一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基

技术领域：

本发明属于生物发酵工程领域，具体涉及一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基。

背景技术：

目前，大部分合成高分子聚合物是石油化工产品，对人类生存环境及资源产生了深远的影响。随着国家对环境保护政策实施力度的逐年加强和人们对环境保护知识的积累，引起了传统的不可降解高分子聚合物生产的转变。因此，人们关注的重点是环境友好型的生物可降解高分子聚合物，这些高分子聚合物的生产有利于节约能源和资源，减缓温室效应；有利于发展生态协调的工艺过程和产品。

聚苹果酸(聚羟基丁二酸酯，Poly malic acid或Poly malate，简称为PMLA)是以苹果酸为唯一单体合成的均聚高分子聚合物。苹果酸是一种含有羟基的二羧酸，它是一种很好的食品添加剂，其水溶解性很强，在体内主要参与三羧酸(TCA)循环。聚合时通过其羟基和羧基酯化连接而成为高分子化合物。苹果酸含有两个羧基和一个羟基，其相互酯化的产物主要有三种，即α型、β型、γ型PMLA，唯一存在于人体内的只有β型PMLA(结构如下图)。

聚L-β-苹果酸的立体结构

聚苹果酸(聚羟基丁二酸酯)属于聚酯类聚合物，是完全生物降解高分子聚合物。生物降解性材料是指通过自然界微生物(细菌、真菌等)作用而发生降解的高分子物质。该种材料降解的产物无毒无害，不会对环境产生二次污染，近年来这种高分子材料的开发研究得到了飞速发展。在国外，有关聚苹果酸的研究开始于上世纪60年代，对于其性质、用途、合成方法都有一定的研究和报道，聚苹果酸主要应用于药物载体和微胶囊材料，其合成方法主要集中于化学合成，β型聚苹果酸已有商业产品。而国内还刚刚起步，对聚苹果酸的研究非常少，几乎为空白。因此加强聚苹果酸的研究，构建可降解生物高分子的一个研究的平台，具有重要的理论价值和应用价值。

目前国际上有关利用微生物发酵生产聚苹果酸的专利非常少，我国有关聚苹果酸的专利仅有11项，其中与聚苹果酸生物合成有关的专利8项(宋存江等“同时获得副产物普鲁兰糖的聚苹果酸的制备方法”申请号：200710058398；万印华等“β-聚苹果酸及其盐的制备方法”，申请号：200910078227.7；乔长晟等“一种酶法去除普鲁兰多糖提取获得β-聚苹果酸的方法”，申请号：200910068951.1；乔长晟等“一种大量产生β-聚苹果酸的诱变菌株出芽短梗霉TKPM00006及其培养方法”，申请号：200910071018.X)等，其余三项均为以聚苹果酸为原料的应用型专利。

利用微生物发酵生产β-聚苹果酸的方法中，大多需要加入部分有机氮源(如蛋白胨)以保证菌体的正常生长和β-聚苹果酸的合成。但利用有机氮源存在原料成本较高，后期提取困难，得到的β-聚苹果酸产量低、纯度不高等问题。因此，寻求更廉价、更简单的培养基成为必然之路。

发明内容：

本发明的目的是提供一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基。该培养基通过氨基酸、嘌呤、嘧啶的优化复配取代半合成培养基中的蛋白胨，利用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)发酵生产β-聚苹果酸可以有效解决发酵过程中原料成本高和提取过程中脱色困难的问题，显著提高了β-聚苹果酸的产量和纯度，降低了生产成本。

为了达到上述目的本发明技术方案如下：

所述的发酵培养基组成如下(g/L)：

蔗糖100～200，硝酸钠1～5，磷酸二氢钾0.05～0.15，氯化钾0.1～1.0，硫酸锰0.01～0.1，七水合硫酸镁0.1～1.0，碳酸钙10～50，硝酸铵10～20，天门冬氨酸0.1～0.5，亮氨酸0.1～1.0，苏氨酸0.1～0.5，缬氨酸0.1～1.0，组氨酸0.1～1.0，胞嘧啶0.001～0.01，腺嘌呤0.001～0.01，胆碱0.1～1.0，补足至1L的去离子水。

所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖150，NaNO₃ 2，KH₂PO₄ 0.1，KCl 0.4，MnSO₄ 0.05，MgSO₄·7H₂O 1.0，CaCO₃ 30，NH₄NO₃14.5，天门冬氨酸0.22，亮氨酸0.58，苏氨酸0.25，缬氨酸0.5，组氨酸1.0，胞嘧啶0.001，腺嘌呤0.0015，胆碱0.1，补足至1L的去离子水。

所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖160，NaNO₃ 5，KH₂PO₃ 0.15，KCl 0.5，MnSO₄ 0.08，MgSO₄·7H₂O 0.45，CaCO₃ 16，NH₄NO₃ 13.5，天门冬氨酸0.34，亮氨酸0.87，苏氨酸0.24，缬氨酸0.34，组氨酸0.3，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱1.0，补足至1L的去离子水。

所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖200，NaNO₃ l，KH₂PO₃ 0.07，KCl 0.7，MnSO₄ 0.10，MgSO₄·7H₂O 0.3，CaCO₃ 24，NH₄NO₃15.5，天门冬氨酸0.5，亮氨酸0.42，苏氨酸0.15，缬氨酸0.1，组氨酸0.5，胞嘧啶0.005，腺嘌呤0.0055，胆碱0.15，补足至1L的去离子水。

所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖180，NaNO₃ 3，KH₂PO₃ 0.1，KCl 0.8，MnSO₄ 0.15，MgSO₄·7H₂O 0.1，CaCO₃ 20，NH₄NO₃17.5，天门冬氨酸0.1，亮氨酸1.0，苏氨酸0.4，缬氨酸1.0，组氨酸0.2，胞嘧啶0.007，腺嘌呤0.01，胆碱0.5，补足至1L的去离子水。

所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖190，NaNO₃ 2，KH₂PO₄ 0.05，KCl 0.1，MnSO₄ 0.12，MgSO₄·7H₂O 0.5，CaCO₃ 50，NH₄NO₃20，天门冬氨酸0.34，亮氨酸0.1，苏氨酸0.5，缬氨酸0.72，组氨酸0.1，胞嘧啶0.0085，腺嘌呤0.007，胆碱0.4，补足至1L的去离子水。

所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖100，NaNO₃ 4，KH₂PO₃ 0.15，KCl 1.0，MnSO₄ 0.14，MgSO₄·7H₂O 0.7，CaCO₃ 35，NH₄NO₃ 10，天门冬氨酸0.22，亮氨酸0.87，苏氨酸0.1，缬氨酸0.2，组氨酸0.7，胞嘧啶0.01，腺嘌呤0.0035，胆碱0.7，补足至1L的去离子水。

本发明所用菌种来源：天津北洋百川生物技术有限公司，申请专利名称为一种惰性载体吸附固态发酵法生产β-聚苹果酸的方法，申请号：200910071171.2。该专利中公开了本发明所用菌种为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号CGMCC3337。

有益效果：

本发明的一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基，通过氨基酸、胆碱和嘌呤嘧啶生长因子的优化复配，取代原半合成培养基中的蛋白胨，得到一种全新的合成培养基，利用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)发酵生产β-聚苹果酸可以有效降低发酵原料成本和提取过程中脱色难度，其原料成本降低23％，最终的得到的β-聚苹果酸的纯度可达80-90％，与传统发酵方法50-60％的纯度相比提高30％，发酵液中的β-聚苹果酸含量达到33-40g/L，与传统发酵方法30g/L的含量相比提高1030％，同时也为以后的代谢组学研究奠定了坚实的实践基础。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明中的一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本实用新型的保护范围。

实施例1

1培养基的制备

(1)活化培养基(g/L)：上豆葡萄糖琼脂培养基(PDA)：土豆200，葡萄糖20，琼脂2，补足至1L的去离子水，pH自然，121℃高压蒸汽灭菌20min；

(2)种子培养基(g/L)：葡萄糖80，丁二酸2，碳酸钾0.5，KH₂PO₄ 1，MgSO₄·7H₂O 1，七水和硫酸锌0.5，玉米浆，CaCO₃ 20(单独灭菌)，补足至1L的去离子水，121℃高压蒸汽灭菌20min。

2.CGMCC3336菌种活化：菌种转接到PDA斜面培养基上，25℃活化培养3～5d。

3.种子液制备：选取生长良好的斜面种子用无菌生理盐水洗下孢子，制备孢子浓度约10⁶个/ml的孢子悬浮液，按10％(v/v)接种量接种装有100ml液体种子培养基的500ml三角瓶中，25℃，200r/m条件下培养2～3d，制得种子液。

4.发酵罐发酵：

(1)发酵培养基(g/L)：蔗糖150，NaNO₃ 2，KH₂PO₄ 0.1，KCl 0.4，MnSO₄ 0.05，MgSO₄·7H₂O1.0，CaCO₃ 30，NH₄NO₃ 14.5，天门冬氨酸0.22，亮氨酸0.58，苏氨酸0.25，缬氨酸0.5，组氨酸1.0，胞嘧啶0.001，腺嘌呤0.0015，胆碱0.1，补足至1L的去离子水。

(2)发酵条件：30L发酵罐装发酵液量为15L，按上述发酵培养基所示的配方配制发酵培养基，种子液的接种量为10％(v/v)，发酵温度25℃，发酵时间160小时，通风量1.0vvm，溶氧0.8mg/L，转速300-600rpm；发酵结束后经检测β-聚苹果酸的含量为35g/L，纯度为86％。

实施例2

菌种的活化和种子液的制备同实施例1

3.发酵罐发酵：

(1)发酵培养基(g/L)：蔗糖160，NaNO₃ 5，KH₂PO₃ 0.15，KCl 0.5，MnSO₄ 0.08，MgSO₄·7H₂O0.45，CaCO₃ 16，NH₄NO₃ 13.5，天门冬氨酸0.34，亮氨酸0.87，苏氨酸0.24，缬氨酸0.34，组氨酸0.3，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱1.0，补足至1L的去离子水。

(2)发酵条件同实例1发酵结束后经检测β-聚苹果酸的含量为33g/L，纯度为83％。

实施例3

菌种的活化和种子液的制备同实施例1

3.发酵罐发酵：

(1)发酵培养基(g/L)：蔗糖200，NaNO₃ 1，KH₂PO₃ 0.07，KCl 0.7，MnSO₄ 0.10，MgSO₄·7H₂O 0.3，CaCO₃ 24，NH₄NO₃ 15.5，天门冬氨酸0.5，亮氨酸0.42，苏氨酸0.15，缬氨酸0.1，组氨酸0.5，胞嘧啶0.005，腺嘌呤0.0055，胆碱0.15，，补足至1L的去离子水。

(2)发酵条件同实例1发酵结束后经检测β-聚苹果酸的含量为40g/L，纯度为90％。

实施例4

菌种的活化和种子液的制备同实施例1

3.发酵罐发酵：

(1)发酵培养基(g/L)：蔗糖180，NaNO₃ 3，KH₂PO₃ 0.1，KCl 0.8，MnSO₄ 0.15，MgSO₄·7H₂O0.1，CaCO₃ 20，NH₄NO₃ 17.5，天门冬氨酸0.1，亮氨酸1.0，苏氨酸0.4，缬氨酸1.0，组氨酸0.2，胞嘧啶0.007，腺嘌呤0.01，胆碱0.5，，补足至1L的去离子水。

(2)发酵条件同实例1发酵结束后经检测β-聚苹果酸的含量为38g/L，纯度为88％。

实施例5

菌种的活化和种子液的制备同实施例1

3.发酵罐发酵：

(1)发酵培养基：蔗糖190，NaNO₃ 2，KH₂PO₄ 0.05，KCl 0.1，MnSO₄ 0.12，MgSO₄·7H₂O0.5，CaCO₃ 50，NH₄NO₃ 20，天门冬氨酸0.34，亮氨酸0.1，苏氨酸0.5，缬氨酸0.72，组氨酸0.1，胞嘧啶0.0085，腺嘌呤0.007，胆碱0.4，补足至1L的去离子水。

(2)发酵条件同实例l发酵结束后经检测β-聚苹果酸的含量为36g/L，纯度为88％。

实施例6

菌种的活化和种子液的制备同实施例1

3.发酵罐发酵：

(1)发酵培养基(g/L)：蔗糖100，NaNO₃ 4，KH₂PO₃ 0.15，KCl 1.0，MnSO₄0.14，MgSO₄·7H₂O0.7，CaCO₃ 35，NH₄NO₃ 10，天门冬氨酸0.22，亮氨酸0.87，苏氨酸0.1，缬氨酸0.2，组氨酸0.7，胞嘧啶0.01，腺嘌呤0.0035，胆碱0.7，补足至1L的去离子水。

(2)发酵条件同实例1发酵结束后经检测β-聚苹果酸的含量为37g/L，纯度为89％。

Claims (7)

1.一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基组成如下(g/L)：

蔗糖100～200，硝酸钠1～5，磷酸二氢钾0.05～0.15，氯化钾0.1～1.0，硫酸锰0.01～0.1，七水合硫酸镁0.1～1.0，碳酸钙10～50，硝酸铵10～20，天门冬氨酸0.1～0.5，亮氨酸0.1～1.0，苏氨酸0.1～0.5，缬氨酸0.1～1.0，组氨酸0.1～1.0，胞嘧啶0.001～0.01，腺嘌呤0.001～0.01，胆碱0.1～1.0，补足至1L的去离子水。

2.根据权利要求1所述的一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖150，NaNO₃ 2，KH₂PO₄ 0.1，KCl 0.4，MnSO₄ 0.05，MgSO₄·7H₂O 1.0，CaCO₃ 30，NH₄NO₃ 14.5，天门冬氨酸0.22，亮氨酸0.58，苏氨酸0.25，缬氨酸0.5，组氨酸1.0，胞嘧啶0.001，腺嘌呤0.0015，胆碱0.1，补足至1L的去离子水。

3.根据权利要求1所述的一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖160，NaNO₃ 5，KH₂PO₃ 0.15，KCl 0.5，MnSO₄ 0.08，MgSO₄·7H₂O 0.45，CaCO₃ 16，NH₄NO₃13.5，天门冬氨酸0.34，亮氨酸0.87，苏氨酸0.24，缬氨酸0.34，组氨酸0.3，胞嘧啶0.0015，腺嘌呤0.001，胆碱1.0，补足至1L的去离子水。

4.根据权利要求1所述的一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖200，NaNO₃ 1，KH₂PO₃ 0.07，KCl 0.7，MnSO₄ 0.10，MgSO₄·7H₂O 0.3，CaCO₃ 24，NH₄NO₃ 15.5，天门冬氨酸0.5，亮氨酸0.42，苏氨酸0.15，缬氨酸0.1，组氨酸0.5，胞嘧啶0.005，腺嘌呤0.0055，胆碱0.15，补足至1L的去离子水。

5.根据权利要求1所述的一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖180，NaNO₃ 3，KH₂PO₃ 0.1，KCl 0.8，MnSO₄ 0.15，MgSO₄·7H₂O 0.1，CaCO₃ 20，NH₄NO₃ 17.5，天门冬氨酸0.1，亮氨酸1.0，苏氨酸0.4，缬氨酸1.0，组氨酸0.2，胞嘧啶0.007，腺嘌呤0.01，胆碱0.5，补足至1L的去离子水。

6.根据权利要求1所述的一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖190，NaNO₃ 2，KH₂PO₄ 0.05，KCl 0.1，MnSO₄ 0.12，MgSO₄·7H₂O 0.5，CaCO₃ 50，NH₄NO₃ 20，天门冬氨酸0.34，亮氨酸0.1，苏氨酸0.5，缬氨酸0.72，组氨酸0.1，胞嘧啶0.0085，腺嘌呤0.007，胆碱0.4，补足至1L的去离子水。

7.根据权利要求1所述的一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基，其特征在于：所述发酵培养基组成较佳地为(g/L)：

蔗糖100，NaNO₃ 4，KH₂PO₃ 0.15，KCl 1.0，MnSO₄ 0.14，MgSO₄·7H₂O 0.7，CaCO₃ 35，NH₄NO₃ 10，天门冬氨酸0.22，亮氨酸0.87，苏氨酸0.1，缬氨酸0.2，组氨酸0.7，胞嘧啶0.01，腺嘌呤0.0035，胆碱0.7，补足至1L的去离子水。