CN109504714B - 一种无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯的方法 - Google Patents

一种无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN109504714B
CN109504714B CN201710832790.3A CN201710832790A CN109504714B CN 109504714 B CN109504714 B CN 109504714B CN 201710832790 A CN201710832790 A CN 201710832790A CN 109504714 B CN109504714 B CN 109504714B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fermentation
initial
feeding
fed
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710832790.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109504714A (zh
Inventor
叶健文
汪东升
陈风义
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Blue Crystal Microbial Technology Co ltd
Original Assignee
Bluepha Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bluepha Co ltd filed Critical Bluepha Co ltd
Priority to CN201710832790.3A priority Critical patent/CN109504714B/zh
Publication of CN109504714A publication Critical patent/CN109504714A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109504714B publication Critical patent/CN109504714B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种以嗜盐菌无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将嗜盐菌接入发酵培养基中进行发酵培养；(2)发酵进入对数期后，通过补加第一补料培养基进行第一阶段补料发酵；(3)第一阶段补料发酵结束后，通过补加第二补料培养基进行第二阶段补料发酵；(4)第二阶段补料发酵结束后，通过补加第三补料培养基进行第三阶段补料发酵直至发酵结束，其中，在以上步骤(2)中的第一补料培养基和步骤(3)中的第二补料培养基包含碳源和氮源，在以上步骤(4)中的第三补料培养基仅包含碳源，并且在以上步骤(3)的第二补料培养基中的氮源含量低于在以上步骤(2)的第一补料培养基中的氮源含量。

Description

一种无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种以嗜盐菌无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法。
背景技术
上世纪以来建立在煤炭和石油等化石原料基础上发展起来的现代工业给人类带来了前所未有的发展和繁荣，但是也对环境造成了极大的破坏和污染。以塑料为例，塑料是人类在石油化工产业基础上，发明的一种前所未有的新材料，给人们的生活带来极大的便利性。但是紧接着出现新的问题，我们现有的以石油为原料的塑料制品在自然界完全不能降解，给土壤造成了严重的污染。因此人们一直在寻求使用可降解材料来代替传统塑料，聚羟基脂肪酸酯就是其中之一。
聚羟基脂肪酸酯是微生物在其他营养(氮、磷等)受限且碳源过剩的情况下合成的一类碳源和能源的贮藏性物质，是一种生物线性高分子聚酯，具有良好的生物相容性和可降解性。PHA的结构通式如下式所示，其单体均为R构型，侧链R基团不同，导致构成PHA的单体不同。根据侧链R基的不同，PHA可分为短链(SCL PHA)和长链两种(MCL PHA)，短链PHA主要由3C到5C单体构成，聚3羟基丁酸酯(PHB)、聚3羟基丁酸4羟基丁酸酯(P3HB4HB)、聚3羟基丁酸3羟基戊酸酯(PHBV)、聚4-羟基丁酸酯(P4HB)都属于短链PHA，长链PHA由6C以上的单体构成。
Figure BDA0001409101000000021
PHA单体构成不同，或者单体之间排列顺序不一致，也会表现出不同的材料学性质，进而表现出不同的应用范围。PHA具有与传统塑料非常相似的材料学性质，在很多场合可以代替传统的聚乙烯和聚丙烯材料，其优良的生物可降解性和生物相容性使其在药物缓释载体、医用植入材料、农用地膜等领域有很大的应用潜力。
常见的短链PHA生产菌为罗氏真氧杆菌和大肠杆菌，其中罗氏真氧杆菌可以天然生产PHB和PHBV等短链PHA，目前利用该菌生产PHB，菌体生物量可以达到281g/L，这也是目前为止产PHA菌种的最大生物量，生产PHBV，生物量可达200g/L，利用基因工程改造的大肠杆菌可以合成PHB、PHBV及其他短链及中长链PHA。虽然以上述两种菌株可以达到较高的生物量和PHA产量，但是PHA的生产成本依然很高，严重制约了PHA的发展和推广。
目前PHA塑料的价格是普通聚乙烯和聚丙烯塑料价格的5-6倍，PHA的发展急需冲破成本障碍。目前PHA生产过程中，影响成本的主要有以下几个环节，分别是蒸汽能耗、电耗、底物成本和菌种的生产强度和转化效率，可以说要想真正意义上降低成本，就必须降低以上一个或者几个成本。
采用传统的微生物已经很难降低PHA的生产成本，筛选具有特殊能力的微生物，比如耐高温、耐盐碱的菌株，在开放无灭菌的条件下积累PHA已经成为PHA未来发展的趋势，利用先进的合成生物学技术，在优良底盘菌的基础上构建生产不同类型PHA的工程菌株，正在加速PHA的工业化。
发明内容
技术目的
本发明的目的是提供一种以嗜盐菌为生产菌通过发酵法生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的节能经济的方法。
技术方案
本发明提供一种以嗜盐菌为生产菌无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将嗜盐菌接入发酵培养基中进行发酵培养；
(2)发酵进入对数期后，通过补加第一补料培养基进行第一阶段补料发酵；
(3)第一阶段补料发酵结束后，通过补加第二补料培养基进行第二阶段补料发酵；
(4)第二阶段补料发酵结束后，通过补加第三补料培养基进行第三阶段补料发酵直至发酵结束，
其中，在以上步骤(2)中的第一补料培养基和步骤(3)中的第二补料培养基包含碳源和氮源，在以上步骤(4)中的第三补料培养基仅包含碳源，并且在以上步骤(3)的第二补料培养基中的氮源含量低于在以上步骤(2)的第一补料培养基中的氮源含量。
本发明的方法中，优选地，所述嗜盐菌可为盐单胞菌(halomonas)，更优选halomonas TD 01或halomonas TD 40。其中，所述halomonas TD 40是以halomonas TD 01为底盘菌经合成生物学技术改造而具有合成P3HB4HB能力的重组菌株。
本发明的方法中，halomonas TD01合成产物为PHB，halomonas TD40在添加前体的条件下合成P3HB4HB，所述PHB的合成不需要添加前体物质， 直接通过碳源合成；所述P3HB4HB的合成前体可为4-羟基丁酸、γ-丁内酯、1,4-丁二醇，优选为γ-丁内酯。
具体地，所述“无灭菌”是指所述发酵培养基及其发酵容器不经过灭菌处理。
具体地，在上述方法中，在步骤(1)中发酵的初始温度可为20℃-45℃，优选为25℃-45℃，更优选为30℃-40℃；发酵体系的初始pH可为5.0-11.0，更优选为7.0-11.0，更优选为7.0-10.0，最优选为7.0-9.0；发酵体系的初始溶氧可为0％-100％，优选为10％-80％，更优选为30％-60％。
具体地，在上述方法中，所述步骤(1)中的发酵培养时间可为2h-12h，优选为4-12h，更优选为6-10h；所述步骤(2)中的发酵培养时间可为2h-36h，优选为4h-24h，更优选为6h-20h；所述步骤(3)中的发酵培养时间可为2h-12h，优选为4h-12h；所述步骤(4)中的发酵培养时间可为2h-30h，优选为4h-24h。
具体地，在上述方法的步骤(2)至(4)中，所述第一至第三补料培养基的碳源可为选自葡萄糖、蔗糖、葡萄糖酸钠中的一种或多种；在上述方法的步骤(2)和(3)中，所述第一和第二补料培养基的氮源可为选自氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、尿素中的一种或多种。
具体地，在上述方法的步骤(2)至(4)中，所述碳源或氮源的补加方式可为连续流加补料或间歇补料；
具体地，在上述方法的步骤(2)至(4)中，所述碳源或氮源的补料方式可为选自混合补加、分开补加、相同速率补加、不同速率补加中的一种或多种。
具体地，在上述方法的步骤(2)至(4)中，补料过程控制糖浓度可为0-30g/L，优选为0-20g/L，更优选为3-20g/L，最优选5-20g/L。
具体地，在上述方法的步骤(2)中，所述第一补料培养基中碳源与初始发酵体系的重量:体积配比为50-200g:1L，优选为80-150g:1L，所述第一补 料培养基中氮源与初始发酵体系的重量:体积配比为1-8g:1L，优选为2-6g:1L。
具体地，在上述方法的步骤(3)中，所述第二补料培养基中碳源与初始发酵体系的重量:体积配比为50-150g:1L，优选为50-80g:1L，所述第二补料培养基中氮源与初始发酵体系的重量:体积配比为0-5g:1L，优选为0.1-2g:1L。
具体地，在上述方法的步骤(4)中，所述第三补料培养基中碳源与初始发酵体系的重量:体积配比为50-200g:1L，优选为80-150g:1L。
具体地，在上述方法中，所述步骤(1)中的发酵培养基配方可为：
氯化钠20-200g/L，葡萄糖5g-100g/L，玉米浆粉0g-50g/L，尿素0g-20g/L，硫酸镁0.1-5g/L，磷酸二氢钾0.5g-10g/L，微量元素母液I1mL-30mL/L和微量元素母液II 0.1mL-10mL/L。
微量元素母液I：柠檬酸铁铵2g/L-10g/L，二水合氯化钙1g/L-5g/L，用0.5mol/L盐酸水溶液溶解。
微量元素母液II：七水合硫酸锌50mg/L-200mg/L，四水合氯化锰10mg/L-50mg/L，硼酸100mg/L-500mg/L，六水合氯化钴50mg/L-400mg/L，五水合硫酸铜3mg/L-30mg/L，六水合氯化镍5mg/L-50mg/L，二水合钼酸钠10mg/L-50mg/L，用0.5mol/L盐酸水溶液溶解。
具体地，在上述方法中，在P3HB4HB的生产过程中，γ-丁内酯的添加量可为5-30g/L，优选为8-24g/L，更优选为12-20g/L；γ-丁内酯的补加时间可为6h-30h，优选为8h-26h，更优选为12h-22h；γ-丁内酯的补加方式可为间歇补加或连续流加，优选为间歇补加方式。
有益效果
本发明利用嗜盐菌及其基因工程菌株制备PHA或P3HB4HB等的方法均不同程度的降低了生产成本，提高了PHA的产量，且得到的PHA的分 子量可达500kDa以上，具有工业应用价值。具体来讲，本发明的方法具有以下技术效果：
1、本发明中盐单胞菌(例如，halomonas TD01)能够以葡萄糖为碳源，尿素为氮源高效低成本地合成PHB。
2、本发明中盐单胞菌的衍生菌株(例如，halomonas TD40)能够在以葡萄糖为碳源的发酵体系中，通过补加γ-丁内酯大量积累P3HB4HB。
3、对于嗜盐菌而言，高盐浓度是生长所必须的，同时halomonas TD01生长还依赖较高的pH值，而高盐及高碱的生产培养基能抑制其他非嗜盐菌的生长，因此使得无灭菌生产工艺成为可能，降低灭菌过程的能耗，最大限度地减少对微生物生长培养基的损害，从而从很大程度上降低成本。
4、由于嗜盐菌生活在高盐环境中，所以菌体遇水破裂，发酵结束后脱盐直接加水(加少量表面活性剂)就能释放出PHA颗粒，避免了繁琐昂贵的传统PHA提取过程；生产培养基中的盐在发酵结束后被回收，可重复利用，降低了用水量和废水量，降低成本。
综上所述，本发明中PHA的生产方法对PHA的高效稳定的发酵及低成本发酵具有重要意义，具有良好的工业化前景。
附图说明
图1为halomonas TD01在7.5L发酵罐中无灭菌条件下发酵生产PHB的过程中生物量随时间变化示意图；
图2为halomonas TD40在7.5L发酵罐中无灭菌条件下发酵生产P3HB4HB的过程中生物量随时间变化示意图；
图3为halomonas TD40在1m3发酵罐中无灭菌条件下发酵生产P3HB4HB的过程中生物量随时间变化示意图；
图4为halomonas TD40在5m3发酵罐中无灭菌条件下发酵生产 P3HB4HB的过程中生物量随时间变化示意图。
具体实施方式
实施例1盐单胞菌(halomonas TD01)在7.5L发酵罐中生产PHB
菌种培养
1、菌种活化：将保存于-80℃冰箱的盐单胞菌(halomonas TD01)[保藏编号：CGMCCNo.4353，已在专利申请(专利公告号：CN102120973B)中授权]甘油管在60LB固体平板培养基上划线分离单克隆，37℃培养箱中培养18-24h。
2、一级种子：从活化好的halomonas TD01平板上接单菌落于装有20mL60LB的100mL摇瓶中，温度37℃，转速200rpm的摇床中培养12h。
3、二级种子：一级种子液按照1％的接种量接种于装有100mL 60LB的500mL摇瓶中，温度37℃，转速200rpm的摇床中培养10-12h。
60LB培养基成分：氯化钠60g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，平板培养基加琼脂20g/L。
发酵培养
按10％的接种量将二级种子液接入到优化后的发酵培养基中，7.5L发酵罐初始装液3L，发酵体系不灭菌直接发酵。控制温度37℃，初始溶氧控制在30％-50％，通过调节转速和通气来控制溶氧，最大转速800rpm，最大通风量1.5vvm，转速和通气达到最大后，不控制溶氧；发酵过程中通过补料控制糖浓度在5-20g/L之间；用5M NaOH控制发酵pH为8.5。
发酵培养基配方如下：
氯化钠40g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆粉10g/L，尿素2g/L，硫酸镁0.2g/L，磷酸二氢钾4.2g/L，微量元素母液I 10mL/L、微量元素母液II 1mL/L。
1L微量元素母液I：将5g柠檬酸铁铵和2g二水合氯化钙与0.5mol/L盐 酸水溶液混合，待完全溶解后用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升。
1L微量元素母液II：将七水硫酸锌100mg，四水氯化锰30mg，硼酸300mg，六水氯化钴200mg/L，五水硫酸铜10mg，六水氯化镍20mg，二水合钼酸钠30mg与0.5mol/L盐酸水溶液混合，待完全溶解后用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升。
发酵6h开始流加补料，流加速度随耗糖速度调整，保持发酵液残糖浓度为5-20g/L之间。补料分为3个阶段，6-18h为第一阶段，在此阶段内，补料培养基中添加足量的尿素，保证生物量的快速积累；18-30h为第二阶段，在此阶段内，降低补料培养基中的尿素，保证菌体从生物量的积累向PHA积累过渡；30h-48h为第三阶段，在此阶段内，只补碳源，不补氮源，促进PHA的大量积累。
补料培养基配方如下：
第一补料阶段：葡萄糖320g，尿素5g，用200mL自来水完全溶解；
第二补料阶段：葡萄糖150g，尿素1.5g，用100mL自来水完全溶解；
第三补料阶段：葡萄糖300g，用200mL自来水完全溶解。
细胞干重测定
发酵过程中每隔1h取样测定残糖，每隔2h取样测定600nm处的吸光度，每隔4h取35mL发酵液10000rpm离心10min收集菌体，用去离子水洗涤离心2次，真空冷冻干燥，冰干后菌体称重计算细胞干重(DCW)。
PHB含量测定
取30-40mg冰干后菌体进行酯化反应，气相色谱法(GC)测定PHB含量。
酯化方法为：取30-40mg冰干菌体于酯化管中，加入2mL氯仿、2mL酯化液混匀，加盖密闭，100℃金属浴中酯化4小时。冷却至室温后，加入1mL蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层。待氯仿相与水完全分离后，取氯仿 相进行气相色谱分析。
1升酯化液配置方法：1g苯甲酸、30mL浓硫酸溶于970mL甲醇，得到酯化液。
同时取20-25mg的PHB标样进行酯化反应作为空白对照。
气相色谱(GC)分析：依照岛津公司GC-2014型气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。色谱条件：设定柱头温度为140℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25Mpa，程序升温条件为：140℃1分钟，以20℃/分的速度升温至220℃，并在此温度保持1分钟。AOC-20S型自动进样器进样，以丙酮为洗涤液，在每次进样前洗涤3次，再用待测样品润洗。
测定结果
图1显示halomonas TD01在7.5L发酵罐中无灭菌条件下发酵生产PHB的过程中生物量随时间变化。在发酵培养48h之后，菌体细胞干重(DCW)达到83g/L，OD600达到380，PHB含量达到细胞干重的80％。
实施例2盐单胞菌(halomonas TD40)在7.5L发酵体系中生产P3HB4HB
盐单胞菌(halomonas TD40)是在野生菌halomonas TD01基础上通过合成生物学技术方法，把4-羟基丁酰CoA转移酶基因导入到TD01的基因组上，使其具有合成P3HB4HB的能力。
菌种培养
1、菌种活化：将保存于-80℃冰箱的halomonas TD40(该菌种已在以下非专利文献中公开：Chen,X.,Yin,J.,Ye,J.,Zhang,H.,Che,X.,Ma,Y.,Li,M.,Wu,L-P.,Chen,G-Q.,Engineering Halomonas bluephagenesis TD01for Non-sterile Production of Poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate),Bioresource Technology(2017)，并由北京蓝晶微生物科技有限公司提供)甘油管在60LB固体平板培养基上划线分离单克隆，37℃培养箱中培养18-24h。
2、一级种子：从活化好的halomonas TD40平板上接单菌落于60LB液体培养基中，100mL摇瓶装液20mL，温度37℃，转速200rpm的摇床中培养12h。
3、二级种子：一级种子液按照1％的接种量接种于装有100mL 60LB的500mL摇瓶中，温度37℃，转速200rpm的摇床中培养10-12h。
60LB培养基成分：氯化钠60g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，平板培养基加琼脂20g/L。
发酵培养
按10％的接种量将二级种子液接入到优化后的发酵培养基中，7.5L发酵罐初始装液3L，发酵体系不灭菌直接发酵。控制温度37℃，初始溶氧控制在30％-50％，通过调节转速和通气来控制溶氧，最大转速800rpm，最大通风量1vvm，转速和通气达到最大后，不控制溶氧；发酵过程中通过补料控制糖浓度在5-20g/L之间；用5M NaOH控制发酵pH为8.5。
发酵培养基配方如下：
氯化钠60g/L，葡萄糖20g/L，玉米浆粉15g/L，尿素2g/L，硫酸镁0.2g/L、磷酸二氢钾5g/L，微量元素母液I 10mL/L，微量元素母液II 2mL/L。
1L微量元素母液I：将5g柠檬酸铁铵和2g二水合氯化钙与0.5mol/L盐酸水溶液混合，待完全溶解后用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升。
1L微量元素母液II：将七水硫酸锌100mg，四水氯化锰30mg，硼酸300mg，六水氯化钴200mg/L，五水硫酸铜10mg，六水氯化镍20mg，二水合钼酸钠30mg与0.5mol/L盐酸水溶液混合，待完全溶解后用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升。
发酵6h开始流加补料，流加速度随耗糖速度调整，保持发酵液残糖浓度为5-20g/L之间。补料分为3个阶段，6-18h为第一阶段，在此阶段内，补料培养基中添加足量的尿素，保证生物量的快速积累；18-30h为第二阶段，在 此阶段内，降低补料培养基中的尿素，保证菌体从生物量的积累向PHA积累过渡；30h-48h为第三阶段，在此阶段内，只补碳源，不补氮源，促进PHA的大量积累。
补料培养基配方如下：
第一补料阶段：葡萄糖320g，尿素8g，用200mL自来水完全溶解；
第二补料阶段：葡萄糖150g，尿素3g，用100mL自来水完全溶解；
第三补料阶段：葡萄糖300g，用200mL自来水完全溶解。
γ-丁内酯补加方式：
发酵20h开始补加γ-丁内酯，初始添加量为3g/L，第二补料阶段补入6g/L，第三补料阶段补入6g/L。
细胞干重测定
发酵过程中每隔1h取样测定残糖，每隔2h取样测定600nm处的吸光度，每隔4h取35mL发酵液10000rpm离心10min收集菌体，用去离子水洗涤离心2次，真空冷冻干燥，冰干后菌体称重计算细胞干重(DCW)。
P3HB4HB含量测定
取30-40mg冰干后菌体进行酯化反应，气相色谱法(GC)测定P3HB4HB含量。
酯化方法为：取30-40mg冰干菌体于酯化管中，加入2mL氯仿、2mL酯化液混匀，加盖密闭，100℃金属浴中酯化4小时。冷却至室温后，加入1mL蒸馏水，充分振荡混匀，静置分层。待氯仿相与水完全分离后，取氯仿相进行气相色谱分析。
1升酯化液配置方法：1g苯甲酸、30mL浓硫酸溶于970mL甲醇，得到酯化液。
同时取20-25mg的PHB标样进行酯化反应作为空白对照。
同时取10-20μL的γ-丁内酯进行酯化反应作为空白对照。
气相色谱(GC)分析：依照岛津公司GC-2014型气相色谱仪的说明书操作气相色谱仪。色谱条件：设定柱头温度为140℃，进样器温度为200℃，检测器温度为220℃，柱头压力为0.25Mpa，程序升温条件为：140℃1分钟，以20℃/分的速度升温至220℃，并在此温度保持1分钟。AOC-20S型自动进样器进样，以丙酮为洗涤液，在每次进样前洗涤3次，再用待测样品润洗。
测定结果
图2显示halomonas TD40在7.5L发酵罐中无灭菌条件下发酵生产P3HB4HB的过程中生物量随时间变化。在发酵培养48h之后，菌体细胞干重(DCW)达到75g/L，OD600达到360，P3HB4HB含量达到细胞干重的75％。
实施例3盐单胞菌(halomonas TD40)在1m3发酵罐中生产P3HB4HB
菌种培养
1、菌种活化：将保存于-80℃冰箱的盐单胞菌(halomonas TD40)甘油管在60LB固体平板培养基上划线分离单克隆，37℃培养箱中培养18-24h。
2、一级种子：从活化好的盐单胞菌(halomonas TD40)平板上接单菌落于装有20mL60LB的100mL摇瓶中，温度37℃，转速200rpm的摇床中培养12h。
3、二级种子：一级种子液按照1％的接种量接种于装有400mL 60LB的2L摇瓶中，温度37℃，转速200rpm的摇床中培养10-12h。
4、三级种子：二级种子液按照2％的接种量接入到100L发酵罐中，发酵罐初始装液量60L，温度37℃，pH 8.5，通气量1vvm，初始转速100rpm，溶氧降到30％以下调转速，最大转速280rpm。三级种子培养8-10h。
60LB培养基成分：氯化钠60g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，平板培养基加琼脂20g/L。
三级种子培养基成分：氯化钠60g/L，葡萄糖20g/L，玉米浆液70mL/L，尿素4g/L，硫酸镁0.4g/L，磷酸二氢钾6g/L，微量元素母液I 10mL/L、微量元素母液II 10mL/L。
发酵培养
按10％的接种量将三级种子液接入到优化后的发酵培养基中，1000L发酵罐初始装液600L，发酵体系不灭菌直接发酵。温度37℃，通气量1vvm，罐压0.05MPa，初始转速100rpm，溶氧低于30％后手动调节转速，最大转速280rpm；转速和通气达到最大，不控制溶氧。发酵过程中通过间歇补料的方式控制葡萄糖浓度为5-20g/L之间；5M NaOH自动调节pH为8.5。
发酵培养基配方如下：
氯化钠30g/L，葡萄糖30g/L，玉米浆液50mL/L，尿素2g/L，硫酸镁0.8g/L，磷酸二氢钾4g/L，微量元素母液I 10mL/L，微量元素母液II 10mL/L。
微量元素母液I：将5g柠檬酸铁铵和2g二水合氯化钙与0.5mol/L盐酸水溶液混合，待完全溶解后用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升。
微量元素母液II：将ZnSO4·7H2O 100mg，MnCl2·4H2O 30mg，H3BO3300mg，CoCl2·6H2O 200mg/L，CuSO4·5H2O 10mg，NiCl2·6H2O 20mg，NaMoO4·2H2O 30mg与0.5mol/L盐酸水溶液混合，待完全溶解后用0.5mol/L盐酸水溶液补足至1升。
发酵5h开始间歇补料，补加速度随耗糖速度调整，保持发酵液残糖浓度为5-20g/L之间，残糖降至5g/L左右时，开始补料。补料分为3个阶段，5-13h为第一阶段，在此阶段内，补料培养基中添加足量的尿素，保证生物量的快速积累；13-21h为第二阶段，在此阶段内，降低补料培养基中的尿素，保证菌体从生物量的积累向PHA积累过渡；21h-36h为第三阶段，在此阶段内，进一步降低氮源添加量进PHA的大量积累。
补料培养基配方如下：
第一补料阶段：葡萄糖50kg，尿素2kg，用31L自来水完全溶解；
第二补料阶段：葡萄糖40kg，尿素1.0kg，用25L自来水完全溶解；
第三补料阶段：葡萄糖60kg，用37.5L自来水完全溶解。
γ-丁内酯补加方式：
发酵16h开始补加γ-丁内酯，初始添加量为10g/L，第二补料阶段补入8g/L，第三补料阶段补入6g/L。
细胞干重测定
以与以上实施例2中相同的方式测定细胞干重。
P3HB4HB含量测定
以与以上实施例2中相同的方式测定P3HB4HB含量。
测定结果
图3显示halomonas TD40在1m3发酵罐中无灭菌条件下发酵生产P3HB4HB的过程中生物量随时间变化。在发酵培养36h之后，菌体细胞干重(DCW)达到85g/L，OD600达到320，P3HB4HB含量达到细胞干重的70％。
实施例4盐单胞菌(halomonas TD40)在5m3发酵罐中生产P3HB4HB
菌种培养
1、菌种活化：将保存于-80℃冰箱的盐单胞菌(halomonas TD40)甘油管在60LB固体平板培养基上划线分离单克隆，37℃培养箱中培养18-24h。
2、一级种子：从活化好的盐单胞菌(halomonas TD40)平板上接单菌落于装有50mL60LB的250mL摇瓶中，温度37℃，转速200rpm的摇床中培养12h。
3、二级种子：一级种子液按照1％的接种量接种于装有1L 60LB的5L摇瓶中，接种8个摇瓶，温度37℃，转速200rpm的摇床中培养10-12h。
4、三级种子：二级种子液按照2％的接种量接入到500L种子罐中，种 子罐装液量300L，温度39℃，pH 8.5，通气量1vvm，初始转速140rpm，溶氧降到30％以下调节转速，最大转速280rpm。三级种子培养8-10h。
60LB培养基成分：氯化钠60g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，平板培养基加琼脂20g/L。
三级种子培养基成分：氯化钠60g/L，葡萄糖20g/L，玉米浆液70mL/L，尿素5g/L，硫酸镁1.0g/L，磷酸二氢钾6g/L，微量元素母液I 10mL/L、微量元素母液II 10mL/L。
发酵培养
按10％的接种量将三级种子液接入到优化后的发酵培养基中，5m3发酵罐初始装液3m3，发酵体系不灭菌直接发酵。温度37℃，通气量180m3/h，罐压0.05MPa，初始转速90rpm，溶氧低于30％后手动调节转速，最大转速170rpm；转速和通气达到最大后，不控制溶氧。发酵过程中通过间歇补料的方式控制葡萄糖浓度为5-20g/L之间；8M NaOH自动调节pH为8.5。
发酵培养基配方如下：
氯化钠30g/L,葡萄糖30g/L,玉米浆液30mL/L，尿素2g/L，硫酸镁1.2g/L，磷酸二氢钾4g/L，微量元素母液I 10mL/L、微量元素母液II 10mL/L。
微量元素母液I：柠檬酸铁铵8g/L，二水合氯化钙5g/L，用0.5mol/L盐酸水溶液溶解。
微量元素母液II：ZnSO4·7H2O 100mg/L，MnCl2·4H2O 30mg/L，H3BO3 300mg/L，CoCl2·6H2O 200mg/L，CuSO4·5H2O 10mg/L，NiCl2·6H2O 20mg/L，NaMoO4·2H2O 30mg/L，用0.5mol/L盐酸水溶液彻底溶解。
发酵8h开始补料，补料方式为间歇补料，补料培养基通过气压从补料罐压入到发酵罐，保持发酵液残糖浓度为5-20g/L之间，残糖降至5g/L左右时，开始补料。补料分为3个阶段，8-18h为第一阶段，在此阶段内，补料培养基中添加足量的尿素，保证生物量的快速积累；19-26h为第二阶段，在此阶 段内，降低补料培养基中的尿素，保证菌体从生物量的积累向PHA积累过渡；27h-36h为第三阶段，在此阶段内，只补碳源，不补氮源，促进PHA的大量积累。
补料培养基配方如下：
第一补料阶段：葡萄糖250kg，氯化铵10kg，用155L自来水完全溶解；
第二补料阶段：葡萄糖200kg，氯化铵0.6kg，用125L自来水完全溶解；
第三补料阶段：葡萄糖200kg，用125L自来水完全溶解。
γ-丁内酯补加方式：
发酵16h开始补加γ-丁内酯，初始添加量为10g/L，第二补料阶段补入8g/L，第三补料阶段补入6g/L。
细胞干重测定
以与以上实施例2中相同的方式测定细胞干重。
P3HB4HB含量测定
以与以上实施例2中相同的方式测定P3HB4HB含量。
测定结果
图4显示halomonas TD40在5m3发酵罐中无灭菌条件下发酵生产P3HB4HB的过程中生物量随时间变化。在发酵培养36h之后，菌体细胞干重(DCW)达到103g/L，OD600达到390，P3HB4HB含量达到细胞干重的65％。
上述实验表明，本发明菌株盐单胞菌可在矿物盐培养基(MM)中高效积累聚羟基脂肪酸酯(PHA)，为PHA的生物合成提供了良好的保证。本发明的盐单胞菌营养要求简单、发酵过程简单易于控制。
以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范 围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims (15)

1.一种以盐单胞菌为生产菌无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将盐单胞菌接入发酵培养基中进行发酵培养；
(2)发酵进入对数期后，通过补加第一补料培养基进行第一阶段补料发酵；
(3)第一阶段补料发酵结束后，通过补加第二补料培养基进行第二阶段补料发酵；
(4)第二阶段补料发酵结束后，通过补加第三补料培养基进行第三阶段补料发酵直至发酵结束，
其中，在以上步骤(2)中的第一补料培养基和步骤(3)中的第二补料培养基包含碳源和氮源，在以上步骤(4)中的第三补料培养基仅包含碳源，并且在以上步骤(3)的第二补料培养基中的氮源含量低于在以上步骤(2)的第一补料培养基中的氮源含量；
其中，在步骤(2)中，所述第一补料培养基中碳源与初始发酵体系的重量:体积配比为80-150g:1L，所述第一补料培养基中氮源与初始发酵体系的重量:体积配比为2-6g:1L；和/或，
在步骤(3)中，所述第二补料培养基中碳源与初始发酵体系的重量:体积配比为50-80g:1L，所述第二补料培养基中氮源与初始发酵体系的重量:体积配比为0.1-2g:1L；和/或，
在步骤(4)中，所述第三补料培养基中碳源与初始发酵体系的重量:体积配比为80-150g:1L。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述盐单胞菌为Halomonas TD 01或HalomonasTD40。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述聚羟基脂肪酸酯为聚3羟基丁酸酯即PHB、聚3羟基丁酸4羟基丁酸酯即P3HB4HB或聚3羟基丁酸3羟基戊酸酯即PHBV。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(1)中发酵的初始温度为20℃-45℃；和/或，发酵体系的初始pH为7.0-11.0；和/或，发酵体系的初始溶氧为30％-60％。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，在步骤(1)中发酵的初始温度为25℃-45℃；和/或，发酵体系的初始pH为7.0-10.0；和/或，发酵体系的初始溶氧为30％-60％。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(1)中发酵的初始温度为30℃-40℃；和/或，发酵体系的初始pH为7.0-9.0；和/或，发酵体系的初始溶氧为30％-60％。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中的发酵培养时间为4-12h；和/或，所述步骤(2)中的发酵培养时间为4h-24h；和/或，所述步骤(3)中的发酵培养时间为2h-12h；和/或，所述步骤(4)中的发酵培养时间为2h-30h。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述步骤(1)中的发酵培养时间为6-10h；和/或，所述步骤(2)中的发酵培养时间为6h-20h；和/或，所述步骤(3)中的发酵培养时间为4h-12h；和/或，所述步骤(4)中的发酵培养时间为4h-24h。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(2)至(4)中，所述第一至第三补料培养基的碳源为选自葡萄糖、蔗糖、葡萄糖酸钠中的一种或多种；和/或，在步骤(2)和(3)中，所述第一和第二补料培养基的氮源为选自氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、尿素中的一种或多种。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(2)至(4)中，所述碳源或氮源的补加方式为连续流加补料或间歇补料；并且
在上述步骤(2)至(4)中，所述碳源或氮源的补料方式为选自混合补加、分开补加、相同速率补加、不同速率补加中的一种或多种。
11.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤(2)至(4)中，补料过程控制糖浓度为5-20g/L。
12.根据权利要求3所述的方法，其中，在P3HB4HB的生产过程中，γ-丁内酯的添加量为5-30g/L；γ-丁内酯的补加时间为6h-30h；γ-丁内酯的补加方式为间歇补加或连续流加。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，在P3HB4HB的生产过程中，γ-丁内酯的添加量为8-24g/L；γ-丁内酯的补加时间为8h-26h。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，在P3HB4HB的生产过程中，γ-丁内酯的添加量为12-20g/L；γ-丁内酯的补加时间为12h-22h。
15.根据权利要求12-14任一项所述的方法，其中，在P3HB4HB的生产过程中，γ-丁内酯的补加方式为间歇补加方式。
CN201710832790.3A 2017-09-15 2017-09-15 一种无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯的方法 Active CN109504714B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710832790.3A CN109504714B (zh) 2017-09-15 2017-09-15 一种无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710832790.3A CN109504714B (zh) 2017-09-15 2017-09-15 一种无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109504714A CN109504714A (zh) 2019-03-22
CN109504714B true CN109504714B (zh) 2022-04-12

Family

ID=65745010

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710832790.3A Active CN109504714B (zh) 2017-09-15 2017-09-15 一种无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109504714B (zh)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110331175B (zh) * 2019-07-04 2021-04-16 北京工业大学 混合菌群以奇数碳脂肪酸为底物合成聚羟基烷酸酯的方法
CN111349662B (zh) * 2020-04-29 2021-01-08 吉林中粮生化有限公司 以利用pha发酵工艺废水进行发酵制备pha的方法
CN111593078B (zh) * 2020-06-03 2020-10-23 中粮营养健康研究院有限公司 以玉米浆为原料进行发酵制备pha的方法
CN111394398B (zh) * 2020-06-03 2020-09-01 中粮营养健康研究院有限公司 以高盐糖蜜为原料进行发酵制备pha的方法
CN111593006B (zh) * 2020-06-03 2021-10-26 北京微构工场生物技术有限公司 一株自凝絮嗜盐菌及其应用
CN111500650B (zh) 2020-06-30 2020-10-23 中粮营养健康研究院有限公司 一种高效生产pha的方法
CN113801810B (zh) * 2021-08-13 2022-06-24 珠海麦得发生物科技股份有限公司 一株盐单胞菌及其应用
CN114277066B (zh) * 2021-12-03 2022-12-30 珠海麦得发生物科技股份有限公司 一种聚羟基脂肪酸酯的制备方法及其应用
CN115044624B (zh) * 2022-06-22 2023-05-09 珠海麦得发生物科技股份有限公司 一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法
CN115948622B (zh) * 2022-09-22 2024-08-09 北京蓝晶微生物科技有限公司 微生物发酵控制方法、装置、系统、设备及介质
CN116396886B (zh) * 2022-10-27 2023-11-28 华南理工大学 嗜盐单胞菌及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1828375A1 (en) * 2004-12-21 2007-09-05 USV Limited Low cell density fermentation process for the production of heterologous recombinant proteins in microorganisms
CN102120973A (zh) * 2010-12-08 2011-07-13 清华大学 一株盐单胞菌及其应用
CN103074393A (zh) * 2012-12-05 2013-05-01 广东省微生物研究所 一种增强细胞生长及生物过程效率的ε-聚赖氨酸补料分批发酵方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1828375A1 (en) * 2004-12-21 2007-09-05 USV Limited Low cell density fermentation process for the production of heterologous recombinant proteins in microorganisms
CN102120973A (zh) * 2010-12-08 2011-07-13 清华大学 一株盐单胞菌及其应用
CN103074393A (zh) * 2012-12-05 2013-05-01 广东省微生物研究所 一种增强细胞生长及生物过程效率的ε-聚赖氨酸补料分批发酵方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Engineering Halomonas bluephagenesis TD01 for non-sterile production of poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate);Chen X et al.;《Bioresour Technol》;20170727;第535页右栏第4段、第540页左栏第4段 *
一株产聚-β-羟基丁酸酯（PHB）的嗜盐菌Halomonas sp.发酵条件的优化及产物特性鉴定;刘润泽;《黑龙江大学自然科学学报》;20170228;第90页第1.3.2节、第92页第2.2.2节 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109504714A (zh) 2019-03-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109504714B (zh) 一种无灭菌发酵生产聚羟基脂肪酸酯的方法
Sun et al. Efficient production of lactic acid from sugarcane molasses by a newly microbial consortium CEE-DL15
Ma et al. Open fermentative production of l-lactic acid with high optical purity by thermophilic Bacillus coagulans using excess sludge as nutrient
Wang et al. Efficient production of succinic acid from corn stalk hydrolysates by a recombinant Escherichia coli with ptsG mutation
CN102120973B (zh) 一株盐单胞菌及其应用
CN111593006B (zh) 一株自凝絮嗜盐菌及其应用
CN101792778B (zh) 一种循环利用重组大肠杆菌细胞发酵生产丁二酸的方法
Imao et al. 1, 5-Diaminopentane production from xylooligosaccharides using metabolically engineered Corynebacterium glutamicum displaying beta-xylosidase on the cell surface
CN110079489A (zh) 一种重组盐单胞菌以及利用其生产P(3HB-co-4HB)的方法
CN111349593B (zh) 鼠李糖乳杆菌和发酵产l-乳酸的方法及应用
CN115044624B (zh) 一种利用盐单胞菌重复批次发酵生产pha的方法
WO2021073011A1 (zh) 一种生产长链二元酸的菌株及其发酵方法
CN105543214A (zh) 利用乙酸生产丁二酸的代谢工程大肠杆菌菌株构建方法和应用
CN117701486B (zh) 一种生产pha的重组菌及其构建方法与应用
CN102352382B (zh) 一种两阶段发酵生产苹果酸的方法
CN101603057A (zh) 一种生物法合成1,3-丙二醇的方法
Liu et al. Optimization of L-(+)-lactic acid production using pelletized filamentous Rhizopus oryzae NRRL 395
CN102154389A (zh) 补料发酵生产β-聚苹果酸的工艺
CN117265026A (zh) 一种嗜盐菌在中性发酵条件下生产pha的方法
CN103045662A (zh) 一种提高发酵法生产β-聚苹果酸产量和纯度的发酵培养基
CN107227286A (zh) 一株高产琥珀酸的基因工程菌及其构建方法与应用
CN101955978A (zh) 添加渗透压保护剂提高丁二酸浓度和生产强度的方法
CN104974946A (zh) 耐高渗透压的重组大肠杆菌及其应用
CN102757991A (zh) 一种提高红霉素发酵效价和促进红霉素a生成的方法
CN106884001B (zh) 一种重组嗜碱芽孢杆菌及其制备方法和应用以及制备d-乳酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address
CP03 Change of name, title or address

Address after: Building 1, No. 351 Yuexiu Road, Hongkou District, Shanghai 200072

Patentee after: Shanghai Blue Crystal Microbial Technology Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: 102206 room 218 / 219, building 1, Peking University Medical Industrial Park, Zhongguancun Life Science Park, Changping District, Beijing

Patentee before: BLUEPHA Co.,Ltd.

Country or region before: China