CN111500650B - 一种高效生产pha的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及PHA生物合成领域，具体涉及一种高效生产PHA的方法。该方法包括：在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵；将发酵液进行固液分离，得到发酵清液和菌体沉淀；将菌体沉淀进行破壁，并对破壁产物进行板框过滤，得到PHA；板框过滤的滤布上预涂覆有PHA层；所述发酵培养基的至少部分配液水为PHA工艺废水。该方法以PHA工艺废水作为发酵培养基的至少部分配液水，同时以预涂覆有PHA层的板框过滤设备对破碎后的菌体进行过滤分离获得PHA，实现了高盐废水的重复利用，降低了成本，同时能够大规模的对PHA进行分离，可实现工业化生产。

Description

一种高效生产PHA的方法
技术领域
本发明涉及生物基材料聚羟基脂肪酸酯（PHA）的生产领域，具体涉及一种高效生产PHA的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯 (PHA) 是一类完全由微生物合成的高分子聚酯的统称。PHA具有生物可降解性和生物相容性，因而被认为是环境友好型材料，有助于解决日益严重的环境污染问题，具有很好的应有前景。虽然近年来对PHA已经进行了广泛的基础性和应用性研究，但目前国内还没有PHA大规模工业化生产，因此亟需研究PHA工业化生产工艺和方法。
嗜盐菌是近年来选育出来的性状优质的高产菌株，但是其发酵过程需要高浓度的盐环境，由于大量无机盐的使用，一方面，会导致高昂的生产成本，另一方面，产生的高盐废水面临着需要花高成本来处理的问题。
此外，关于PHA工业化生产的专利大多集中在可工程化菌株，比如：CN110004182A、CN102952774B、CN102120973B、CN101096651B等等。也有部分关于PHA分离方法的专利，比如CN100448911C，CN109517156A，CN1211489C，CN109504715A等，这些大多采用多次离心分离法，但离心分离法单机分离效率低、能耗大、操作难度大，且分离能力有限，要想大规模工业化需要多台离心机同时运转，一次性设备投资大。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供一种高效生产PHA的方法，该方法以PHA工艺废水作为发酵培养基的至少部分配液水，同时以预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的板框过滤设备对破碎后的菌体进行过滤分离获得PHA。实现了高盐废水的重复利用，降低了生产成本，减少了一次性投资，同时该方法能够大规模的对PHA进行分离，可实现大规模生产。
为了实现上述目的，本发明提供一种发酵制备PHA的方法，该方法包括：
（1）在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
（2）将所述发酵液进行第一固液分离，得到发酵清液和菌体沉淀；
（3）将所述菌体沉淀进行破壁，并对所得破壁产物进行板框过滤，得到所述聚羟基脂肪酸酯；
其中，所述板框过滤的滤布上预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层；
其中，所述发酵培养基的至少部分配液水为PHA工艺废水，所述PHA工艺废水包括所述发酵清液。
本发明针对目前国内还没有PHA的大规模工业化生产技术问题，提出一种高效的可工业化PHA生产方法，采用PHA发酵菌株发酵得到PHA发酵液，然后经发酵液固液分离、菌体破壁、破壁产物经预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的板框过滤设备进行分离纯化等一系列单元操作分离得到高纯度的PHA产品，分离出目标菌体和目标产物的高盐PHA工艺废水经过简单处理后回用到下一批次的发酵生产中，既节约资源又减少废水的排放。本发明方法操作简便，资源利用效率高，可工业化生产。
本发明在保证PHA发酵效果的情况下，能够实现PHA工艺废水多次循环回用于PHA发酵工艺，由于废水中含有大量的盐分和其他未利用的营养成分，减少了培养基配料中盐分的添加，有效降低了PHA的生产成本。
本发明采用板框分离代替传统的离心分离PHA，并且在所述板框过滤的滤布上预涂覆PHA层，避免了现有技术中采用多次离心分离所造成的成本大、操作困难的缺陷，此外，本发明的方法还具有PHA回收率高，所得PHA产品纯度高的特性。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种发酵制备PHA的方法，该方法包括：
（1）在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
（2）将所述发酵液进行第一固液分离，得到发酵清液和菌体沉淀；
（3）将所述菌体沉淀进行破壁，并对所得破壁产物进行板框过滤，得到所述聚羟基脂肪酸酯；
其中，所述板框过滤的滤布上预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层；
其中，所述发酵培养基的至少部分配液水为PHA工艺废水，所述PHA工艺废水包括所述发酵清液。
步骤（1）
根据本发明，尽管只要将PHA发酵的工艺废水回用至发酵过程，作为培养基的配液水即可实现本发明的目的，但优选地，为了进一步提高发酵效率，所述PHA工艺废水的粘度<20 CPS，COD值<10000 mg/L，色度<80。
其中，所述粘度可以使用粘度计进行测定。
其中，所述色度可以使用铂钴标准方法进行测定。
根据本发明，当PHA发酵工艺所产生的废水指标超过如上指标时，可以对其进行进一步处理，例如，可以经浓缩后用于生物肥料，可以净化处理至满足上述指标后进一步作为至少部分所述发酵培养基的配液水。需要说明的是，即便PHA发酵工艺所产生的废水指标在如上范围内时，也可以进行净化处理以提高发酵效率。对于净化处理的方法下文将着重介绍。
根据本发明，进一步优选的，所述PHA工艺废水色泽澄清，无明显悬浊和沉淀，固含量在2-5重量%之间。
根据本发明，优选地，所述发酵培养基以PHA工艺废水添加或不添加纯水作为配液水。
根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵培养基以PHA工艺废水添加纯水作为配液水，PHA工艺废水与纯水的体积比为3-10:1，例如，可以为3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1。
根据本发明，优选地，所述发酵培养基含有碳源、氮源、磷酸盐、镁盐和钠盐。
根据本发明，优选的，所述碳源选自葡萄糖、淀粉糖化液和高盐糖蜜中的至少一种。
根据本发明，所述碳源的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述碳源的含量为10-100g。
根据本发明一种具体的实施方式，所述碳源为葡萄糖，优选地，相对于1L发酵培养基，葡萄糖的含量为10-35g，10g、15g、20g、25g、30g、35g，进一步优选为15-30g。
根据本发明另一种优选的实施方式，所述碳源为高盐糖蜜。其中，所述高盐糖蜜是指以高盐糖蜜的干重为基准，盐含量为8-11重量%，糖含量为40-70重量%的糖蜜。
本发明需要说明的是，所述“高盐糖蜜”中的“盐”是指氯化钠。
根据本发明，所述高盐糖蜜可以为任意的在盐含量和糖含量上符合如上要求的糖蜜，例如，可以为高盐甘蔗糖蜜和/或高盐甜菜糖蜜。
根据本发明一种优选的实施方式，所述高盐糖蜜为高盐甘蔗糖蜜，以干重为基准，其盐含量在9重量百分比以上，例如，9-11重量百分比，糖含量在50重量百分比以上，例如，50-70重量百分比，所述糖包括葡萄糖、蔗糖和果糖，其中，以总糖计，葡萄糖的含量为5-15重量百分比，蔗糖的含量为75-85重量百分比，果糖的含量为5-12重量百分比。
根据本发明，所述高盐糖蜜可以为粗制高盐糖蜜，也可以为精制高盐糖蜜，还可以为由精制高盐糖蜜进行脱色和稀释后得到的糖浆。
根据本发明一种优选的实施方式，为了进一步提高发酵效率，在将所述高盐糖蜜用作碳源前，将其进行酸水解，例如，使用浓度不高于20重量%的稀盐酸进行酸水解，所述酸水解的条件可以包括：温度为15-45℃，时间为0.5-1.5h，相对于100g的高盐糖蜜，稀盐酸的用量为2-10ml。
优选的，相对于1L发酵培养基，所述高盐糖蜜的含量为10-60mL，例如，可以为10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL，更优选为15-35mL。
根据本发明一种具体的实施方式，所述碳源为淀粉糖化液，相对于1L发酵培养基，所述淀粉糖化液的含量为10-60mL，例如，可以为10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL、50mL、55mL、60mL，更优选为15-35mL。
根据本发明，所述氮源的种类没有特别的限制，只要能够为PHA发酵菌种提供所需的氮源即可，可以为有机氮源，例如，玉米浆液、玉米浆粉、豆粕粉、酵母粉等天然复合氮源，也可以为无机氮源，例如，尿素、硫酸铵等。
根据本发明，所述氮源的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述氮源的含量为5-50g。
根据本发明一种优选的实施方式，所述氮源为玉米浆液。
玉米浆是玉米深加工产业的副产物之一，玉米浸泡水经浓缩后得到米浆。玉米浆是极富营养的物质，当玉米浆浓缩至固形物含量为40-50重量%时，蛋白质含量将会超过40重量%。除此之外玉米浆中还含有多种氨基酸、维生素、无机盐磷、钾等营养成分。
玉米浆的用途广泛，将玉米浆与玉米皮混合加工成玉米片作为饲料原料使用，但是玉米浆液使用量较少，剩余的大部分玉米浆被直接排放至污水处理厂进行处理；将廉价玉米浆经袋式过滤、多次蒸发浓缩、二次过滤、低温离心喷雾干燥一系列操作制成玉米浆干粉进行出售，但是制粉操作过程复杂、能源资源消耗巨大，商业附加价值低。
所述玉米浆液的来源不受特别的限制，例如，中粮集团的中粮生物科技股份有限公司，作为国内规模最大、技术领先的玉米深加工企业，具有700万吨玉米加工能力。本发明中使用的玉米浆可以来自中粮生化能源(榆树)有限公司，其每年加工转化玉米60万吨，产生的废玉米浆液体量巨大，废玉米浆液排放处理投入较高。以传统玉米深加工行业生产的副产物廉价玉米浆液为基质利用盐单胞菌生产PHA，不仅解决了PHA工业化生产过程中面临的发酵原料成本高的问题，还解决了企业处理废玉米浆液所消耗的资源和能源的问题。
其中，所述玉米浆液的固含量可以为10-50重量%（比如，10重量%、15重量%、20重量%、25重量%、30重量%、35重量%、40重量%、45重量%、50重量%，或者之间的任意数值），更优选为40-50重量%。
根据本发明，所述玉米浆液可以为任意的在固含量上符合如上要求的玉米浆液。
根据本发明，所述玉米浆液可以为经除杂后的玉米浆液，也可以为未经除杂的玉米浆液，优选的，所述玉米浆为经除杂后的玉米浆液。
根据本发明中，优选地，所述除杂的方法为过滤。
更优选地，所述过滤包括但不限于纱布过滤、板框过滤、真空过滤、膜过滤处理的至少一种。
根据本发明，优选地，所述玉米浆液为酶解玉米浆液。本发明通过对玉米浆液进行酶解，将所述玉米浆液中的纤维素、蛋白质、淀粉等不溶性的物质水解成小分子的糖类和氨基酸，作为营养物质被微生物利用，提高了原料的利用率，从而提高了PHA的产率。
根据本发明，对酶解玉米浆液所使用的酶没有特别的限制，优选地，所述酶选自纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶，更优选为纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶。
根据本发明，所述酶的用量可以在较宽的范围内选择，优选地，相对于1000重量份的玉米浆液，纤维素酶的用量为0.01-0.15重量份（比如可以为0.01重量份、0.03重量份、0.05重量份、0.07重量份、0.09重量份、0.11重量份、0.13重量份、0.15重量份，或者之间的任意值），更优选0.08-0.1重量份；半纤维素酶的用量为0.01-0.15重量份（比如可以为0.01重量份、0.03重量份、0.05重量份、0.07重量份、0.09重量份、0.11重量份、0.13重量份、0.15重量份，或者之间的任意值），更优选为0.08-0.1重量份；淀粉酶的用量为0.01-0.06重量份（比如可以为0.01重量份、0.02重量份、0.03重量份、0.04重量份、0.05重量份、0.06重量份，或者之间的任意值），更优选为0.02-0.05重量份；酸性蛋白酶的用量为0.08-0.2重量份（比如可以为0.08重量份、0.1重量份、0.12重量份、0.14重量份、0.16重量份、0.18重量份、0.2重量份，或者之间的任意值），更优选为0.12-0.18重量份。
根据本发明，所述酶解的条件可以在较宽的范围内选择，优选地，所述酶解的条件包括：温度为40-55℃（比如可以为40℃、43℃、46℃、49℃、52℃、55℃，或者之间的任意值），更优选为45-50℃；时间为20-50min（比如可以为20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min，或者之间的任意值），更优选为30-40min；酶解的pH值为4-6（比如可以为4、4.5、5、5.5、6，或者之间的任意值），更优选为5-5.5。
根据本发明，优选地，酶解在搅拌的条件下进行，搅拌的转速为200-1000rpm（比如可以为200rpm、300rpm、400rpm、500rpm、600rpm、700rpm、800rpm、900rpm、1000rpm，或者之间的任意值），更优选为500-800rpm。
根据本发明，优选地，所述酶解玉米浆液为经过固液分离的酶解玉米浆液，所述固液分离可以为常规的各种固液分离的方法，例如，可以包括但不限于离心、膜分离、板框过滤等，优选为膜过滤，所述膜的孔径为100-600nm。
更优选地，所述膜为陶瓷膜。
根据本发明，在所述发酵培养基中，所述玉米浆液的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述玉米浆液的含量为5-45ml，例如，可以为5mL、10mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、40mL、45mL，更优选为10-40mL，进一步优选为32-36mL。
根据本发明一种具体的实施方式，所述氮源为尿素和玉米浆粉，相对于1L发酵培养基，所述玉米浆粉的含量为15-21g，例如，可以为15g、16g、17g、18g、19g、20g、21g；所述尿素的含量为1.5-2.5g，例如，可以为1.5g、1.7g、1.9g、2.1g、2.3g、2.5g。
根据本发明一种具体的实施方式，所述氮源为酵母粉，优选的，相对于1L发酵培养基，所述酵母粉的含量为13-18g，例如，13 g、14 g、15 g、16 g、17 g、18 g，优选为15-17g。
其中，所述磷酸盐的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述磷酸盐的含量为5-20g，例如，可以为5g、7g、9g、11g、13g、15g、16g、17g、18g、19g、20g。
根据本发明，所述磷酸盐可以为PHA发酵过程中常规使用的磷酸盐，例如，磷酸的钠盐、磷酸的钾盐，优选的，所述磷酸盐为磷酸氢二钾和磷酸氢二钠；进一步优选的，相对于1L发酵培养基，磷酸氢二钾的含量为2-5g，优选为2.5-4g，例如，可以为2.5 g、2.6 g、2.7g、2.8 g、2.9 g、3g、3.1g、3.2g、3.3g、3.4g、3.5g、4g；磷酸氢二钠的含量为5-8g，优选为5.5-7.5g，例如，可以为5.5g、6g、6.5g、7g、7.5g。
根据本发明，所述镁盐可以为常规的各种镁盐，但不包括磷酸的镁盐，优选的，所述镁盐为硫酸镁和/或氯化镁。
其中，所述镁盐的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述镁盐的含量为0.1-0.5g，例如，可以为0.1g、0.15g、0.2g、0.25g、0.3g、0.35g、0.4g、0.45g、0.5g，优选为0.2-0.3g。
根据本发明，所述钠盐可以为常规的各种钠盐，但不包括磷酸的钠盐，优选的，钠盐为氯化钠。
其中，所述钠盐的含量可以在较宽的范围内选择，优选的，相对于1L发酵培养基，所述钠盐的含量为40-70g，例如，可以40g、45g、50g、55g、60g、65g、70g，更优选为45-55g。
根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵培养基为一号发酵培养基，含有高盐糖蜜、酵母粉、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁和氯化钠；相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜的含量为15-35ml、酵母粉的含量为15-17g、磷酸氢二钾的含量为2-5g、磷酸氢二钠的含量为5-8g、硫酸镁的含量为0.2-0.3g、氯化钠的含量为45-55g。
根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵培养基为二号发酵培养基，含有玉米浆液、葡萄糖、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁和氯化钠；相对于1L发酵培养基，玉米浆液的含量为32-36ml、葡萄糖的含量为15-30g、磷酸氢二钾的含量为2-5g、磷酸氢二钠的含量为5-8g、硫酸镁的含量为0.2-0.3g、氯化钠的含量为45-55g。
根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵培养基为三号发酵培养基，含有葡萄糖、玉米浆粉（酶解）、尿素、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、硫酸镁和氯化钠；相对于1L发酵培养基，葡萄糖的含量为15-30g、玉米浆粉的含量为15-21g、尿素的含量为1.5-2.5g、磷酸氢二钾的含量为2-5g、磷酸氢二钠的含量为5-8g、硫酸镁的含量为0.2-0.3g、氯化钠的含量为45-55g。
需要说明的是，如上各物质的含量指的是在培养基中各物质的含量，而并非是指各物质的总投料量。
根据本发明，优选的，如上的各组分在用于配制培养基前先进行除杂处理，或者在向所述发酵培养基中接种PHA发酵菌种前，优选对所述发酵培养基进行除杂处理，所述除杂的方法可以包括但不限于纱布过滤、板框过滤、真空过滤和膜过滤中的一种或多种。
根据本发明，PHA发酵的温度可以为其常规的发酵温度，优选的，温度为30-45℃，例如，可以为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃。更优选的，温度为35-39℃。
根据本发明，PHA发酵的pH可以为其常规的发酵pH，优选的，pH值为7-9，例如，可以为7、7.5、8、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、9。更优选的，pH值为8.3-8.7。其中，所述pH值可以使用常规的碱进行调节，例如，8-12mol/L的氢氧化钠溶液。
根据本发明，PHA发酵的溶氧量可以为其常规的发酵溶氧量，优选的，溶氧量为1-40%，例如，可以为1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%。更优选的，溶氧量为1-30%。
根据本发明，所述PHA的发酵条件还优选包括对通风量进行控制，优选的，通风量为0.5-1.5vvm，例如，可以为0.5vvm、0.6vvm、0.7vvm、0.8vvm、0.9vvm、1vvm、1.1vvm、1.2vvm、1.3vvm、1.4vvm、1.5vvm，优选为1-1.2vvm。
根据本发明，所述PHA的发酵条件还优选包括搅拌，其中，所述搅拌的转速可以在较宽的范围内选择，优选的，以2-7L发酵罐计，所述搅拌的转速为400-1000rpm，例如，可以为400rpm、450rpm、500rpm、550rpm、600rpm、650rpm、700rpm、750rpm、800rpm、850rpm、900rpm、950rpm、1000rpm。
本发明的发明人在研究的过程中发现，通过在不同的发酵阶段控制不同的搅拌转速，能够进一步提高最终的发酵效果。优选的，所述发酵在搅拌的条件下进行，从发酵0h到发酵8-12h（例如，可以为0-8h、0-9h时、0-10h、0-11h、0-12h），优选到发酵9-11h，所述搅拌的转速为400-600rpm；
从发酵8-12h（优选9-11h）到发酵16-20h（例如，可以为8-16h、9-17h、10-18h、11-19h、12-20h、9-20h、10-20h等等，优选17-19h，具体起始时间依据上一阶段终止时间而定），所述搅拌的转速为600-1000rpm；
从发酵16-20h（优选17-19h）到发酵结束（例如，16h至发酵结束、17h至发酵结束、18h至发酵结束、19h至发酵结束、20h至发酵结束，具体起始时间依据上一阶段终止时间而定），所述搅拌的转速为400-600rpm。
根据本发明，所述PHA的发酵可以在不补料情况下进行，也可以在补料的情况下进行。根据本发明一种优选的实施方式，所述PHA的发酵为补料发酵，也即，在发酵的过程中补加营养物质。
根据本发明，所述营养物质的添加时机可以根据PHA发酵菌种对糖的需求情况而定，优选的，当发酵培养基中的糖含量下降至12g/L以下，优选下降至10g/L以下，更优选下降至5-8g/L（例如，5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L）以下时，开始补加所述营养物质。
其中，所述营养物质的补加量优选使得发酵培养基中的糖含量控制在5-20g/L，例如，5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L、11 g/L、12 g/L、13 g/L、14 g/L、15 g/L、16g/L、17 g/L、18 g/L、19 g/L、20 g/L，优选为8-15 g/L。
其中，所述糖含量是指利用SBA-90生物传感分析仪测定的发酵离心上清液中的糖含量。
其中，优选的，在发酵的过程中实时监测发酵体系中的糖含量。
优选地，当所述发酵液的OD600的增速小于5/h时即可结束发酵，根据发明人的发酵经验，当发酵36-60小时，优选39-42小时时，OD600的增速可以降低至如上的水平。
其中，OD600指的是发酵液在分光光度计中在600nm波长处的吸光值。
其中，优选的，在发酵的过程中实时监测发酵体系中的OD600。
根据本发明，所述营养物质可以为常规的发酵过程中的补料，只要能够满足如上的要求即可。
本发明的发明人进一步发现，在发酵的不同阶段补加不同的营养物质，能够进一步提高发酵效果，优选的，所述营养物质的补加方法包括：
（1）当发酵培养基中的糖含量第一次下降至12g/L以下，优选下降至10g/L以下，更优选下降至5-8g/L以下时，补充第一营养物质，所述第一营养物质的碳氮比为10-20：1；第一营养物质的补充量为发酵培养基的8-12体积%。
根据本发明一种优选的实施方式，所述第一营养物质含有高盐糖蜜和酵母粉。优选的，相对于1L的第一营养物质，高盐糖蜜的含量为550-830ml，酵母粉的含量为80-120g。
根据本发明一种优选的实施方式，所述第一营养物质含有玉米浆和葡萄糖。优选的，相对于1L的第一营养物质，玉米浆的含量为480-690ml，优选为480-552ml，葡萄糖的含量为480-720g，优选为540-600g。
根据本发明一种优选的实施方式，所述第一营养物质含有葡萄糖、玉米浆、尿素、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和硫酸镁。优选地，相对于1L的第一营养物质，葡萄糖的含量为400-500g、玉米浆的含量为42-50g、尿素的含量为15-25g、磷酸氢二钾的含量为2-3g、磷酸氢二钠的含量为5-10g、硫酸镁的含量为0.2-0.4g。
（2）当第一营养物质补充结束后，补充第二营养物质，所述第二营养物质的碳氮比为30-50：1；第二营养物质的补充量为发酵培养基的5-10体积%。
根据本发明一种优选的实施方式，所述第二营养物质含有高盐糖蜜和酵母粉。优选的，相对于1L的第二营养物质，高盐糖蜜的含量为830-980ml，酵母粉的含量为40-80g。
根据本发明一种优选的实施方式，所述第二营养物质含有玉米浆和葡萄糖。优选的，相对于1L的第二营养物质，玉米浆的含量为272-326ml，优选为272-282ml，葡萄糖的含量为680-1000g，优选为765-850g。
根据本发明一种优选的实施方式，所述第二营养物质含有葡萄糖、玉米浆和尿素。优选的，相对于1L的第二营养物质，葡萄糖的含量为400-500g、玉米浆的含量为35-40g、尿素的含量为5-10g。
其中，所述第二营养物质可以在第一营养物质补充结束马上补充，也可以间隔一定的时间，但间隔的时间要使得发酵培养基中的糖含量在5-20g/L，优选8-15 g/L。
（3）当第二营养物质补充结束后，补充第三营养物质，所述第三营养物质为碳源，第三营养物质的补充量为发酵培养基的20-30体积%。
根据本发明一种优选的实施方式，所述第三营养物质为高盐糖蜜。
根据本发明一种优选的实施方式，所述第三营养物质为葡萄糖，相对于1L的第三营养物质，葡萄糖的含量为700-900g，优选为750-850g。
根据本发明一种优选的实施方式，所述第三营养物质为葡萄糖，相对于1L的第三营养物质，葡萄糖的含量为600-700g。
其中，所述第三营养物质可以在第二营养物质补充结束马上补充，也可以间隔一定的时间，但间隔的时间要使得发酵培养基中的糖含量在5-20g/L，优选8-15 g/L。
优选的，在第三营养物质补加结束后，继续发酵1-3小时时结束发酵。
根据本发明，所述营养物质的补加可以采用间歇式的补加方式，也可以采用流加的方式，本领域技术人员可以根据实际情况而定。
根据本发明，所述发酵制备PHA的方式可以为连续式发酵，也可以为间歇式发酵。
根据本发明，所述PHA发酵菌种可以为常规的各种能够发酵产PHA的嗜盐发酵菌种，优选的，所述PHA发酵菌种为嗜盐古菌(Halobacteriaceae)或盐单胞菌(Halomonas sp.)；更优选的，所述PHA发酵菌种为盐单胞菌(Halomonas sp.)TD01，其保藏编号为CGMCCNO.4353（CN201010578858.8）。
根据本发明，所述发酵菌种的接种量可以不受特别的限制，优选的，相对于1L发酵培养基，所述发酵菌种的接种量为5-15体积%；例如，可以为5体积%、7体积 %、9体积%、11体积%、13体积%、15体积%。
根据本发明，接种至所述发酵培养基中的发酵菌种优选为活化后的发酵种子液，所述发酵种子液的OD600值优选为3-5。
其中，所述活化的方式可以采用本领域常规的技术手段，例如，将低温保藏菌种接种至种子培养基中进行活化培养。所述种子培养基可以含有5-10g/L的酵母粉、10-15g/L的蛋白胨以及50-60g/L的氯化钠，高温高压灭菌即得。
其中，所述活化培养的条件优选包括：温度为30-40℃，转速为150-250rpm，培养至OD600达到3-5。
其中，所述活化培养优选为多级活化培养，例如，2-3级，从而得到充分活化后的种子液。
步骤（2）
根据本发明，所述第一固液分离的方法可以按照本领域常规的操作进行，例如，可以为自然沉降法、膜过滤法、离心分离法和板框过滤法中的至少一种。
根据本发明一种优选的实施方式，所述第一固液分离为板框过滤分离，所述板框过滤的滤布上预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层。
根据本发明，在第一固液分离中，该方法还优选对菌体沉淀（滤饼）残留的发酵液进行去除，例如，通过压缩空气吹扫的方法，将滤饼中残留的发酵液吹出，所述压缩空气的压力可以为0.05-0.8MPa，优选为0.1-0.6MPa，进一步优选为0.3-0.6MPa。
根据本发明，优选的，在对所述菌体沉淀破壁之前，该方法还包括对第一固液分离所得菌体沉淀进行水洗，以进一步去除残留的发酵液。所述水洗的方法可以包括，将所得菌体浸泡在洗涤用水中10-120min，优选30-90min，更优选为40-60min。其中，所述洗涤用水的用量优选能够浸过所述菌体沉淀。
其中，所述洗涤用水可以为纯净水。
根据本发明，所述水洗的次数可以为2-5次。
其中，所述水洗优选为逆流水洗或旋流洗涤，更优选为逆流洗涤，也即，将n+1次洗涤分离出的水洗液用作第n次的洗涤用水。
根据本发明，水洗结束后，可以采用与第一固液分离相同的方法获得菌体沉淀。
根据本发明，所述水洗步骤结束后分离出的水洗液也可以作为所述PHA工艺废水用作所述发酵培养基的至少部分配液水。
步骤（3）
根据本发明，所述破壁的方法可以为本领域常规的对菌体进行破壁的方法，例如但不限于，有机溶剂法、物理机械破碎法、表面活性剂法、酶法、碱法和加压加热法中的至少一种。
根据本发明一种优选的实施方式，所述破壁的方法包括加压加热法，该方法不会引入第三组分，从而可有效的提高最终PHA产物的纯度。优选的，所述蒸煮法破壁的条件优选包括温度为60-200℃，压力为0.1-0.3MPa，搅拌转速为50-450rpm，时间为10-240min小时；更优选，温度为90-135℃，压力为0.1-0.25MPa，搅拌转速为80-400rpm，时间为20-150min。在该优选的范围内，能够进一步提高最终所得PHA的回收率和纯度。
根据本发明一种优选的实施方式，所述破壁的方法包括依次进行的酶法（例如，可以为溶菌酶、蛋白酶和脂肪酶中的至少一种）和有机溶剂法（例如，SDS法）。优选的，（1）在溶菌酶的存在下，将菌体沉淀进行第一破壁，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液；（2）将所述第一浆液进行固液分离，得到含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀；（3）在SDS的存在下，将所述含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀进行第二破壁，得到破壁产物。
其中，所述菌体沉淀可以以菌悬液形式存在，其中，所述菌悬液中溶菌酶的可以含量为0.05-1g/L（例如，可以为0.05 g/L、0.10 g/L、0.15 g/L、0.2 g/L、0.25 g/L、0.3 g/L、0.35 g/L、0.4 g/L、0.45 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L、0.8 g/L、0.9 g/L、1 g/L，或者上述数值之间的任意值），进一步优选为0.1-0.5 g/L。
优选地，制备所述菌悬液使用的水的量与所述菌体沉淀的体积比为0.5-5:1（例如，可以为0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、5:1，或者上述数值之间的任意值），更优选为0.8-2:1。
优选地，在pH值为4-9的条件下进行所述第一破壁。
本发明中，对所述第一破壁的时间没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，所述第一破壁的时间为60-240min（例如，可以为60min、80min、100min、120min、150min、180min、200min、220min、240min，或者上述数值之间的任意值），优选为90-150min。
本发明中，对所述第一破壁的温度没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，所述第一破壁的温度为20-50℃（例如，可以为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃，或者上述数值之间的任意值），优选为30-40℃。
本发明中，优选地，在进行第一破壁的同时进行搅拌，搅拌转速为50-350rpm（比如，可以为50rpm、55rpm、60rpm、80rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm，或者上述数值之间的任意值），优选为200-300rpm。
本发明中，优选地，在进行SDS破壁前，该方法还包括先将所得的含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀与水混合得到悬浊液。
更优选地，制备所述悬浊液使用的水的用量与所述沉淀的体积比为0.5-5:1（例如，可以为0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1、0.9:1、1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1、4:1、5:1，或者上述数值之间的任意值），更优选为0.8-2:1。
本发明中，优选地，所述SDS与所述含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀的重量比为0.05-0.3:1000，更优选为0.08-0.1:1000。
优选地，在pH值为8-11.5的条件下进行第二破壁。
本发明中，对所述第二破壁的时间没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，，所述第二破壁的时间为20-180min（例如，可以为20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min、120min、150min、180min，或者上述数值之间的任意值），优选为60-90min。
本发明中，对所述第二破壁的温度没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，在第二破壁的温度为60-90℃（例如，可以为60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，或者上述数值之间的任意值），优选为70-80℃。
本发明中，为了进一步提高对菌体细胞的破碎效果，更优选地，在进行第二破壁的同时进行搅拌，搅拌转速为50-350rpm（50rpm、55rpm、60rpm、80rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm，或者上述数值之间的任意值），优选为100-300rpm。
根据本发明一种优选的实施方式，所述破壁的方法包括碱法，例如，在氨水的存在下进行破壁。例如，可以按照如上的方法对菌体沉淀进行重悬，得到菌悬液，然后向所述菌悬液中加入氨水进行破壁。
优选地，所述菌悬液中，以NH4OH计的氨的浓度为0.1-1mol/L（例如，可以为0.1mol/L、0.2 mol/L、0.3 mol/L、0.4 mol/L、0.5 mol/L、0.6 mol/L、0.7 mol/L、0.8 mol/L、0.9 mol/L、1.0 mol/L，或者上述数值之间的任意值），优选为0.2-0.5mol/L。
其中，对氨水破壁的时间没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，时间为20-180min（例如，20min、30min、40min、50min、60min、80min、100min、120min、150min、180min，或者上述数值之间的任意值），优选为60-90min。
本发明中，对氨水破壁的温度没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，温度为60-90℃（例如，60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，或者上述数值之间的任意值），优选为70-80℃。
本发明中，优选的，在氨水破壁的同时进行搅拌，优选地，搅拌转速为50-350rpm（50rpm、55rpm、60rpm、80rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm、250rpm、300rpm、350rpm，或者上述数值之间的任意值），优选为200-300rpm。
根据本发明，为了进一步提高破壁效果，从而提高PHA的收率，还优选在进行非物理机械破碎法破壁的同时结合物理机械破碎法破壁，例如，超声和/或均质的方法。
本发明的发明人经过研究发现，以超声波进行辅助提取，可以显著的缓解PHA的降解情况，进而使得得到的PHA具有较高的聚合度。本发明中，聚羟基脂肪酸酯的聚合度即平均聚合度，指的是聚合物分子中羟基脂肪酸单体的数量，通过重均分子量进行表征。可以理解的是聚羟基脂肪酸酯的聚合度与其重均分子量为正相关关系。
本发明中，对所述超声的功率没有特别的限制，可以在较宽的范围内进行选择，优选地，所述超声的功率为200-2000W/ m3物料（比如，可以为200 W/ m3物料、300 W/ m3物料、500 W/ m3物料、800 W/ m3物料、1000 W/ m3物料、1500 W/ m3物料、2000 W/ m3物料，或者上述数值之间的任意值），优选为300-1000 W/ m3物料。
本发明的发明人在研究中发现，在进行超声破碎的过程中通过阶段性控制超声的功率，能够更加显著地保存PHA的聚合度和分子均一度，即使得得到的PHA具有更高的聚合度和分子量，提高PHA的产品品质。
优选地，所述超声的控制方式包括：先进行第一超声，然后再进行第二超声，其中，所述第二超声的功率比所述第一超声的功率高100-200 W/m3菌悬液。更优选地，所述第一超声的功率为300-800 W/m3菌悬液。优选的，第一超声的时间为总破壁时间（总超声时间）的1/5-1/2。
根据本发明，所述均质的条件可以在较宽的范围内进行改变，优选的，均质的压力为0.5-2.5MPa，优选为1-2MPa。
根据本发明，所述物理机械破碎法可以结合到所述加压加热法中，可以结合到有机溶剂法（例如，SDS法）和酶法的组合破壁工艺中的任何一个阶段，例如，酶法破壁阶段或SDS破壁阶段，也可以结合到氨水破壁工艺中。
根据本发明，优选的，在所述菌体沉淀进行破壁之前，还包括将菌体沉淀的pH值调节至为6-11，更优选为7-10。
根据本发明，在将所得破壁产物进行板框过滤之前，该方法还优选包括对所述破壁产物进行除杂纯化的处理。发明人发现，在对所述菌体沉淀破壁之后，破壁产物中主要包括PHA、菌体细胞壁以及各种细菌内的各种胞内成分，而PHA和细胞壁基本不溶于水。根据本发明一种优选的实施方式，使用离心的方法将所述破壁产物进行除杂，所述离心的条件使得细胞壁等杂质在上层，PHA在下层。如此，上层中不仅包含了大部分的大分子等不溶性杂质，还包括了所有的可溶性杂质，而下层主要为PHA不溶性物质。其中，所述离心优选使用碟片式离心机。
进一步优选的，板框过滤前，还包括将得到PHA沉淀物进行水洗，以进一步去除残留的液相。所述水洗的方法可以包括，将所得PHA沉淀物浸泡在洗涤用水中10-120min，优选30-90min，更优选为40-60min。其中，所述洗涤用水的用量优选能够浸过所述PHA沉淀物。
其中，所述洗涤用水可以为纯净水。
根据本发明，所述水洗的次数可以为2-5次。
其中，所述水洗优选为逆流水洗或旋流洗涤，更优选为逆流洗涤，也即，将n+1次洗涤分离出的水洗液用作第n次的洗涤用水。
根据本发明，所述水洗步骤结束后分离出的水洗液也可以作为所述PHA工艺废水用作所述发酵培养基的至少部分配液水。
本发明中，优选地，所述板框过滤所使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的粒径。需要说明的是，“所述滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的粒径”并非是指所述滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的每一个聚羟基脂肪酸酯的颗粒的粒径均大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的每一个聚羟基脂肪酸酯颗粒的粒径，而是指所述滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的平均粒径大于所述浆液中的聚羟基脂肪酸酯的平均粒径。
优选地，所述板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的粒径为1-200µm。
本发明中，为了进一步提高聚羟基脂肪酸酯的纯度，优选地，所述板框过滤分离使用的滤布表面涂覆的聚羟基脂肪酸酯的厚度为1-30mm，优选为5-10mm。
优选地，预涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为为1-25µm，更优选为2-23µm。
本发明中，在所述滤布表面涂覆聚羟基脂肪酸酯的方法优选包括：先将聚羟基脂肪酸酯与水混合配制成悬浮液，然后将所得悬浮液涂覆在滤布表面，得到涂覆聚羟基脂肪酸酯的滤布。
本发明中，根据实际需要，还可以将所得聚羟基脂肪酸酯进行干燥，可以为喷雾干燥、真空干燥、流化床干燥、气流干燥。优选为喷雾干燥，进分口温度为80-200℃，优选的，为100-180℃，更优选的，为120-180℃。
PHA工艺废水回用
根据本发明，为了更为有效的利用资源并保证PHA的发酵效率，本发明还包括对如上各阶段所获得的PHA工艺废水，例如，发酵清液，菌体沉淀洗涤水以及PHA沉淀物洗涤水进行除杂处理，除杂处理的方法包括但不限于吸附法、氧化法、膜分离法、色谱分离法和蒸煮法。处理后的发酵工艺废水回用到发酵过程。
吸附法
在所述吸附法中，具体可以包括向所述PHA工艺废水中加入吸附剂，以对其中的杂质进行吸附处理，得到回用清液。
能够清楚的是，本发明希望的是能够重复利用PHA工艺废水中的无机盐，因此，所述吸附剂的选择需要以其基本不会吸附PHA工艺废水中的无机盐，且能够高效吸附PHA工艺废水中对PHA发酵菌种有害的有机物为基准。如此，当将处理后的清液进行重复利用时，在PHA发酵培养基配制的过程中，一方面节省了配料水的使用，另一方面减少了无机盐的使用，再一方面减少了三废的排放和处理压力。根据本发明一种优选的实施方式，所述吸附剂选自炭质吸附材料、树脂、铝矾土、硅藻土、非金属氧化物类吸附材料和金属氧化物类吸附材料中的一种或多种，更优选的，所述吸附剂为炭质吸附材料，优选为碳柱和/或活性炭。
根据本发明一种更为优选的实施方式，所述吸附剂为活性炭和碳柱的混合吸附剂，其中，活性炭和碳柱的用量比为1:0.5-2，更优选为1:0.8-1.5，例如，可以为1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5。
根据本发明，所述吸附剂的用量可以在较宽的范围内进行选择，优选的，为了提高对所述PHA工艺废水的处理效率，进而降低PHA生成成本且保障后续PHA的发酵效率，相对于1L的所述PHA工艺废水，所述吸附剂的用量为2-200g，例如，可以为2g、5g、12g、22g、35g、55g、90g、120g、150g、180g、200g，更优选为10-50g，例如，可以为10g、12g、15g、20g、22g、25g、30g、35g、40g、45g、50g。
根据本发明，所述吸附的条件可以在较宽的范围内进行选择，优选的，为了提高对所述发酵液的处理效率，进而降低PHA生产成本且保障后续PHA的发酵效率，所述吸附在搅拌的条件下进行，所述吸附的温度为0-40℃，例如，可以为0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，更优选为15-30℃；所述吸附的时间为5-120min，例如，可以为5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min、70min、80min、90min、100min、110min、120min，更优选为20-40min；所述搅拌的速度为50-1000rpm，例如，可以为50rpm、80rpm、100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm、300rpm、400rpm、500rpm、600rpm、700rpm、800rpm、900rpm、1000rpm，更优选为100-150rpm。
根据本发明，优选的，该方法还包括将处理后的清液进行固液分离，得到回用清液和吸附剂废弃物；然后将所述回用清液循环至聚羟基脂肪酸酯的发酵阶段用于配制聚羟基脂肪酸酯的发酵培养基，所述固体吸附剂废弃物进入吸附剂再生处理阶段。
其中，对处理后的清液进行固液分离的方法可以为常规的固液分离方法，只要能够有效地将吸附后产生的固液与液相进行有效分离即可，例如，可以采用静置的方法，可以采用过滤的方法，还可以采用离心的方法等等。根据本发明一种优选的处理方式，为了进一步降低PHA生产成本，同时保障含盐发酵废液回用后PHA发酵菌种的发酵效率，所述固液分离的方式为过滤；优选的，所述过滤使用板框过滤；所述过滤的条件包括：温度为0-40℃，压力为0.1-0.6MPa，时间为0.5-5小时；优选的，温度为15-25℃，压力为0.2-0.3MPa，时间为2-3h。
根据本发明，对所述吸附剂废弃物进行再生的方法可以采用本领域常规的吸附剂再生方法，例如，可以包括高温加热和脱盐处理。其中，所述高温加热可以在高温再生炉中进行，所述高温加热的温度优选使得吸附剂上吸附的有机物通过挥发或分解而得到脱除。所述脱盐可以通过水洗的方式进行，例如，将高温加热后的吸附剂冷却后送入水洗罐进行水洗脱盐。
根据本发明，优选的，该方法还包括将水洗后的吸附剂进行固液分离，分离得到的固相可以作为固体吸附剂用于下一次吸附分离，得到的液相可以用于作为所述PHA工艺废水。该固液分离优选使用板框过滤机进行过滤。
氧化法
在所述氧化法中，具体可以包括：向所述PHA工艺废水中加入氧化剂，以对所述PHA工艺废水进行氧化处理，得到回用清液。
根据本发明，所述氧化剂可以为常规的各种氧化剂，但本发明的发明人在研究中发现，通过以双氧水、次氯酸和次氯酸钠中的至少一种作为氧化剂能够进一步提高本发明的效果。因此，优选的，所述氧化剂选自双氧水、次氯酸、次氯酸钠中的至少一种。
根据本发明一种更为优选的实施方式，所述氧化剂为双氧水或次氯酸钠。
根据本发明，所述氧化剂的用量可以在较宽的范围内进行选择，优选的，为了提高对所述PHA工艺废水的处理效率，进而降低PHA生成成本且保障后续PHA的发酵效率，所述氧化剂的用量使得在所述PHA工艺废水中，所述氧化剂的浓度为0.5-30重量%，例如，0.5重量%、1.5重量%、2.5重量%、5重量%、8重量%、12重量%、15重量%、18重量%、20重量%、25重量%、30重量%，更优选为5-18重量%。
根据本发明，所述氧化处理的条件可以在较宽的范围内进行选择，优选的，为了提高对所述PHA工艺废水的处理效率，进而降低PHA生产成本且保障后续PHA的发酵效率，所述氧化处理在搅拌的条件下进行，所述氧化处理的温度为15-45℃，例如，可以为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，更优选为20-30℃；所述氧化处理的时间为10-300min，例如，可以为10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、75min、100min、125min、150min、175min、200min、225min、250min、275min、300min，更优选为120-240min；所述搅拌的速度为200-1500rpm，例如，可以为200rpm、300rpm、500rpm、700rpm、1000rpm、1300rpm、1500rpm，更优选为800-1200rpm。
根据本发明，为了进一步提高本发明的效果，优选的，该方法还包括将氧化处理后的液相进行二氧化锰后处理、光照后处理或酸后处理。
其中，当所述氧化剂为双氧水时，优选进行二氧化锰后处理；当所述氧化剂为次氯酸时，优选进行光照后处理；当所述氧化剂为次氯酸钠时，优选进行酸后处理，所述酸可以为盐酸。
进一步优选的，如上各项后处理在搅拌的条件下进行接触，温度为15-45℃，例如，可以为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃，更优选为15-35℃；时间为10-300min，例如，可以为10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、75min、100min、125min、150min、175min、200min、225min、250min、275min、300min，更优选为20-40min；所述搅拌速度为200-1500rpm，例如，可以为200rpm、300rpm、500rpm、700rpm、1000rpm、1300rpm、1500rpm，更优选为500-1000rpm。
根据本发明，优选的，该方法还包括将氧化处理后的液相进行固液分离，得到回用清液和固体颗粒；所述回用清液可以循环至聚羟基脂肪酸酯的发酵阶段用于配制聚羟基脂肪酸酯的发酵培养基，所述固体颗粒可以根据需要再进行下一步处理。
膜分离法
在所述膜分离法中，具体可以包括：将所述PHA工艺废水进行膜过滤，以对其中的杂质进行脱除，得到回用清液。
根据本发明一种优选的实施方式，为了进一步提高PHA工艺废水的处理效果，所述膜过滤包括依次进行的陶瓷膜过滤和超滤膜过滤。在该优选的情况下，通过陶瓷膜过滤可以将PHA工艺废水中残留的小分子固体悬浮物进行一步去除，然后再通过超滤膜过滤将更小的悬浮物和不溶性菌体碎片、变性蛋白、细胞毒素、色素等难以被利用的物质去除，从而得到能够重复利用的盐液。根据本发明，所述陶瓷膜（无机陶瓷膜）的孔径选择，如上所述的，优选使得PHA工艺废水中残留的小分子固体悬浮物被进一步去除。优选的，所述陶瓷膜的孔径为10-60nm，进一步优选为20-50nm（例如，可以为20 nm、25 nm、30 nm、35 nm、40 nm、45 nm、50 nm）；所述陶瓷膜过滤的压力可以为0.1-0.5MPa（例如，可以为0.1 MPa、0.15MPa、0.2 MPa、0.25 MPa、0.3 MPa、0.35 MPa、0.4 MPa、0.45 MPa、0.5 MPa），优选为0.2-0.4MPa。其中，所述陶瓷膜可以通过商购获得，例如，供应商为江苏久吾高科技股份有限公司。
根据本发明，所述超滤膜的孔径选择，如上所述的，优选使得PHA工艺废水中更小的悬浮物和大分子有机物去除被去除。优选的，所述超滤膜的截留重均分子量在800道尔顿以上，优选为800-6000 Da，进一步优选为1000-5000Da（例如，可以为1000 Da、1500 Da、2000 Da、2500 Da 3000 Da、3500 Da、4000 Da、4500 Da、5000 Da）；所述超滤膜过滤的压力可以为0.2-1MPa（例如，可以为0.2MPa、0.3 MPa、0.4MPa、0.5 MPa、0.6 MPa、0.8 MPa、1MPa），优选为0.3-0.6MPa。其中，所述超滤膜可以通过商购获得，例如，可以购自上海赛奥分离技术工程有限公司。
色谱分离法
在所述色谱分离法中，具体可以包括将所述发酵清液在色谱柱中进行色谱吸附处理，得到回用清液。
根据本发明，所述色谱吸附处理所用的色谱分离介质可以为常规的各种色谱吸附介质，例如，可以为非极性大孔吸附树脂、弱极性大孔吸附树脂色、强极性大孔吸附树脂和离子交换树脂的一种或多种。根据本发明一种特别优选的实施方式，所述色谱吸附介质为离子交换树脂，更优选为阴离子交换树脂，例如，强碱性阴离子交换树脂或弱碱性阴离子交换树脂，例如，LX-98、LSA-700或LSA-700B，这些可以购自西安蓝晚晓科技新材料股分有限公司，又例如，DA201A、DA201B、DA201M、201*7，这些可购自江苏苏青水处理工程集团有限公司，又例如，D201，可购自廊坊市南大树脂有限公司。
本发明对所述阴离子交换树脂的种类没有特别的限制，可以为本领域技术人员所公知的各种强碱性阴离子交换树脂和/或弱碱性阴离子交换树脂。所述强碱性阴离子交换树脂可以为强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂和/或强碱性苯乙二烯系阴离子交换树脂。所述弱碱性阴离子交换树脂可以为弱碱性苯乙烯系阴离子交换树脂和/或弱碱性苯乙二烯系阴离子交换树脂。
本发明优选所述阴离子交换树脂为强碱性阴离子交换树脂，例如，强碱性苯乙烯系阴离子交换树脂和/或强碱性苯乙二烯系阴离子交换树脂。最优选的，所述强碱性阴离子交换树脂为D201，可购自廊坊市南大树脂有限公司。
根据本发明，所述色谱吸附的条件可以采用常规的色谱吸附条件。优选的，为了进一步提高本发明的效果，所述色谱吸附处理的温度为0-40℃，例如，可以为0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃，更优选为15-25℃。
根据本发明，所述PHA工艺废水在色谱柱中流动的速度可以在较宽的范围内选择，优选的，为了进一步提高色谱吸附处理的效果，所述色谱吸附处理的温度为0-40℃，所述PHA工艺废水在色谱柱中的流动速度为1-3BV/h，例如，可以为1BV/h、1.5BV/h、2BV/h、2.5BV/h、3BV/h，更优选为1.5-2.5BV/h。
根据本发明，所述色谱柱的体积可以为本领域常规的色谱柱体积，优选的，所述色谱柱的体积为5-100ml。
根据本发明，本发明的方法还可以包括对所述色谱柱进行再生，所述再生的方法可以采用本领域常规的色谱柱再生方法，例如，可以包括碱处理和水洗。其中，具体的，所述再生的方法可以包括：用数倍（2-5）于柱体积的浓度为2-4重量%的氢氧化钠溶液再生树脂柱，流速为1-3BV/h，温度为15-25℃。氢氧化钠溶液再生结束后，纯净水洗脱和出口液pH为6-8。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
一、PHA发酵工艺对发酵性能的影响
发酵罐体积5L，此外，本发明的方法也适用于大规模发酵，例如，10000L的发酵设备。
实施例1——高盐糖蜜为碳源
高盐甘蔗糖蜜1为甘蔗精炼制糖工艺所产生的废料，呈浓稠液体状，含盐量约10重量百分比，以干固计，糖含量约51重量百分比，含有葡萄糖、蔗糖和果糖，以总糖计，葡萄糖含量11重量百分比，蔗糖含量81重量百分比，果糖含量8重量百分比；
高盐甘蔗糖蜜2为甘蔗精炼制糖工艺所产生的废料，呈浓稠液体状，含盐量约9重量百分比，以干固计，糖含量约60重量百分比，含有葡萄糖、蔗糖和果糖，以总糖计，葡萄糖含量15重量百分比，蔗糖含量75重量百分比，果糖含量10重量百分比；
高盐甘蔗糖蜜3为甘蔗精炼制糖工艺所产生的废料，呈浓稠液体状，含盐量约11重量百分比，以干固计，糖含量约70重量百分比，含有葡萄糖、蔗糖和果糖，以总糖计，葡萄糖含量10重量百分比，蔗糖含量85重量百分比，果糖含量5重量百分比；
高盐甜菜糖蜜4为甘蔗精炼制糖工艺所产生的废料，呈浓稠液体状，含盐量约8重量百分比，以干固计，糖含量约40重量百分比，含有葡萄糖、蔗糖和果糖，以总糖计，葡萄糖含量5重量百分比，蔗糖含量83重量百分比，果糖含量12重量百分比；
糖含量根据SBA-90生物传感分析仪方法测定；
发酵液中盐单胞菌生物量的测定方法为取25-45 ml发酵液离心（8000rpm，10min）留沉淀，无菌水洗涤2次，使用真空冷冻干燥机对洗涤后的沉淀进行干燥48h后称重；
参照文献：Chung A , Liu Q , Ouyang S P , et al. Microbial productionof 3-hydroxydodecanoic acid by phaoperon and fadBA knockout mutant ofPseudomonas putida KT2442 harboring tesB gene[J]. Applied Microbiology &Biotechnology, 2009, 83(3):513-519. 从发酵液中进行PHA的提取；
制备例1-1
本制备例用于说明发酵菌种的活化
种子培养基：含有8g/L的酵母粉、12g/L的蛋白胨以及55g/L的氯化钠。
将盐单胞菌接种于种子培养基中在37℃和200rpm的条件下进行一级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到一级种子液；
将所述一级种子液以10体积百分比的接种量接种于种子培养基中，在37℃和200rpm的条件下进行二级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到二级种子液，得到发酵种子液。
实施例1-1
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜1的含量为25mL、酵母粉的含量为17g、磷酸氢二钾的含量为3.5g、磷酸氢二钠的含量为6.2g、硫酸镁的含量为0.25g、氯化钠的含量为55g。调节pH至8.5。
补料一：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为16:1。其中，相对于1L的第一营养物质，高盐糖蜜1 640 mL，酵母粉108g；补料一与发酵培养基的用量体积比为9：100。
补料二：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为40:1。其中，相对于1L的第二营养物质，糖蜜900mL，酵母粉69.4g；补料二与发酵培养基的用量体积比为6：100。
补料三：以纯高盐糖蜜1为碳源，补料三与发酵培养基的用量体积比为23:100。
将制备例制得的种子液以10体积百分比的接种量接种于发酵培养基中，在37℃以及1vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.5左右，溶氧量控制在10-30百分比。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-10h，所述搅拌的转速为400rpm；发酵10-18h，所述搅拌的转速为800rpm；发酵18h至发酵结束，所述搅拌的转速为400rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至6g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在10g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。
实施例1-2
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜1的含量为35ml、酵母粉的含量为15g、磷酸氢二钾的含量为2.5g、磷酸氢二钠的含量为6.5g、硫酸镁的含量为0.3、氯化钠的含量为45g。调节pH至8.3。
补料一：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为15:1。其中，相对于1L的第一营养物质，高盐糖蜜1 783 mL，酵母粉120 g；补料一与发酵培养基的用量体积比为10：100。
补料二：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为38:1。其中，相对于1L的第二营养物质，糖蜜830 mL，酵母粉80 g；补料二与发酵培养基的用量体积比为7：100。
补料三：以纯高盐糖蜜1为碳源，补料三与发酵培养基的用量体积比为25:100。
将制备例制得到的种子液以12体积百分比的接种量接种于发酵培养基中，在35℃以及1.1vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.3左右，溶氧量控制在10-30百分比。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-9h，所述搅拌的转速为500rpm；发酵9-17h，所述搅拌的转速为900rpm；发酵17h至发酵结束，所述搅拌的转速为500rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至5g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在8g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。
实施例1-3
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜1的含量为15ml、酵母粉的含量为16g、磷酸氢二钾的含量为4g、磷酸氢二钠的含量为5.5g、硫酸镁的含量为0.2g、氯化钠的含量为50g。调节pH至8.7。
补料一：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为17:1。其中，相对于1L的第一营养物质，高盐糖蜜1 560 mL，酵母粉91g；补料一与发酵培养基的用量体积比为11：100。
补料二：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为42:1。其中，相对于1L的第二营养物质，糖蜜875 mL，酵母粉58g；补料二与发酵培养基的用量体积比为8：100。
补料三：以纯高盐糖蜜1为碳源，补料三与发酵培养基的用量体积比为27:100。
将制备例制得到的种子液以15体积百分比的接种量接种于发酵培养基中，在39℃以及1.2vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.7左右，溶氧量控制在10-30百分比。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-11h，所述搅拌的转速为600rpm；发酵11-19h，所述搅拌的转速为1000rpm；发酵19h至发酵结束，所述搅拌的转速为600rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至8g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在15g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。
实施例1-4
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜1的含量为40ml、酵母粉的含量为10g、磷酸氢二钾的含量为2.0g、磷酸氢二钠的含量为5.0g、硫酸镁的含量为0.15g、氯化钠的含量为40g。调节pH至8.0。
补料一：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为18:1。其中，相对于1L的第一营养物质，高盐糖蜜1 750 mL，酵母粉116 g；补料一与发酵培养基的用量体积比为8：100。
补料二：以高盐糖蜜1为碳源，酵母粉为氮源；碳氮比为34:1。其中，相对于1L的第二营养物质，糖蜜900 mL，酵母粉74 g；补料二与发酵培养基的用量体积比为5：100。
补料三：以纯高盐糖蜜1为碳源，补料三与发酵培养基的用量体积比为20:100。
将制备例制得到的种子液以10体积百分比的接种量接种于发酵培养基中，在30℃以及1.5vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8左右。此外，在发酵的过程中转速控制在800rpm左右。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至10g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在5g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。
实施例1-5
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：相对于1L发酵培养基，高盐糖蜜1的含量为15ml、酵母粉的含量为20g、磷酸氢二钾的含量为5g、磷酸氢二钠的含量为8g、硫酸镁的含量为0.5g、氯化钠的含量为70g。调节pH至9。
补料：使用实施例1补料一。补料与发酵培养基的用量体积比为42:100。
将制备例制得到的种子液以10体积百分比的接种量接种于发酵培养基中，在45℃以及0.5vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在9左右，溶氧量控制在10-30百分比。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-12h，所述搅拌的转速为400rpm；发酵12-20h，所述搅拌的转速为800rpm；发酵20h至发酵结束，所述搅拌的转速为400rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至12g/L以下时，仅流加补料一。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在20g/L左右，补料流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。
实施例1-6
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
按照实施例1-1的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的高盐甘蔗糖蜜2。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。
实施例1-7
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
按照实施例1-1的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的高盐甘蔗糖蜜3。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。
实施例1-8
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
按照实施例1-1的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的高盐甜菜糖蜜4。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。
对比例1-1
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
按照实施例1-4的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的低盐糖蜜，并通过调节发酵培养基中氯化钠的含量使得与实施例4发酵培养基中氯化钠含量相同。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。
对比例1-2
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
按照实施例1-4的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的葡萄糖、蔗糖和果糖的混合物，并通过调节发酵培养基中氯化钠的含量使得与实施例4发酵培养基中氯化钠含量相同。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。
对比例1-3
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
按照实施例1-4的方法进行PHA的制备，不同的是，将所述高盐糖蜜1替换为等量的葡萄糖，并通过调节发酵培养基中氯化钠的含量使得与实施例4发酵培养基中氯化钠含量相同。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表1所示。
表1
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通过表1的结果可以看出，将实施例1-4与对比例1-1至1-2相比，采用本发明技术方案能够有效降低PHA的生产成本，将实施例1-4与对比例1-3相比，采用本发明技术方案不仅能够有效降低PHA的生产成本，还能够提高发酵液中菌体生物量以及PHA的产量。将实施例1-1至1-3与实施例1-4至1-5相比可以看出，将发酵过程控制在本发明的优选方式下，能够进一步降低成本，提高发酵液中菌体生物量以及PHA的产量。将实施例1-1、1-6和1-7与实施例1-8相比可以看出，选择特定的高盐糖蜜，并且将高盐糖蜜的盐含量和糖含量控制在本发明的范围内，能够进一步提高发酵效果。
实施例2——玉米浆液作为氮源
PHA发酵菌种如上实施例1；
糖含量、发酵液中盐单胞菌生物量的测定方法、从发酵液中进行PHA的提取方法如实施例1；
玉米浆来自中粮生化能源(榆树)有限公司。
制备例2-1
本制备例用于说明发酵菌种的活化
如制备例1-1。
制备例2-2
本制备例用于说明酶解玉米浆的制备
1）在固含量为45重量%的玉米浆中加入纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶，相对于1000重量份的玉米浆，纤维素酶的用量为0.09重量份、半纤维素的用量为0.09重量份、淀粉酶的用量为0.04重量份、酸性蛋白酶的用量为0.15重量份；
2）在搅拌的转速为650rpm，温度为47℃、pH值为5.5条件下，酶解35min，停止搅拌得到酶解产物，将所得酶解产物进行陶瓷膜过滤（滤膜孔径为250nm），得到酶解玉米浆。
对比制备例2-1
用于说明参比的酶解玉米浆的制备
按照制备例2-2的方法进行酶解玉米浆的制备，不同的是，将纤维素酶调换为等量的半纤维素酶。
对比制备例2-2
用于说明参比的酶解玉米浆的制备
按照制备例2-2的方法进行酶解玉米浆的制备，不同的是，将纤维素酶调换为等量的蛋白酶。
对比制备例2-3
用于说明参比的酶解玉米浆的制备
按照制备例2-2的方法进行酶解玉米浆的制备，不同的是，酶解结束后，不对酶解产物进行过滤。
对比例2-1
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：相对于1L发酵培养基，玉米浆（固含量45重量%）的含量为32mL、葡萄糖的含量为15g、磷酸氢二钾的含量为3g、磷酸氢二钠的含量为6.8g、硫酸镁的含量为0.2g、氯化钠的含量为45g。调节pH至8.5。
补料一：碳氮比为14:1，相对于1L的第一营养物质，玉米浆的含量为552ml，葡萄糖的含量为540g；补料一与发酵培养基的用量体积比为9：100；
补料二：碳氮比为35:1，相对于1L的第二营养物质，玉米浆的含量为315ml，葡萄糖的含量为765g；补料二与发酵培养基的用量体积比为6：100；
补料三：相对于1L的第三营养物质，葡萄糖的含量为850g；补料三与发酵培养基的用量体积比为23:100。
将制备例制得的种子液以10体积%的接种量接种于发酵培养基中，在37℃以及1vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.5左右，溶氧量控制在10-30%。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-10h，所述搅拌的转速为400rpm；发酵10-18h，所述搅拌的转速为800rpm；发酵18h至发酵结束，所述搅拌的转速为400rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至6g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在10g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
实施例2-1
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
按照对比例2-1的方法进行PHA的发酵，不同的是，将玉米浆替换为制备例2制备的酶解玉米浆。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
对比例2-2
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：相对于1L发酵培养基，玉米浆（固含量40重量%）的含量为34mL、葡萄糖的含量为25g、磷酸氢二钾的含量为3.5g、磷酸氢二钠的含量为6g、硫酸镁的含量为0..52g、氯化钠的含量为50g。调节pH至8.3。
补料一：碳氮比为16:1，相对于1L的第一营养物质，玉米浆的含量为504ml，葡萄糖的含量为560g；补料一与发酵培养基的用量体积比为10：100；
补料二：碳氮比为40:1，相对于1L的第二营养物质，玉米浆的含量为282ml，葡萄糖的含量为794g；补料二与发酵培养基的用量体积比为7：100；
补料三：相对于1L的第三营养物质，葡萄糖的含量为800g；补料三与发酵培养基的用量体积比为25:100。
将制备例制得到的种子液以12体积%的接种量接种于发酵培养基中，在35℃以及1.1vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.3左右，溶氧量控制在10-30%。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-9h，所述搅拌的转速为500rpm；发酵9-17h，所述搅拌的转速为900rpm；发酵17h至发酵结束，所述搅拌的转速为500rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至5g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在8g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
实施例2-2
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
按照对比例2-2的方法进行PHA的发酵，不同的是，将玉米浆替换为制备例2制备的酶解玉米浆。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
对比例2-3
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：相对于1L发酵培养基，玉米浆（固含量50重量%）的含量为36mL、葡萄糖的含量为30g、磷酸氢二钾的含量为4g、磷酸氢二钠的含量为7.5g、硫酸镁的含量为0.3g、氯化钠的含量为55g。调节pH至8.7。
补料一：碳氮比为18:1，相对于1L的第一营养物质，玉米浆的含量为480ml，葡萄糖的含量为600g；补料一与发酵培养基的用量体积比为11：100；
补料二：碳氮比为45:1，相对于1L的第二营养物质，玉米浆的含量为272ml，葡萄糖的含量为850g；补料二与发酵培养基的用量体积比为8：100；
补料三：相对于1L的第三营养物质，葡萄糖的含量为750g；补料三与发酵培养基的用量体积比为27:100。
将制备例制得到的种子液以15体积%的接种量接种于发酵培养基中，在39℃以及1.2vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在8.7左右，溶氧量控制在10-30%。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-11h，所述搅拌的转速为600rpm；发酵11-19h，所述搅拌的转速为1000rpm；发酵19h至发酵结束，所述搅拌的转速为600rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至8g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在15g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
实施例2-3
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
按照对比例2-3的方法进行PHA的发酵，不同的是，将玉米浆替换为制备例2制备的酶解玉米浆。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
对比例2-4
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：相对于1L发酵培养基，玉米浆（固含量10重量%）的含量为5mL、葡萄糖的含量为10g、磷酸氢二钾的含量为2g、磷酸氢二钠的含量为4g、硫酸镁的含量为0.1g、氯化钠的含量为40g。调节pH至7。
补料一：碳氮比为10:1，相对于1L的第一营养物质，玉米浆的含量为690ml，葡萄糖的含量为480g，补料一与发酵培养基的用量体积比为8:100；
补料二：碳氮比为30：1，相对于1L的第二营养物质，玉米浆的含量为326ml，葡萄糖的含量为680g，补料二与发酵培养基的用量体积比为5:100；
补料三：相对于1L的第三营养物质，葡萄糖的含量为900g，补料三与发酵培养基的用量体积比为20:100。
将制备例制得到的种子液以10体积%的接种量接种于发酵培养基中，在30℃以及1.5vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在7左右。此外，在发酵的过程中转速控制在800rpm左右。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至10g/L以下时，流加补料一，当补料一结束时，流加补料二，当补料二结束时，流加补料三。
补料三的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在5g/L左右，补料三流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
实施例2-4
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
按照对比例2-4的方法进行PHA的发酵，不同的是，将玉米浆替换为制备例2制备的酶解玉米浆。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
对比例2-5
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
发酵培养基：相对于1L发酵培养基，玉米浆（固含量30重量%）的含量为45mL、葡萄糖的含量为35g、磷酸氢二钾的含量为5g、磷酸氢二钠的含量为11g、硫酸镁的含量为0.4g、氯化钠的含量为70g。调节pH至9。
补料：碳氮比为20:1，相对于1L的补料，玉米浆的含量为516ml，葡萄糖的含量为720g，补料与发酵培养基的用量体积比为42:100。
将制备例制得到的种子液以10体积%的接种量接种于发酵培养基中，在45℃以及0.5vvm通风量的条件下发酵培养，同时控制发酵过程中的pH在9左右，溶氧量控制在10-30%。此外，在发酵的过程中分阶段控制搅拌转速，发酵0-12h，所述搅拌的转速为400rpm；发酵12-20h，所述搅拌的转速为800rpm；发酵20h至发酵结束，所述搅拌的转速为400rpm。
在发酵的过程中，实时监测发酵体系的糖含量和pH。
当发酵体系中的糖含量第一次下降至12g/L以下时，仅流加补料一。
补料的流加速度使得发酵液中的糖含量维持在20g/L左右，补料流加结束后，继续发酵2小时结束发酵。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
实施例2-5
本实施例用于说明本发明提供的发酵制备PHA的方法
按照对比例2-5的方法进行PHA的发酵，不同的是，将玉米浆替换为制备例2制备的酶解玉米浆。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
对比例2-6
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
按照实施例2-4的方法进行PHA的制备，不同的是，以氮元素计，将所述酶解玉米浆替换为等量的尿素。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
对比例2-7
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
按照实施例2-4的方法进行PHA的制备，不同的是，以氮元素计，将所述酶解玉米浆替换为等量酵母粉。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
对比例2-8
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
按照实施例2-4的方法进行PHA的制备，不同的是，以氮元素计，将所述酶解玉米浆替换为对比例制备例1制备的酶解玉米浆。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
对比例2-9
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
按照实施例2-4的方法进行PHA的制备，不同的是，以氮元素计，将所述酶解玉米浆替换为对比例制备例2-2制备的酶解玉米浆。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
对比例2-10
本对比例用于说明参比的发酵制备PHA的方法
按照实施例2-4的方法进行PHA的制备，不同的是，以氮元素计，将所述酶解玉米浆替换为对比例制备例2-3制备的酶解玉米浆。
发酵液中盐单胞菌生物量、PHA产量以及单位产品的原料成本比较如表2所示。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE002
通过表2的结果可以看出，将实施例2-4与对比例2-6至2-7相比，采用本发明技术方案不仅能够有效降低PHA的生产成本，还能够提高发酵液中菌体生物量以及PHA的产量。将实施例2-1至2-3与实施例2-4至2-5相比可以看出，将发酵过程控制在本发明的优选方式下，能够进一步提高发酵液中菌体生物量以及PHA的产量。将实施例2-1至2-6与对比例2-1至2-6相比可以看出，将酶解玉米浆用于PHA发酵，能够更显著的提高发酵液中菌体生物量以及PHA的产量。将实施例2-4与对比例2-8至2-9相比可以看出，采用本发明的酶解方法能够提高发酵液中菌体生物量以及PHA的产量。同时，酶解玉米浆经过固液分离后还能够降低发酵液的色泽。
二、PHA工艺废水的处理
碟片式离心机购自南京华盛分离机械技术有限公司，型号DR203；
带式真空过滤机购自湖州核工惠能环保过滤科技有限公司，型号DY-500；
板框过滤机购自海宁市云飞过滤设备有限公司，型号YF-100-1；
聚羟基脂肪酸酯购自蓝晶生物科技有限公司，粒径1-50µm，用于涂覆在板框过滤机的滤布上形成聚羟基脂肪酸酯层；
PHA的回收率和纯度的检测方法参考文献（Engineering self-flocculatingHalomonas campaniensis for wastewaterless open and continuous fermentation[J], Biotechnology and Bioengineering, 2019,116:805-815）；
发酵液中盐单胞菌生物量以OD600值表示；
发酵菌种
盐单胞菌(Halomonas sp.)TD01，其保藏编号为CGMCC NO.4353（CN201010578858.8）。
种子培养基
5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨以及60g/L的氯化钠。
初始发酵培养基
氯化钠50g/L，葡萄糖50g/L，玉米浆粉15g/L，尿素2g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾5g/L，微量元素母液I 10mL/L，微量元素母液II 3mL/L。所述微量元素母液I和II，参照引用专利CN201010578858.8。
补料培养基
葡萄糖浓度600g/L，玉米浆粉40g/L。
发酵液的制备
本制备例用于说明聚羟基脂肪酸酯发酵液的制备
将盐单胞菌接种于种子培养基中在37℃和200rpm的条件下进行一级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到一级种子液；
将所述一级种子液以10体积%的接种量接种于种子培养基中，在37℃和200rpm的条件下进行二级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到二级种子液，得到发酵种子液。
然后将10体积％的接种量将二级种子液接入到初始发酵培养基中，发酵体系不灭菌直接发酵。控制温度37℃，转速控制600-1000 rpm，通风量0.5-2.0 vvm，初始溶氧控制在30%以上；发酵过程中通过补料控制糖浓度在5-20g/L之间，用NaOH控制发酵pH为8-9之间，发酵48小时。
实施例3——吸附法处理PHA工艺废水
吸附剂活性碳和碳柱，购于江苏竹溪活性炭有限公司；
吸附剂硅藻土，购于吉林远通矿业有限公司；
吸附剂铝矾土，购于灵寿县巨石矿产品加工厂。
实施例3-1
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（进入提取罐）和发酵残液顶流（固含量7重量%），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的发酵残液顶流泵入高效精密过滤机，对顶流中残留的菌体进行再一次过滤，过滤后的菌体进入步骤（1）的提取罐待下一步处理，滤液进入发酵残液（固含量5重量%）暂存罐进行下一步处理。
（3）将发酵残液暂存罐的发酵清液泵入吸附分离罐，向吸附分离罐中投加碳柱，相对于1L的发酵清液，所述吸附剂的用量为15g。所述吸附在搅拌的条件下进行，所述吸附的温度为20℃，所述吸附的时间为40min，所述搅拌的速度为120rpm。吸附结束后，在搅拌的同时将吸附分离罐中物料泵入板框分离机（20℃，0.25MPa，2.5h），滤出其中的固体，所得到的澄清液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
（4）将步骤（3）中的板框分离机排出的滤饼送入高温再生炉，通过高温处理，使吸附在吸附剂上的有机物通过挥发或分解而得到脱除；然后通过高温处理脱除了有机物而得到部分再生的吸附剂经冷却降温后，送入水洗罐进行水洗脱盐；水洗罐中脱盐后的物料通过板框分离机进行固液分离，分离得到的固体吸附剂用于下一次吸附分离。
实施例3-2
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（进入提取罐）和发酵残液顶流（固含量10重量%），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的发酵残液顶流泵入高效精密过滤机，对顶流中残留的菌体进行再一次过滤，过滤后的菌体进入步骤（1）的提取罐待下一步处理，滤液进入发酵残液（固含量8重量%）暂存罐进行下一步处理。
（3）将发酵残液暂存罐的发酵清液泵入吸附分离罐，向吸附分离罐中投加碳柱，相对于1L的发酵清液，所述吸附剂的用量为40g。所述吸附在搅拌的条件下进行，所述吸附的温度为15℃，所述吸附的时间为60min，所述搅拌的速度为100rpm。吸附结束后，在搅拌的同时将吸附分离罐中物料泵入板框分离机（15℃，0.3MPa，3h），滤出其中的固体颗粒，所得到的澄清液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
（4）将步骤（3）中的板框分离机排出的滤饼送入高温再生炉，通过高温处理，使吸附在吸附剂上的有机物通过挥发或分解而得到脱除；然后通过高温处理脱除了有机物而得到部分再生的吸附剂经冷却降温后，送入水洗罐进行水洗脱盐；水洗罐中脱盐后的物料通过板框分离机进行固液分离，分离得到的固体吸附剂用于下一次吸附分离。
实施例3-3
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（进入提取罐）和发酵残液顶流（固含量15重量%），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的发酵残液顶流泵入高效精密过滤机，对顶流中残留的菌体进行再一次过滤，过滤后的菌体进入步骤（1）的提取罐待下一步处理，滤液进入发酵残液（固含量10重量%）暂存罐进行下一步处理。
（3）将发酵残液暂存罐的发酵清液泵入吸附分离罐，向吸附分离罐中投加碳柱，相对于1L的发酵清液，所述吸附剂的用量为10g。所述吸附在搅拌的条件下进行，所述吸附的温度为25℃，所述吸附的时间为20min，所述搅拌的速度为150rpm。吸附结束后，在搅拌的同时将吸附分离罐中物料泵入板框分离机（25℃，0.2MPa，2h），滤出其中的固体颗粒，所得到的澄清液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
（4）将步骤（3）中的板框分离机排出的滤饼送入高温再生炉，通过高温处理，使吸附在吸附剂上的有机物通过挥发或分解而得到脱除；然后通过高温处理脱除了有机物而得到部分再生的吸附剂经冷却降温后，送入水洗罐进行水洗脱盐；水洗罐中脱盐后的物料通过板框分离机进行固液分离，分离得到的固体吸附剂用于下一次吸附分离。
实施例3-4
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（进入提取罐）和发酵残液顶流（固含量15重量%），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的发酵残液顶流泵入高效精密过滤机，对顶流中残留的菌体进行再一次过滤，过滤后的菌体进入步骤（1）的提取罐待下一步处理，滤液进入发酵残液（固含量10重量%）暂存罐进行下一步处理。
（3）将发酵残液暂存罐的发酵清液泵入吸附分离罐，向吸附分离罐中投加硅藻土，相对于1L的发酵清液，所述吸附剂的用量为18g。所述吸附在搅拌的条件下进行，所述吸附的温度为40℃，所述吸附的时间为10min，所述搅拌的速度为150rpm。吸附结束后，在搅拌的同时将吸附分离罐中物料泵入板框分离机（40℃，0.1MPa，1h），滤出其中的固体颗粒，所得到的澄清液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
（4）将步骤（3）中的板框分离机排出的滤饼送入高温再生炉，通过高温处理，使吸附在吸附剂上的有机物通过挥发或分解而得到脱除；然后通过高温处理脱除了有机物而得到部分再生的吸附剂经冷却降温后，送入水洗罐进行水洗脱盐；水洗罐中脱盐后的物料通过板框分离机进行固液分离，分离得到的固体吸附剂用于下一次吸附分离。
实施例3-5
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（进入提取罐）和发酵残液顶流（固含量5重量%），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的发酵残液顶流泵入高效精密过滤机，对顶流中残留的菌体进行再一次过滤，过滤后的菌体进入步骤（1）的提取罐待下一步处理，滤液进入发酵残液（固含量3重量%）暂存罐进行下一步处理。
（3）将发酵残液暂存罐的发酵清液泵入吸附分离罐，向吸附分离罐中投加铝矾土，相对于1L的发酵清液，所述吸附剂的用量为60g。所述吸附在搅拌的条件下进行，所述吸附的温度为10℃，所述吸附的时间为60min，所述搅拌的速度为50rpm。吸附结束后，在搅拌的同时将吸附分离罐中物料泵入板框分离机（10℃，0.5MPa，4h），滤出其中的固体颗粒，所得到的澄清液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
（4）将步骤（3）中的板框分离机排出的滤饼送入高温再生炉，通过高温处理，使吸附在吸附剂上的有机物通过挥发或分解而得到脱除；然后通过高温处理脱除了有机物而得到部分再生的吸附剂经冷却降温后，送入水洗罐进行水洗脱盐；水洗罐中脱盐后的物料通过板框分离机进行固液分离，分离得到的固体吸附剂用于下一次吸附分离。
实施例3-6
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
按照实施例1的方法进行聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理，不同的是，步骤（3）中，将板框过滤机过滤替换为使用带式真空过滤机进行过滤。
实施例3-7
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
按照实施例1的方法进行聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理，不同的是，步骤（1）中，使用板框过滤机进行过滤，步骤（2）中使用碟片式离心机进行离心分离。
实施例3-8
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
按照实施例1的方法进行聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理，不同的是，步骤（4）中，将碳柱替换为等量的活性碳颗粒和碳柱的混合吸附剂，其中，活性碳颗粒和碳柱的用量比为1:1。
测试例3-1至3-9
分别使用实施例3-1至3-8步骤（3）分离得到的澄清液用于发酵培养基的配制，并补充适当的无机盐使得配制的发酵培养基与初始发酵培养基相同，同时以初始发酵培养基作为对照。然后按照“发酵液的制备”的方法进行聚羟基脂肪酸酯的发酵液的制备，记录发酵液中生物量以及相对于利用初始发酵培养基，利用实施例3-1至3-8清液作为配液水的培养基进行PHA发酵对于PHA生产成本的降低效果，结果见表3。
表3
Figure DEST_PATH_IMAGE003
由此可见，该方法在不显著影响PHA发酵效率的情况下，能够显著降低生产成本。
实施例4——氧化法处理PHA工艺废水
30%双氧水，购于国药集团化学试剂北京有限公司；
次氯酸，购于国药集团化学试剂北京有限公司；
10%次氯酸钠，购于国药集团化学试剂北京有限公司。
发酵菌种
盐单胞菌(Halomonas sp.)TD01，其保藏编号为CGMCC NO.4353（CN201010578858.8）。
实施例4-1
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，分离条件使得发酵液分成富含发酵菌体的底流（水含量75重量%）和发酵残液顶流，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体的底流泵入带式真空过滤机，对底流中的菌体进行滤干，滤干的条件使得滤干后的菌体（含水量70重量%）进入提取罐待下一步处理，滤液进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的液相泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括压力0.3MPa，滤布孔径为20μm，进一步分离残留的菌体和固体悬浮物，将滤出的固相送入提取罐与步骤（2）中的菌体一起进行下一步PHA的提取处理，液相（发酵清液）送入氧化脱色罐进行氧化处理。
（4）向步骤（3）所得的氧化处理分离罐中投加双氧水，相对于100重量份的发酵清液，双氧水的用量为18重量份。所述氧化处理在搅拌的条件下进行，所述氧化处理的温度为20℃，所述氧化处理的时间为120min，所述搅拌的速度为1000rpm。氧化处理结束后，在搅拌的同时向氧化脱色罐中加入过量二氧化锰固体，并在与氧化处理相同的条件下继续处理，产生的气体由气体收集装置收集。随后，在搅拌的同时将氧化脱色罐中物料泵入板框分离机（20℃，0.25MPa，2.5h），滤出其中的固体颗粒，所得到的澄清液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
实施例4-2
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，分离条件使得发酵液分成富含发酵菌体的底流（水含量85重量%）和发酵残液顶流，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体的底流泵入带式真空过滤机，对底流中的菌体进行滤干，滤干的条件使得滤干后的菌体（含水量80重量%）进入提取罐待下一步处理，滤液进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的液相泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括压力0.2MPa，滤布孔径为23μm，进一步分离残留的菌体和固体悬浮物，将滤出的固相送入提取罐与步骤（2）中的菌体一起进行下一步PHA的提取处理，液相（发酵清液）送入氧化脱色罐进行氧化处理。
（4）向步骤（3）所得的氧化处理分离罐中投加次氯酸钠溶液，相对于100重量份的发酵清液，以有效成分计，次氯酸钠溶液的用量为5重量份。所述氧化处理在搅拌的条件下进行，所述氧化处理的温度为25℃，所述氧化处理的时间为240min，所述搅拌的速度为800rpm。氧化处理结束后，在搅拌的同时向氧化脱色罐中加入过量稀盐酸，并在与氧化处理相同的条件下继续处理，产生的气体由气体收集装置收集。随后，在搅拌的同时将氧化脱色罐中物料泵入板框分离机（25℃，0.3MPa，3h），滤出其中的固体颗粒，所得到的澄清液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
实施例4-3
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，分离条件使得将发酵液分成富含发酵菌体的底流（水含量70重量%）和发酵残液顶流，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体的底流泵入带式真空过滤机，对底流中的菌体进行滤干，滤干的条件使得，滤干后的菌体（含水量60重量%）进入提取罐待下一步处理，滤液进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的液相泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括压力0.6MPa，滤布孔径为13μm，进一步分离残留的菌体和固体悬浮物，将滤出的固相送入提取罐与步骤（2）中的菌体一起进行下一步PHA的提取处理，液相（发酵清液）送入氧化脱色罐进行氧化处理。
（4）向步骤（3）所得的氧化处理分离罐中投加次氯酸钠溶液，相对于100重量份的发酵清液，以有效成分计，次氯酸钠溶液的用量为10重量份。所述氧化处理在搅拌的条件下进行，所述氧化处理的温度为30℃，所述氧化处理的时间为180min，所述搅拌的速度为1200rpm。氧化处理结束后，在搅拌的同时向氧化脱色罐中加入过量稀盐酸，并在与氧化处理相同的条件下继续处理，产生的气体由气体收集装置收集。随后，在搅拌的同时将氧化脱色罐中物料泵入板框分离机（15℃，0.2MPa，2h），滤出其中的固体颗粒，所得到的澄清液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
实施例4-4
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）-（3）同实施例4-3。
（4）向步骤（3）所得的氧化处理分离罐中投加双氧水，相对于100重量份的发酵清液，双氧水的用量为4重量份。所述氧化处理在搅拌的条件下进行，所述氧化处理的温度为40℃，所述氧化处理的时间为80min，所述搅拌的速度为1500rpm。氧化处理结束后，在搅拌的同时向氧化脱色罐中加入过量二氧化锰固体，并在与氧化处理相同的条件下继续处理，产生的气体由气体收集装置收集。随后，在搅拌的同时将氧化脱色罐中物料泵入板框分离机（40℃，0.1MPa，1h），滤出其中的固体颗粒，所得到的澄清液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
实施例4-5
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）-（3）同实施例4-3。
（4）向步骤（3）所得的氧化处理分离罐中投加次氯酸溶液，相对于100重量份的发酵清液，以有效成分计，次氯酸溶液的用量为25重量份。所述氧化处理在搅拌的条件下进行，所述氧化处理的温度为15℃，所述氧化处理的时间为300min，所述搅拌的速度为500rpm。氧化处理结束后，在搅拌的同时向氧化脱色罐中加入过量二氧化锰固体，并在与氧化处理相同的条件下继续处理，产生的气体由气体收集装置收集。随后，在搅拌的同时将氧化脱色罐中物料泵入板框分离机（10℃，0.5MPa，4h），滤出其中的固体颗粒，所得到的澄清液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
实施例4-6
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
按照实施例4-1的方法进行聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理，不同的是，步骤（4）中，将板框过滤机过滤替换为使用带式真空过滤机进行过滤。
实施例4-7
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
按照实施例4-1的方法进行聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理，不同的是，步骤（1）中，使用板框过滤机进行过滤，步骤（2）中使用碟片式离心机进行离心分离，步骤（3）中使用带式真空过滤机进行过滤。
测试例4-1至4-8
分别使用实施例4-1至4-7步骤（4）分离得到的澄清液用于发酵培养基的配制，并补充适当的无机盐使得配制的发酵培养基与初始发酵培养基相同，同时以初始发酵培养基作为对照。然后按照制备例的方法进行聚羟基脂肪酸酯的发酵液的制备，记录发酵液中生物量、PHA的回收率以及相对于利用初始发酵培养基，利用实施例4-1至4-7清液作为配液水的培养基进行PHA发酵对于PHA生产成本的降低效果，结果见表4。
表4
Figure DEST_PATH_IMAGE004
由此可见，该方法在不显著影响PHA发酵效率的情况下，能够显著降低生产成本。
实施例5——膜分离法处理PHA工艺废水
聚羟基脂肪酸酯购自蓝晶生物科技有限公司，粒径20-200，用于涂覆在板框过滤机的滤布上形成聚羟基脂肪酸酯层；
PHA的回收率和纯度的检测方法参考文献（Engineering self-flocculatingHalomonas campaniensis for
陶瓷膜购自江苏久吾高科有限公司；
超滤膜购自上海赛奥分离技术工程有限公司。
实施例5-1
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，将发酵液分成富含发酵菌体的底流和发酵残液顶流（固含量7重量%），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理，所述发酵菌体底流进入提取罐进行PHA的提取。
（2）将所述发酵残液暂存罐中的液相泵入板框过滤机进行过滤，进一步分离残留的菌体和固体悬浮物，将滤出的固相送入提取罐与步骤（1）中的菌体一起进行下一步PHA的提取处理，液相（发酵清液，固含量5重量%）进行后续的膜分离。
（3）将步骤（2）所得的液相进行陶瓷膜过滤，过滤的条件包括压力0.2MPa，膜孔径50nm，然后将陶瓷膜过滤后的滤液进行超滤膜过滤，过滤的条件包括0.3MPa，截留重均分子量5000Da。从而得到处理后的发酵清液，送入储罐，用于下一次发酵的配料。
实施例5-2
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，将发酵液分成富含发酵菌体的底流和发酵残液顶流（固含量10重量%），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理，所述发酵菌体底流进入提取罐进行PHA的提取。
（2）将所述发酵残液暂存罐中的液相泵入板框过滤机进行过滤，进一步分离残留的菌体和固体悬浮物，将滤出的固相送入提取罐与步骤（1）中的菌体一起进行下一步PHA的提取处理，液相（发酵清液，固含量8重量%）进行后续的膜分离。
（3）将步骤（2）所得的液相进行陶瓷膜过滤，过滤的条件包括压力0.3MPa，孔径20nm，然后将陶瓷膜过滤后的滤液进行超滤膜过滤，过滤的条件包括压力0.6MPa，截留重均分子量1000Da，从而得到处理后的发酵清液，送入储罐，用于下一次发酵的配料。
实施例5-3
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，将发酵液分成富含发酵菌体的底流和发酵残液顶流（固含量15重量%），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理，所述发酵菌体底流进入提取罐进行PHA的提取。
（2）将所述发酵残液暂存罐中的液相泵入板框过滤机进行过滤，进一步分离残留的菌体和固体悬浮物，将滤出的固相送入提取罐与步骤（1）中的菌体一起进行下一步PHA的提取处理，液相（发酵清液，固含量10重量%）进行后续的膜分离。
（3）将步骤（2）所得的液相进行陶瓷膜过滤，过滤的条件包括压力0.4MPa，孔径30nm，然后将陶瓷膜过滤后的滤液进行超滤膜过滤，过滤的条件包括压力0.4MPa，截留重均分子量3000Da，从而得到处理后的发酵清液，送入储罐，用于下一次发酵的配料。
实施例5-4
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，将发酵液分成富含发酵菌体的底流和发酵残液顶流（固含量15重量%），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理，所述发酵菌体底流进入提取罐进行PHA的提取。
（2）将所述发酵残液暂存罐中的液相泵入板框过滤机进行过滤，进一步分离残留的菌体和固体悬浮物，将滤出的固相送入提取罐与步骤（1）中的菌体一起进行下一步PHA的提取处理，液相（发酵清液，固含量10重量%）进行后续的膜分离。
（3）将步骤（2）所得的液相进行陶瓷膜过滤，过滤的条件包括压力0.1MPa，孔径10nm，然后将陶瓷膜过滤后的滤液进行超滤膜过滤，过滤的条件包括压力0.9MPa，截留重均分子量800Da，从而得到处理后的发酵清液，送入储罐，用于下一次发酵的配料。
实施例5-5
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，将发酵液分成富含发酵菌体的底流和发酵残液顶流（固含量5重量%），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理，所述发酵菌体底流进入提取罐进行PHA的提取。
（2）将所述发酵残液暂存罐中的液相泵入板框过滤机进行过滤，进一步分离残留的菌体和固体悬浮物，将滤出的固相送入提取罐与步骤（1）中的菌体一起进行下一步PHA的提取处理，液相（发酵清液，固含量3重量%）进行后续的膜分离。
（3）将步骤（2）所得的液相进行陶瓷膜过滤，过滤的条件包括压力0.5MPa，孔径60nm，然后将陶瓷膜过滤后的滤液进行超滤膜过滤，过滤的条件包括压力0.2MPa，截留重均分子量6000Da，从而得到处理后的发酵清液，送入储罐，用于下一次发酵的配料。
实施例5-6
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
按照实施例5-1的方法进行聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理，不同的是，陶瓷膜替换为螺旋卷式膜。
实施例5-7
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
按照实施例5-1的方法进行聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理，不同的是，步骤（1）中，使用板框过滤机进行过滤，步骤（2）中使用碟片式离心机进行离心分离。
实施例5-8
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
按照实施例5-1的方法进行聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理，不同的是，步骤（2）中使用带式真空过滤机进行分离。
测试例5-1至5-9
分别使用实施例5-1至5-8步骤（3）分离得到的澄清液用于发酵培养基的配制，并补充适当的无机盐使得配制的发酵培养基与初始发酵培养基相同，同时以初始发酵培养基作为对照。然后按照“发酵液的制备”的方法进行聚羟基脂肪酸酯的发酵液的制备，记录发酵液中生物量以及相对于利用初始发酵培养基，利用实施例5-1至5-8清液作为配液水的培养基进行PHA发酵对于PHA生产成本的降低效果，结果见表5。
表5
Figure DEST_PATH_IMAGE005
由此可见，该方法在不显著影响PHA发酵效率的情况下，能够显著降低生产成本。
实施例6——色谱法处理PHA工艺废水
型号分别为LSA-700和LSA-700B的离子交换树脂购自西安蓝晚晓科技新材料股分有限公司；
型号分别为DA201B的离子交换树脂购自江苏苏青水处理工程集团有限公司；
型号为D201的离子交换树脂购自廊坊市南大树脂有限公司；
实施例6-1
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，分离条件使得，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（水含量75重量%）和发酵残液顶流，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体的底流泵入带式真空过滤机，对底流中的菌体进行滤干，滤干的条件使得，滤干后的菌体（含水量70重量%）进入提取罐待下一步处理，滤液进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的液相泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括压力0.3MPa，滤布为1000目，进一步分离残留的菌体和固体悬浮物，将滤出的固相送入提取罐与步骤（2）中的菌体一起进行下一步PHA的提取处理，液相（发酵清液）送入色谱吸附柱进行吸附处理。
（4）将步骤（3）所得发酵清液引入阴离子交换吸附树脂D201，引入速度为2BV/h，所述吸附的温度为20℃。收集流出液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
（5）色谱柱进行再生工序。
实施例6-2
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，分离条件使得，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（水含量85重量%）和发酵残液顶流，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体的底流泵入带式真空过滤机，对底流中的菌体进行滤干，滤干的条件使得，滤干后的菌体（含水量80重量%）进入提取罐待下一步处理，滤液进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的液相泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括压力0.2MPa，滤布为800目，进一步分离残留的菌体和固体悬浮物，将滤出的固相送入提取罐与步骤（2）中的菌体一起进行下一步PHA的提取处理，液相（发酵清液）送入色谱吸附柱进行吸附处理。
（4）将步骤（3）所得发酵清液引入阴离子交换吸附树脂D201，引入速度为1.5BV/h，所述吸附的温度为15℃。收集流出液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
（5）色谱柱进行再生工序。
实施例6-3
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，分离条件使得，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（水含量70重量%）和发酵残液顶流，所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体的底流泵入带式真空过滤机，对底流中的菌体进行滤干，滤干的条件使得，滤干后的菌体（含水量60重量%）进入提取罐待下一步处理，滤液进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的液相泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括压力0.6MPa，滤布为900目，进一步分离残留的菌体和固体悬浮物，将滤出的固相送入提取罐与步骤（2）中的菌体一起进行下一步PHA的提取处理，液相（发酵清液）送入色谱吸附柱进行吸附处理。
（4）将步骤（3）所得发酵清液引入阴离子交换吸附树脂D201，引入速度为2.5BV/h，所述吸附的温度为25℃。收集流出液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
（5）色谱柱进行再生工序。
实施例6-4
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）-（3）同实施例6-3。
（4）将步骤（3）所得发酵清液引入阴离子交换吸附树脂LSA-700，引入速度为1BV/h，所述吸附的温度为10℃。收集流出液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
（5）色谱柱进行再生工序。
实施例6-5
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
（1）-（3）同实施例6-3。
（4）将步骤（3）所得发酵清液引入阴离子交换吸附树脂LSA-700B，引入速度为3BV/h，所述吸附的温度为40℃。收集流出液进入储罐，用于下一次发酵的配料。
（5）色谱柱进行再生工序。
实施例6-6
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
按照实施例6-1的方法进行聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理，不同的是，使用的树脂为AB-8树脂，步骤（4）中，将板框过滤机过滤替换为使用带式真空过滤机进行过滤。
实施例6-7
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理方法
按照实施例6-1的方法进行聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理，不同的是，步骤（1）中，使用板框过滤机进行过滤，步骤（2）中使用碟片式离心机进行离心分离，步骤（3）中使用带式真空过滤机进行过滤。
测试例6-1至6-8
分别使用实施例6-1至6-7步骤（4）分离得到的澄清液用于发酵培养基的配制，并补充适当的无机盐使得配制的发酵培养基与初始发酵培养基相同，同时以初始发酵培养基作为对照。然后按照制备例的方法进行聚羟基脂肪酸酯的发酵液的制备，记录发酵液中生物量以及相对于利用初始发酵培养基，利用实施例1-8清液作为配液水的培养基进行PHA发酵对于PHA生产成本的降低效果，结果见表6。
表6
Figure DEST_PATH_IMAGE006
由此可见，该方法在不显著影响PHA发酵效率的情况下，能够显著降低生产成本。
三、PHA提取工艺对PHA回收率和纯度的影响
碟片式离心机购自南京华盛分离机械技术有限公司，型号DR203；
带式真空过滤机购自湖州核工惠能环保过滤科技有限公司，型号DY-500；
板框过滤机购自海宁市云飞过滤设备有限公司，型号YF-100-1；
表面活性剂十二烷基磺酸购自叶源生物科技有限公司，货号S15013；
聚羟基脂肪酸酯购自蓝晶生物科技有限公司，粒径1-200µm，用于涂覆在板框过滤机的滤布上形成聚羟基脂肪酸酯层；
PHA的回收率和纯度的检测方法参考文献（Engineering self‐flocculatingHalomonas campaniensis for wastewaterless open and continuous fermentation）。
制备例
本制备例用于说明聚羟基脂肪酸酯的发酵液的制备
将盐单胞菌（TD01，其保藏编号为CGMCC NO.4353（CN201010578858.8））接种于种子培养基（5g/L的酵母粉、10g/L的蛋白胨以及60g/L的氯化钠）中在37℃和200rpm的条件下进行一级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到一级种子液；
将所述一级种子液以10体积%的接种量接种于种子培养基中，在37℃和200rpm的条件下进行二级活化培养，培养至OD600达到4左右，得到二级种子液。
然后按10体积％的接种量将二级种子液接入到初始发酵培养基（氯化钠50g/L，葡萄糖50g/L，玉米浆粉15g/L，尿素2g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸二氢钾5g/L，微量元素母液I10mL/L，微量元素母液II 3mL/L。所述微量元素母液I和II，参照引用专利CN201010578858.8）中，发酵体系不灭菌直接发酵。控制温度37℃，转速控制600-1000 rpm，通风量0.5-2.0 vvm，初始溶氧控制在30%以上；发酵过程中通过补料控制糖浓度在5-20g/L之间，用NaOH控制发酵pH为8-9之间，发酵48小时。
实施例7——滤布涂覆PHA
溶菌酶CAS: 12650-88-3，购自北京东方瑞德生物技术有限公司；
实施例7-1
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯的分离方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，分离条件包括转速6000rpm，进料量60L/min，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（水含量75重量%）和发酵残液顶流。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体的底流泵入带式真空过滤机，对底流中的菌体进行滤干，滤干的条件包括压力0.3MPa，处理量20kg/min，滤干后的菌体（含水量70重量%）进入提取罐待下一步处理。
（3）将提取罐内的菌体进行水洗3次、离心分离，去除其中的杂质。
（4）向步骤（3）所述的提取罐中加入酸碱调节剂调节pH至9，然后在温度120℃、压力0.15MPa、转速100rpm下搅拌并蒸煮2小时，进行破壁。
（5）将步骤（4）中破壁后的含PHA混合液泵入碟片式离心分离机，分离的条件使得从上部顶流中分离出菌体壁等杂质，富含PHA的下部沉淀继续返回到提取罐中进行反复水洗2次。
（6）将步骤（5）中分离出菌体壁后的PHA混合流泵入板框过滤机进行固液分离，分离条件温度为25℃，压力为0.7MPa，时间5小时。分离出其中的PHA固体颗粒。其中，板框过滤机的滤布上涂覆有聚羟基脂肪酸酯层，厚度为8mm，涂覆所述聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为2µm。
（7）步骤（6）中板框分离出来的固体PHA进行喷雾干燥，获得PHA干粉，回收率和纯度如表7所示。
实施例7-2
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯的分离方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，分离条件包括转速5500rpm，进料量55L/min，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（水含量85重量%）和发酵残液顶流。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体的底流泵入带式真空过滤机，对底流中的菌体进行滤干，滤干的条件包括0.35MPa，处理量23kg/min，滤干后的菌体（含水量80重量%）进入提取罐待下一步处理。
（3）将提取罐内的菌体进行水洗2次、离心分离，去除其中的杂质。
（4）向步骤（3）所述的提取罐中加入酸碱调节剂调节pH至8，然后在温度90℃、压力0.1MPa、转速120rpm下搅拌并蒸煮2.5小时，进行破壁。
（5）将步骤（4）中破壁后的含PHA混合液泵入碟片式离心分离机，分离的条件使得从上部顶流中分离出菌体壁等杂质，富含PHA的下部沉淀继续返回到提取罐中进行反复水洗2次。
（6）将步骤（5）中分离出菌体壁后的PHA混合流泵入板框过滤机进行固液分离，分离条件温度为30℃，压力为0.6MPa，时间为4小时，分离出其中的PHA固体颗粒。其中，板框过滤机的滤布上涂覆有聚羟基脂肪酸酯层，厚度为10mm，涂覆所述聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为5µm。
（7）步骤（6）中板框分离出来的固体PHA进行喷雾干燥，获得PHA干粉，回收率和纯度如表7所示。
实施例7-3
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯的分离方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，分离条件包括转速5000rpm，进料量50L/min，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（水含量70重量%）和发酵残液顶流。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体的底流泵入带式真空过滤机，对底流中的菌体进行滤干，滤干的条件包括0.4MPa处理量25kg/min，滤干后的菌体（含水量60重量%）进入提取罐待下一步处理。
（3）将提取罐内的菌体进行水洗2次、离心分离，去除其中的杂质。
（4）向步骤（3）所述的提取罐中加入酸碱调节剂调节pH至7，然后在温度130℃、压力0.2MPa、转速80rpm下搅拌并蒸煮1小时，进行破壁。
（5）将步骤（4）中破壁后的含PHA混合液泵入碟片式离心分离机，分离的条件使得从上部顶流中分离出菌体壁等杂质，富含PHA的下部沉淀继续返回到提取罐中进行反复水洗2次。
（6）将步骤（5）中分离出菌体壁后的PHA混合流泵入板框过滤机进行固液分离，分离条件温度为35℃，压力为0.65MPa，时间为3小时。分离出其中的PHA固体颗粒。其中，板框过滤机的滤布上涂覆有聚羟基脂肪酸酯层，厚度为12mm，涂覆所述聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为10µm。
（7）步骤（6）中板框分离出来的固体PHA进行喷雾干燥，获得PHA干粉，回收率和纯度如表7所示。
实施例7-4
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯的分离方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，分离条件包括转速4000rpm，进料量50L/min，将发酵液分成富含发酵菌体的底流（水含量90重量%）和发酵残液顶流。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体的底流泵入带式真空过滤机，对底流中的菌体进行滤干，滤干的条件包括0.5MPa处理量20kg/min，滤干后的菌体（含水量65重量%）进入提取罐待下一步处理。
（3）将提取罐内的菌体进行水洗2次、离心分离，去除其中的杂质。
（4）向步骤（3）所述的提取罐中加入酸碱调节剂调节pH至6，然后加入溶菌酶并在温度50℃、压力0.1MPa、转速250rpm下搅拌4小时，进行破壁。
（5）将步骤（4）中破壁后的含PHA混合液泵入碟片式离心分离机，分离的条件使得从上部顶流中分离出菌体壁等杂质，富含PHA的下部沉淀继续返回到提取罐中进行反复水洗2次。
（6）将步骤（5）中分离出菌体壁后的PHA混合流泵入板框过滤机进行固液分离，分离条件温度为40℃，压力为0.8MPa，时间为2小时，分离出其中的PHA固体颗粒。其中，板框过滤机的滤布上涂覆有聚羟基脂肪酸酯层，厚度为14mm，涂覆所述聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为1µm。
（7）步骤（6）中板框分离出来的固体PHA进行喷雾干燥，获得PHA干粉，回收率和纯度如表7所示。
实施例7-5
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯的分离方法
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，分离条件包括7000rpm，进料量50L/min,将发酵液分成富含发酵菌体的底流（水含量60重量%）和发酵残液顶流。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体的底流泵入带式真空过滤机，对底流中的菌体进行滤干，滤干的条件包括0.5MPa处理量20kg/min，滤干后的菌体（含水量50重量%）进入提取罐待下一步处理。
（3）将提取罐内的菌体进行水洗2次、离心分离，去除其中的杂质。
（4）向步骤（3）所述的提取罐中加入酸碱调节剂调节pH至10，然后在温度200℃、压力0.3MPa、转速120rpm下搅拌并蒸煮0.5小时，进行破壁。
（5）将步骤（4）中破壁后的含PHA混合液泵入碟片式离心分离机，分离的条件使得从上部顶流中分离出菌体壁等杂质，富含PHA的下部沉淀继续返回到提取罐中进行反复水洗2次。
（6）将步骤（5）中分离出菌体壁后的PHA混合流泵入板框过滤机进行固液分离，分离条件温度为15℃，压力为0.2MPa，时间为8小时，分离出其中的PHA固体颗粒。其中，板框过滤机的滤布上涂覆有聚羟基脂肪酸酯层，厚度为20mm，涂覆所述聚羟基脂肪酸酯层的滤布的孔径为20µm。
（7）步骤（6）中板框分离出来的固体PHA进行喷雾干燥，获得PHA干粉，回收率和纯度如表7所示。
实施例7-6
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯的分离方法
按照实施例7-2的方法进行聚羟基脂肪酸酯的分离，不同的是，将步骤（2）的带式真空过滤机替换为碟片式离心机，并按照步骤（1）的条件分离。回收率和纯度如表7所示。
实施例7-7
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯的分离方法
按照实施例7-2的方法进行聚羟基脂肪酸酯的分离，不同的是，将步骤（4）中的加入足量的十二烷基磺酸，在常温以及0.1MPa下维持4h，也即，不进行加热加压处理。回收率和纯度如表7所示。
实施例7-8
本实施例用于说明本发明提供的聚羟基脂肪酸酯的分离方法
按照实施例7-2的方法进行聚羟基脂肪酸酯的分离，不同的是，步骤（6）中，用于涂覆聚羟基脂肪酸酯层的聚羟基脂肪酸酯为从破壁产物中分离出的聚羟基脂肪酸酯。回收率和纯度如表7所示。
对比例7-1
本对比例用于说明参比的聚羟基脂肪酸酯的分离方法
按照实施例7-1的方法进行聚羟基脂肪酸酯的分离，不同的是，步骤（6）中，所用滤布未涂覆有聚羟基脂肪酸酯层。回收率和纯度如表7所示。
对比例7-2
本对比例用于说明参比的聚羟基脂肪酸酯的分离方法
按照实施例7-1的方法进行聚羟基脂肪酸酯的分离，不同的是，步骤（6）中，所用滤布涂覆的为硅藻土层。回收率和纯度如表7所示。
对比例7-3
本对比例用于说明参比的聚羟基脂肪酸酯的分离方法
按照Engineering self‐flocculating Halomonas campaniensis forwastewaterless open and continuous fermentation，Biotechnology andBioengineering [J]. 2019;116:805-815公开的方法对制备的发酵液进行PHA的提取。回收率和纯度如表7所示。
表7
Figure DEST_PATH_IMAGE007
实施例8——高温高压蒸煮+超声提取PHA
聚羟基脂肪酸酯聚合度即平均聚合度，指的是聚合物分子中羟基烷酸单体的数量，通过其重均分子量进行表征；
超声循环提取机GCXZ-2B购自北京弘祥隆生物技术股份有限公司；
实施例8-1
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流（水含量80%）（第一菌体细胞）和发酵残液顶流（第一发酵残液），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体（含水量80%）（第二菌体细胞）进入提取罐，滤液（第二发酵残液）进入发酵残液暂存罐。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤压力为0.35MPa，滤布孔径为800目，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入提取罐与步骤（2）中的菌体（第二菌体细胞）混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
（4）将提取罐中的菌体细胞进行水洗2次，离心分离，去除其中的杂质。
（5）开启提取罐的搅拌装置，转速为300rpm，向提取罐中加入1倍体积于待破碎的菌体细胞的水，得到菌悬液（菌悬液的OD600值为100）；然后进行加热加压破碎，从破碎菌体细胞计时开始控制超声功率为500W/m3菌悬液进行超声至第15min，然后将超声的功率提高150W/m3菌悬液进行超声至破碎菌体细胞计时结束，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，加热加压破碎的条件为：菌悬液温度为120℃、压力为0.2MPa、蒸煮时间为30min。
（6）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为7000rpm，分离条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流（液流）和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗2次，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
（7）将步骤（6）中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为20℃，压力为0.35MPa，时间为2.5h，其中，滤布的孔径为19µm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层（厚度为7mm）；所得滤液作为发酵培养基的配料。
（8）将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的重均分子量、收率和纯度进行测定，结果如表8所示。
实施例8-2
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流（水含量90重量%）（第一菌体细胞）和发酵残液顶流（第一发酵残液），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体（含水量75重量%）（第二菌体细胞）进入提取罐，滤液（第二发酵残液）进入发酵残液暂存罐。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的压力为0.2MPa，滤布孔径为500目，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入提取罐与步骤（2）中的菌体（第二菌体细胞）混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
（4）将提取罐中的菌体细胞进行水洗2次，离心分离，去除其中的杂质。
（5）开启提取罐的搅拌装置，转速为300rpm，向提取罐中加入0.8倍体积于待破碎的菌体细胞的水，得到菌悬液（菌悬液的OD600值为150）；然后加热加压进行破碎，从破碎菌体细胞计时开始控制超声功率为300W/m3菌悬液进行超声至第20min，然后将超声的功率提高100W/m3进行超声至破碎菌体细胞计时结束，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，蒸煮破碎的条件为：菌悬液温度为110℃、压力为0.15MPa、蒸煮时间为40min。
（6）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为3000rpm，分离条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流（液流）和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗2次，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
（7）将步骤（6）中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为25℃，压力为0.5MPa，时间为3h，其中，滤布的孔径为23µm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层（厚度为5mm）；所得滤液作为发酵培养基的配料。
（8）将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的重均分子量、收率和纯度进行测定，结果如表8所示。
实施例8-3
（1）将制备例制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流（水含量70重量%）（第一菌体细胞）和发酵残液顶流（第一发酵残液），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体（含水量85重量%）（第二菌体细胞）进入提取罐，滤液（第二发酵残液）进入发酵残液暂存罐。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的压力为0.5MPa，滤布孔径为1000目，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入提取罐与步骤（2）中的菌体（第二菌体细胞）混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
（4）将提取罐中的菌体细胞进行水洗2次，离心分离，去除其中的杂质。
（5）开启提取罐的搅拌装置，转速为400rpm，向提取罐中加入2倍体积于待破碎的菌体细胞的水，得到菌悬液（菌悬液的OD600值为120）；然后加热加压进行破碎，从破碎菌体细胞计时开始控制超声功率为800W/m3菌悬液进行超声至第10min，然后将超声的功率提高200W/m3进行超声至破碎菌体细胞计时结束，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，蒸煮破碎的条件为：菌悬液温度为125℃、压力为0.25MPa、蒸煮时间为20min。
（6）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为10000rpm，分离条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流（液流）和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗2次，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
（7）将步骤（6）中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为15℃，压力为0.2MPa，时间为2h，其中，滤布的孔径为13µm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层（厚度为10mm）；所得滤液作为发酵培养基的配料。
（8）将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的重均分子量、收率和纯度进行测定，结果如表8所示。
实施例8-4
按照实施例8-1的方法进行聚羟基脂肪酸酯发酵液的处理，不同的是，步骤（1）中，使用板框过滤机进行过滤，步骤（2）中使用碟片式离心机进行离心分离，步骤（3）中使用带式真空过滤机进行过滤。
对所得聚羟基脂肪酸酯的重均分子量、收率和纯度进行测定，结果如表8所示。
实施例8-5
按照实施例8-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（5）中，向提取罐中加入5倍体积于待破碎的菌体细胞的水；蒸煮破碎的条件为：菌悬液温度为135℃、压力为0.3MPa、蒸煮时间为60min。
对所得聚羟基脂肪酸酯的重均分子量、收率和纯度进行测定，结果如表8所示。
实施例8-6
按照实施例8-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（7）中板框过滤机的滤膜预涂覆的聚羟基脂肪酸酯层的厚度为20mm。
对所得聚羟基脂肪酸酯的重均分子量、收率和纯度进行测定，结果如表8所示。
实施例8-7
按照实施例8-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（5）中从破碎菌体细胞计时开始至破碎结束，超声的功率为500W/m3菌悬液。
对所得聚羟基脂肪酸酯的重均分子量、收率和纯度进行测定，结果如表8所示。
对比例8-1
按照CN106687502A中实施例1公开的方法对实施例8-2的步骤（3）中提取罐中的菌体细胞进行PHA的提取。
对所得聚羟基脂肪酸酯的重均分子量、收率和纯度进行测定，结果如表8所示。
对比例8-2
按照实施例8-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（7）中板框过滤机的滤膜不预涂覆聚羟基脂肪酸酯层。
对所得聚羟基脂肪酸酯的重均分子量、收率和纯度进行测定，结果如表8所示。
对比例8-3
按照对比例8-2的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（5）中蒸煮破碎的条件为：菌悬液温度为100℃、压力为常压、蒸煮时间为30min。
对所得聚羟基脂肪酸酯的重均分子量、收率和纯度进行测定，结果如表8所示。
表8
Figure DEST_PATH_IMAGE008
通过表8的结果可以看出，采用本发明技术方案提取到的聚羟基脂肪酸酯具有较高的收率和纯度，以及较高的聚合度，而较高的PHA收率和纯度也间接地降低了成本。
实施例9——氨水+超声提取PHA
聚羟基脂肪酸酯聚合度即平均聚合度，指的是聚合物分子中羟基烷酸单体的数量，通过聚羟基脂肪酸酯的重均分子量进行表征；
氨水购自山东恒昌圣诚化工股份有限公司，浓度为25重量%；
超声循环提取机GCXZ-2B购自北京弘祥隆生物技术股份有限公司；
实施例9-1
（1）将制备例9-1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流（水含量90重量%）（第一菌体细胞）和发酵残液顶流（第一发酵残液），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体（含水量75重量%）（第二菌体细胞）进入超声波辅助提取罐，滤液（第二发酵残液）进入发酵残液暂存罐。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的压力为0.2MPa，滤布孔径为500目，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入超声波提取罐与步骤（2）中的菌体（第二菌体细胞）混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
（4）将超声波提取罐中的菌体细胞进行水洗2次，离心分离，去除其中杂质。
（5）开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为200rpm，向超声波提取罐中加入氨水和水，最终使得得到的菌悬液中以NH4OH计的氨的浓度为0.2mol/L，菌悬液的OD600值为200，然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，超声的功率为300W/m3菌悬液，菌悬液的温度为70℃、超声破碎的时间为60min，压力为常压。
（6）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，离心分离的条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流（液流）和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗2次，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
（7）将步骤（6）中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为25℃，压力为0.5MPa，时间为3h，其中，滤布的孔径为13µm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层（厚度为10mm）；所得滤液作为发酵培养基的配料。
（8）将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
实施例9-2
（1）将制备例9-1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流（水含量80重量%）（第一菌体细胞）和发酵残液顶流（第一发酵残液），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐进行下一步处理。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体（含水量80重量%）（第二菌体细胞）进入超声波辅助提取罐待下一步处理，滤液（第二发酵残液）进入发酵残液暂存罐。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括：压力为0.4MPa，滤布孔径为800目得到含菌体细胞的第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入超声波提取罐与步骤（2）中的菌体（第二菌体细胞）混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
（4）将超声波提取罐中的菌体细胞进行水洗2次，离心分离，去除其中的杂质。
（5）开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为250rpm，向超声波提取罐中加入氨水和水，最终使得得到的菌悬液中以NH4OH计的氨的浓度为0.35mol/L，菌悬液的OD600值为400，然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，超声的功率为500W/m3菌悬液，菌悬液的温度为75℃、超声破碎的时间为75min，压力为常压。
（6）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，离心分离的条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗2次，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
（7）将步骤（6）中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为25℃，压力为0.35MPa，时间为2.5h，其中，滤布的孔径为19µm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层（厚度为7mm）；所得滤液作为发酵培养基的配料。
（8）将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
实施例9-3
（1）将制备例9-1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流（水含量70重量%）（第一菌体细胞）和发酵残液顶流（第一发酵残液），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
（2）将步骤（1）得到的富含菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体（含水量85重量%）（第二菌体细胞）进入超声波辅助提取罐，滤液（第二发酵残液）进入发酵残液暂存罐。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的条件包括：压力为0.5MPa，滤布孔径为1000目，得到含菌体细胞的第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入超声波提取罐与步骤（2）中的菌体（第二菌体细胞）混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
（4）将超声波提取罐中的含菌体细胞的固相进行水洗2次，离心分离去除其中杂质。
（5）开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为300rpm，向超声波提取罐中加入氨水和水，最终使得得到的菌悬液中以NH4OH的氨的浓度为0.5mol/L，菌悬液的OD600值为600，然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，超声的功率为1000W/m3菌悬液，菌悬液的温度为80℃、超声破碎的时间为90min，压力为常压。
（6）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，离心分离的条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗2次，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
（7）将步骤（6）中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为15℃，压力为0.2MPa，时间为2h，其中，滤布的孔径为23µm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层（厚度为5mm）；所得滤液作为发酵培养基的配料。
（8）将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
实施例9-4
按照实施例9-2的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（5）中最终使得得到的菌悬液中以NH4OH计的氨的浓度为1mol/L。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
实施例9-5
按照实施例9-2的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层的平均厚度为20mm。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
实施例9-6
按照实施例9-2的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（1）中，使用板框过滤机进行过滤，步骤（2）中使用碟片式离心机进行离心分离，步骤（3）中使用带式真空过滤机进行过滤。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
实施例9-7
按照实施例9-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（5）中，超声的功率为2000W/m3混合液，温度为60℃、时间为180min，压力为常压。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
实施例9-8
按照实施例9-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（7）中板框过滤机的滤布不预涂覆聚羟基脂肪酸酯层。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
实施例9-9
按照实施例9-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（7）中板框过滤机的滤布孔径为25μm。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
对比例9-1
按照CN106687502A中实施例1公开的方法对实施例9-1的步骤（3）中提取罐中的菌体细胞进行PHA的提取。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
对比例9-2
按照实施例9-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，将步骤（5）中加入的氨水替换为等体积的水。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
对比例9-3
按照实施例9-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（5）中不开启超声设备。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
对比例9-4
按照实施例9-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，将氨水替换为氢氧化钠，且使得菌悬液的pH值与实施例9-1相同。
对所得聚羟基脂肪酸酯的聚合度、收率和纯度进行测定，结果如表9所示。
表9
Figure DEST_PATH_IMAGE009
通过表9的结果可以看出，采用本发明方法提取得到的聚羟基脂肪酸酯具有较高的收率和纯度，以及较高的聚合度（由PHA的重均分子量表征），而较高的PHA收率和纯度则间接的降低了成本。
实施例10——SOD+溶菌酶提取PHA
聚羟基脂肪酸酯重均分子量通过凝胶渗透色谱法测得；
表面活性剂十二烷基磺酸（SDS）购自叶源生物科技有限公司，货号S15013；
聚羟基脂肪酸酯购自蓝晶生物科技有限公司，粒径为1-200µm；
超声循环提取机GCXZ-2B购自北京弘祥隆生物技术股份有限公司；
溶菌酶CAS: 12650-88-3，购自北京东方瑞德生物技术有限公司；
实施例10-1
（1）将制备例10-1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流（水含量80%重量）（第一菌体细胞）和发酵残液顶流（第一发酵残液），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体（含水量80%重量）（第二菌体细胞）进入第一超声波提取罐，滤液（第二发酵残液）进入发酵残液暂存罐。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的压力为0.4MPa，滤布孔径为10µm，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入第一超声波提取罐与步骤（2）中的菌体（第二菌体细胞）混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
（4）将超声波提取罐中的菌体细胞进行水洗3次，离心分离，得到待破碎菌体细胞，去除其中的杂质。
（5）开启第一超声波提取罐的搅拌装置，转速为250rpm，向超声波提取罐中加入1倍于待破碎菌体细胞体积的水重悬菌体，得到菌悬液，然后加入溶菌酶得到混合物料，使得所得混合物料中溶菌酶的含量为0.3g/L；然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，从超声破碎计时开始控制超声功率为600W/m3混合物料进行超声至第75min，然后将超声的功率提高150W/m3进行超声至破碎菌体细胞计时结束，混合物料的温度为35℃，超声破碎的时间为120min，压力为常压。
（6）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为7000rpm，分离条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流（液流）和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
（7）将所得沉淀送入第二超声波提取罐，开启搅拌装置，转速为250rpm，向第二超声波提取罐中加入1倍于PHA沉淀重量的水重悬沉淀，得到含PHA的悬浊液，然后加入SDS得到混合物料，所得混合物料中SDS与PHA的质量比为0.09:1000；然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的第二浆液，超声功率为600 W/m3，混合物料的温度为75℃，超声破碎的时间为80min，压力为常压。
（8）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为7000rpm，分离条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流（液流）和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗3次。
（9）将步骤（8）中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为20℃，压力为0.35MPa，时间为2.5h，其中，滤布的孔径为19µm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层（厚度为8mm）；所得滤液作为发酵培养基的配料。
（10）将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和平均分子量进行测定，结果如表10所示。
实施例10-2
（1）将制备例10-1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流（水含量90%重量）（第一菌体细胞）和发酵残液顶流（第一发酵残液），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体（含水量75重量%）（第二菌体细胞）进入超声波辅助提取罐，滤液（第二发酵残液）进入发酵残液暂存罐。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的压力为0.5MPa，滤布孔径为7µm，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入超声波提取罐与步骤（2）中的菌体（第二菌体细胞）混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
（4）将超声波提取罐中的菌体细胞进行水洗2次，离心分离，去除其中的杂质。
（5）开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为300rpm，向超声波提取罐中加入0.8倍于待破碎菌体细胞体积的水重悬菌体，得到菌悬液，然后加入溶菌酶得到混合物料，使得所得混合物料中溶菌酶的含量为0.5g/L；然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，从破碎菌体细胞计时开始控制超声功率为800W/m3混合物料进行超声至第60min，然后将超声的功率提高100W/m3混合物料进行超声至破碎菌体细胞计时结束，混合物料的温度为40℃，超声破碎的时间为150min，压力为常压。
（6）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为7000rpm，分离条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流（液流）和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
（7）将所得沉淀送入超声波提取罐，开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为300rpm，向超声波提取罐中加入1倍于PHA沉淀重量的水重悬沉淀，得到PHA悬浊液，然后加入十二烷基硫酸钠（SDS）得到混合物料，使得所得混合物料中SDS与PHA的质量比为0.1:1000；然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，超声功率为1000 W/m3，混合物料的温度为80℃，超声破碎的时间为90min，压力为常压。
（8）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为7000rpm，分离条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流（液流）和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗5次。
（9）将步骤（8）中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为40℃，压力为0.5MPa，时间为3h，其中，滤布的孔径为13µm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层（厚度为10mm）；所得滤液作为发酵培养基的配料。
（10）将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和平均分子量进行测定，结果如表10所示。
实施例10-3
（1）将制备例10-1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液（发酵55h）通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流（水含量70%重量）（第一菌体细胞）和发酵残液顶流（第一发酵残液），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体（含水量85重量%）（第二菌体细胞）进入超声波辅助提取罐，滤液（第二发酵残液）进入发酵残液暂存罐。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的压力为0.2MPa，滤布孔径为25µm，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入超声波提取罐与步骤（2）中的菌体（第二菌体细胞）混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
（4）将超声波提取罐中的菌体细胞进行水洗2次，离心分离，去除其中的杂质。
（5）开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为200rpm，向超声波提取罐中加入2倍于待破碎菌体细胞体积的水重悬菌体，得到菌悬液，然后加入溶菌酶得到混合物料，使得所得混合物料中溶菌酶的含量为0.1g/L；然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，从破碎菌体细胞计时开始控制超声功率为300W/m3混合物料进行超声至第60min，然后将超声的功率提高100W/m3混合物料进行超声至破碎菌体细胞计时结束，混合物料的温度为30℃、超声破碎的时间为90min，压力为常压。
（6）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为3000rpm，分离条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流（液流）和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
（7）将所得沉淀送入超声波提取罐，开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为100rpm，向超声波提取罐中加入1倍于PHA沉淀重量的水重悬沉淀，得到PHA悬浊液，然后加入十二烷基硫酸钠（SDS）得到混合物料，使得所得混合物料中SDS与PHA的质量比为0.08:1000；然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，超声功率为300 W/m3，混合物料的温度为70℃，超声破碎的时间为90min，压力为常压。
（8）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为3000rpm，分离条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流（液流）和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗3次。
（9）将步骤（8）中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为15℃，压力为0.2MPa，时间为2h，其中，滤布的孔径为23µm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层（厚度为5mm）；所得滤液作为发酵培养基的配料。
（8）将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和平均分子量进行测定，结果如表10所示。
实施例10-4
按照实施例10-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（5）中，最终使得得到的混合物料中的溶菌酶的含量为1g/L。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和平均分子量进行测定，结果如表10所示。
实施例10-5
按照实施例10-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（5）中，超声的功率为2000W/m3混合液，温度为20℃、时间为240min，压力为常压。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和平均分子量进行测定，结果如表10所示。
实施例10-6
按照实施例10-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（5）中，最终使得所得混合物料中SDS与PHA的质量比为0.3:1000。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和平均分子量进行测定，结果如表10所示。
实施例10-7
按照实施例10-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（9）中板框过滤机的滤布不预涂覆聚羟基脂肪酸酯层。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和平均分子量进行测定，结果如表10所示。
实施例10-8
按照实施例10-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（7）中板框过滤机的滤布预涂覆的聚羟基脂肪酸酯层的厚度为20mm。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和平均分子量进行测定，结果如表10所示。
对比例10-1
（1）将制备例10-1制备的聚羟基脂肪酸酯发酵液通过碟片式离心机进行离心分离，使得发酵液分成富含菌体细胞的底流（水含量80%重量）（第一菌体细胞）和发酵残液顶流（第一发酵残液），所述发酵残液顶流进入发酵残液暂存罐。
（2）将步骤（1）得到的富含目标菌体细胞的底流用等体积的水洗涤2次，然后泵入带式真空过滤机进行滤干，滤干后的菌体（含水量80%重量）（第二菌体细胞）进入超声波辅助提取罐，滤液（第二发酵残液）进入发酵残液暂存罐。
（3）将所述发酵残液暂存罐中的发酵残液和滤液的混合液泵入板框过滤机进行过滤，过滤的压力为0.4MPa，滤布孔径为10µm，得到第三菌体细胞和第三发酵残液，将第三菌体细胞送入超声波提取罐与步骤（2）中的菌体（第二菌体细胞）混合，第三发酵残液进入吸附分离罐进行吸附处理。
（4）将超声波提取罐中的菌体细胞进行水洗3次，离心分离，得到待破碎菌体细胞，去除其中的杂质。
（5）开启超声波提取罐的搅拌装置，转速为250rpm，向超声波提取罐中加入1倍于待破碎菌体细胞体积的水重悬菌体，得到菌悬液，然后加入溶菌酶得到混合物料，使得所得混合物料中溶菌酶的含量为0.3g/L；然后进行超声破碎，得到含聚羟基脂肪酸酯的浆液，从超声破碎计时开始控制超声功率为600W/m3混合物料进行超声至第75min，然后将超声的功率提高150W/m3进行超声至破碎菌体细胞计时结束，混合物料的温度为35℃，超声破碎的时间为120min，压力为常压。
（6）将所得浆液泵入碟片式离心分离机进行固液分离，转速为7000rpm，分离条件使得浆液分成含氨和菌体碎片等杂质的顶流（液流）和含聚羟基脂肪酸酯的沉淀，然后将所得沉淀返回到提取罐中水洗3次，所得的含氨和菌体碎片等杂质的顶流用于下一批发酵培养基的配料。
（7）将步骤（6）中水洗后的沉淀送入板框过滤机进行固液分离，得到聚羟基脂肪酸酯和滤液，过滤的条件为：温度为20℃，压力为0.35MPa，时间为2.5h，其中，滤布的孔径为19µm，滤布涂覆有聚羟基脂肪酸酯层（厚度为8mm）；所得滤液作为发酵培养基的配料。
（8）将所得聚羟基脂肪酸酯进行喷雾干燥，得到聚羟基脂肪酸酯干粉。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和平均分子量进行测定，结果如表10所示。
对比例10-2
按照实施例10-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（5）中不加入溶菌酶。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和平均分子量进行测定，结果如表10所示。
对比例10-3
按照实施例10-1的方法提取聚羟基脂肪酸酯，不同的是，步骤（5）中不开启超声设备。
对所得聚羟基脂肪酸酯的收率、纯度和平均分子量进行测定，结果如表10所示。
表10
Figure DEST_PATH_IMAGE010
通过表10的结果可以看出，采用本发明的技术方案提取得到的聚羟基脂肪酸酯具有较高的收率和纯度，以及较高的分子量，而较高的PHA收率和纯度间接地降低了成本。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种发酵制备PHA的方法，其特征在于，该方法包括：
（1）在能够发酵产PHA的条件下，将PHA发酵菌种接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
其中，所述发酵培养基含有碳源、氮源、磷酸盐、镁盐和钠盐，所述氮源为经纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶和酸性蛋白酶酶解处理得到的酶解玉米浆液；
其中，该方法还包括：在发酵的过程中，当发酵培养基中的糖含量第一次下降至12g/L以下时，补充第一营养物质，所述第一营养物质的碳氮比为10-20：1，第一营养物质的补充量为发酵培养基的8-12体积%；
当第一营养物质补充结束后，补充第二营养物质，所述第二营养物质的碳氮比为30-50：1，第二营养物质的补充量为发酵培养基的5-10体积%；
当第二营养物质补充结束后，补充第三营养物质，所述第三营养物质为葡萄糖，第三营养物质的补充量为发酵培养基的20-30体积%；
所述营养物质的补加量使得发酵培养基中的糖含量控制在5-20g/L；
其中，所述发酵在搅拌的条件下进行，以2-7L发酵罐计，从发酵0h到发酵8-12h，所述搅拌的转速为400-600rpm；
从发酵8-12h到发酵16-20h，所述搅拌的转速为600-1000rpm；
从发酵16-20h到发酵结束，所述搅拌的转速为400-600rpm；
其中，所述发酵的条件包括：温度为30-44℃，pH值为7.5-11，溶氧量为1-40%，通风量为0.5-1.5vvm；
其中，所述PHA发酵菌种为嗜盐古菌(Halobacteriaceae)或盐单胞菌(Halomonas sp.)；
（2）将所述发酵液进行第一固液分离，得到发酵清液和菌体沉淀；
（3）将所述菌体沉淀进行破壁，并对所得破壁产物进行板框过滤，得到所述PHA；
其中，所述破壁的方法包括：在溶菌酶的存在下，将菌体沉淀进行第一破壁，得到含聚羟基脂肪酸酯的第一浆液；将所述第一浆液进行固液分离，得到含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀；在SDS的存在下，将所述含有聚羟基脂肪酸酯的沉淀进行第二破壁，得到破壁产物；所述溶菌酶的存在浓度为0.2-0.4 g/L；
其中，所述第一破壁在超声下进行，所述超声的控制方式包括：先进行第一超声，然后再进行第二超声，其中，所述第二超声的功率比所述第一超声的功率高100-200 W/m3菌悬液，所述第一超声的功率为500-600 W/m3菌悬液；
所述第二破壁在超声下进行，所述超声的功率为500-600 W/m3菌悬液；
其中，所述板框过滤的滤布上预涂覆有PHA层；
其中，所述发酵培养基的至少部分配液水为PHA工艺废水，所述PHA工艺废水包括所述发酵清液；该方法还包括对所述PHA工艺废水进行除杂处理并回用至发酵工段，除杂后的PHA工艺废水的COD值<10000 mg/L，色度<80，粘度<20CPS；所述除杂处理的方法为吸附法，包括向所述PHA工艺废水中加入吸附剂，所述吸附剂为活性炭和碳柱的混合吸附剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（1）中，所述发酵培养基以PHA工艺废水添加或不添加纯水作为配液水，
其中，所述碳源选自葡萄糖、淀粉糖化液和高盐糖蜜，其中，所述高盐糖蜜中，以高盐糖蜜的干重为基准，盐含量至少为8重量%，糖含量至少为50重量%；和/或
所述磷酸盐为磷酸氢二钾和磷酸氢二钠；和/或
所述镁盐为硫酸镁和/或氯化镁；和/或
所述钠盐为氯化钠。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤（1）中，所述高盐糖蜜为经酸水解的高盐糖蜜。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，步骤（3）中，预涂覆在所述滤布上的PHA的粒径范围为1-200µm；和/或
所述PHA层的厚度为1-30mm；和/或
预涂覆有PHA层的滤布的孔径为1-25µm。
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