CN114315549A - 一种维生素k2的提取方法 - Google Patents
一种维生素k2的提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114315549A CN114315549A CN202111669617.9A CN202111669617A CN114315549A CN 114315549 A CN114315549 A CN 114315549A CN 202111669617 A CN202111669617 A CN 202111669617A CN 114315549 A CN114315549 A CN 114315549A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- vitamin
- extraction
- extraction method
- enzymolysis
- precipitate
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 title description 5
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 title description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 title description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 title description 4
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 title description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 53
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 49
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 48
- 239000011728 vitamin K2 Substances 0.000 claims abstract description 43
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 claims abstract description 30
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 claims abstract description 30
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 claims abstract description 30
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 claims abstract description 30
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 claims abstract description 30
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 23
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 19
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 13
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 13
- DKHGMERMDICWDU-GHDNBGIDSA-N menaquinone-4 Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C/C=C(C)/CC/C=C(C)/CC/C=C(C)/CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 DKHGMERMDICWDU-GHDNBGIDSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 27
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 16
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 12
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 8
- 238000000194 supercritical-fluid extraction Methods 0.000 claims description 8
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 claims description 7
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 7
- PFRQBZFETXBLTP-UHFFFAOYSA-N Vitamin K2 Natural products C1=CC=C2C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C(=O)C2=C1 PFRQBZFETXBLTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000013557 nattō Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000019143 vitamin K2 Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 claims description 5
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 5
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000003815 supercritical carbon dioxide extraction Methods 0.000 claims description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 abstract description 18
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 abstract description 8
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 14
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 13
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 9
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 description 6
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 6
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000001694 spray drying Methods 0.000 description 5
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 4
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 3
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Substances CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 2
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 1
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000037182 bone density Effects 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000004821 distillation Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 102000043253 matrix Gla protein Human genes 0.000 description 1
- 108010057546 matrix Gla protein Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- 239000011772 phylloquinone Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种维生素K2的提取方法，包括以下步骤：(1)以孔径度50‑400nm的滤膜过滤维生素K2发酵液，收集滤液；(2)调节滤液pH值至4.0‑5.0，收集沉淀；(3)以水溶解沉淀得到反应液，调节溶液pH值至6.0‑8.0并加入蛋白酶酶解，提取得到维生素K2。本发明所述提取方法的提取率可达到86％以上，并且纯度达到95％以上。提取过程不使用有机溶剂，安全环保，并且水溶液中提取的成本更低，有利于促进微生物发酵法制备维生素K2的大规模应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种维生素K2的提取方法。
背景技术
维生素K2是一种脂溶性维生素，最早在发酵后的纳豆中提取发现，其功能类别属于营养强化剂，被国内外广泛应用于保健食品、调制乳粉及普通食品中。目前已有大量文献和临床试验证明，维生素K2除了具备和维生素K1相同的促凝血功能以外，同时K2可以羧化激活骨钙素蛋白提高骨骼密度、通过激活基质Gla 蛋白来改善血管壁钙沉积从而避免心血管疾病，同时也有部分研究证实维生素 K2对肝脏、糖尿病和神经系统疾病有预防作用。因此维生素K2的产业化生产非常必要。
目前维生素K2可以通过化学合成、生物发酵法等工艺进行生产。生物发酵法采用纳豆枯草芽孢杆菌液态发酵工艺生产，以较低的浓度存在于发酵液中，需要通过进一步提取纯化工艺获得较高浓度的维生素K2。
但是，由于维生素K2是一种脂溶性维生素，现有技术从发酵液中提取维生素K2大多采用有机溶剂进行分离，不但提取成本高，且会带来环境污染或产品有机溶剂残留的风险。例如中国专利CN104328064B使用正己烷、异丙醇等有机溶剂进行萃取，分离后再经减压蒸馏去除溶剂。中国专利CN104262129B和CN 103571897 A等采用柱层析设备，通过正己烷、石油醚、丙酮等试剂梯度或等度洗脱的纯化工艺对发酵液中的维生素K2进行分离提取。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种不借助有机溶剂或仅使用少量有机溶剂的维生素K2提取方法，兼具高提取率和高纯度的维生素K2提取方法，提取成本低，绿色安全。
为了实现上述目的，本发明提供了一种维生素K2的提取方法，包括以下步骤：
(1)以孔径度50-400nm的滤膜过滤维生素K2发酵液，收集滤液；
(2)调节滤液pH值至4.0-5.0，收集沉淀；
(3)以水溶解沉淀得到反应液，调节溶液pH值至6.0-8.0并加入蛋白酶酶解，水解温度45-55℃，提取得到维生素K2。
优选的，步骤(1)所述维生素K2发酵液选自纳豆枯草芽孢杆菌。
优选的，步骤(1)所述滤膜为陶瓷膜或有机膜。
优选的，步骤(2)所述收集沉淀前，还包括搅拌滤液。
优选的，步骤(3)所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶和/或枯草芽孢杆菌中性蛋白酶。
优选的，步骤(3)所述酶解的温度为40-60℃。
优选的，步骤(3)所述酶解的时间为2-6h。
优选的，步骤(3)所述酶解过程还伴随搅拌。
优选的，步骤(3)所述酶解后还包括下述纯化步骤：
(a)对酶解后得到的溶液干燥，制粒，得到含维生素K2的颗粒；
(b)对含维生素K2的颗粒进行二氧化碳超临界萃取，得到纯化的维生素 K2。
优选的，步骤(b)所述超临界萃取的条件包括：设置萃取温度50-60℃，萃取压力30-35MPa；产品分离温度50-60℃，分离压力5-8MPa；杂质分离温度40-50℃，分离压力3-6MPa。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
在对维生素K2发酵液的纯化处理过程中，发明人意外发现当发酵液的pH 值调节至4.0-5.0时，发酵液中会形成大量的沉淀物，此时，在滤液中无法检测或仅能检测到少量维生素K2。进一步研究发现，发酵液中的维生素K2的非极性部位与蛋白质组分之间以疏水性相互作用，结合形成类似于脂蛋白的水溶性复合物结构，通过对发酵液的pH调节，当达到该水溶性复合物相应的蛋白等电点，发酵液中的蛋白沉淀，此时，维生素K2被蛋白组分包覆。发明人进一步研究显示，将沉淀物分离出来后，重新加水，沉淀可重新复溶，使用蛋白酶酶解可以破坏该水溶性复合物结构，分离并释放维生素K2的同时还能有利于实现高效纯化。
有鉴于此，本发明借助上述类似脂蛋白结构的水溶性复合物的性质，通过过滤、pH值调节生成沉淀复合物、复溶后破坏水溶性复合物结构，进一步通过二氧化碳超临界萃取工艺获得提取率高且纯度高的维生素K2。本发明所述提取方法的提取率可达到86％以上，并且维生素K2的纯度达到95％以上。提取过程不使用有机溶剂，安全环保，并且水溶液中提取的成本更低，有利于促进微生物发酵法制备维生素K2的大规模应用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。需要说明的是，基于本发明中的这些实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提供了本发明提供了一种维生素K2的提取方法，包括以下步骤：
本发明首先以50-400nm滤膜过滤维生素K2发酵液，收集滤液。发酵液中含有大量菌体、发酵培养基以及发酵副产物，以孔径度50-400nm的滤膜过滤维生素K2发酵液是为了去除杂质，便于后续维生素K2分离提取。在本发明中，所述维生素K2发酵液包括但不限于枯草芽孢杆菌的发酵液，也可以是通过基因工程、诱导或筛选等方法得到的可以发酵产生维生素K2的微生物的发酵液，只要其发酵液中包含维生素K2均可适用本发明所述方法。
在本发明的一些具体实施方式中，所述维生素K2发酵液可以按照下述方法制备得到：
S1、将维生素K2发酵菌种接入种子培养基中培养，得到种子发酵液；
S2、将种子发酵液按照不超过10％的接种量接入发酵培养基中培养，得到维生素K2发酵液。
在本发明中，所述种子培养基可以LB培养基等；在本发明中，所述发酵培养基可以是：葡萄糖2-20g/L；大豆蛋白胨1-8g/L，酵母粉1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，硫酸镁2-10g/L，pH调至6.5-7.5。在本发明的一些具体实施例中，所述步骤S2发酵至发酵液中的维生素K2含量不低于250μg/mL。
在本发明中，所述滤膜的规格优选为100-300nm；在本发明的一些具体实施方式中，所述滤膜可以采用陶瓷膜或有机膜。
得到滤液后，本发明调节滤液pH值至4.0-5.0，收集沉淀。将滤液pH值调节至4.0-5.0是为了促使滤液中的蛋白与维生素K2形成的脂蛋白结构产生沉淀，维生素K2被包覆在水溶性复合物中。本发明可以采取离心或过滤等方式将水不溶性复合物的沉淀分离。
在本发明中，为了促进水不溶性复合物的形成，本发明优选的在调节滤液 pH值后对其进行搅拌，所述搅拌转速优选为40-200rpm，所述搅拌时间优选为 2min-30min。
得到沉淀后，本发明以水重新溶解沉淀得到反应液，调节溶液pH值至 6.0-8.0并加入蛋白酶酶解。本发明研究显示，蛋白酶酶解均能够促使水溶性复合物外层的蛋白分解，有利于后续维生素K2的提取纯化。在本发明的一些具体实施例中，以水溶解沉淀时，沉淀与水的质量体积比优选为1：4-1：7，更优选为1:5。本发明所述的蛋白酶包括但不限于木瓜蛋白酶、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶等。在本发明中，所述酶解的温度优选为40-60℃，更优选为45-50℃。在本发明中，所述酶解时间优选为2-6h，更优选为3-4h。在本发明中，所述酶解过程中优选的伴随搅拌；所述搅拌速率优选为80-140rpm。
在本发明中，为了进一步获得高纯度的维生素K2，本发明在所述酶解后还包括下述纯化步骤：
(a)对酶解后得到的溶液干燥，制粒，得到含维生素K2的颗粒；
(b)对含维生素K2的颗粒进行二氧化碳超临界萃取，得到纯化的维生素 K2。
在本发明的一些具体实施方式方式中，所述步骤(a)中的制粒包括对粉末加水或乙醇进行造粒、烘干，烘干后的含维生素K2的颗粒。在本发明中，所述步骤(a)中的干燥方式优选为喷雾干燥；在本发明的一些具体实施方式中，所述喷雾干燥的进风温度为180-200℃、出风温度为80-100℃。在本发明的一些具体实施方式中，步骤(b)所述超临界萃取的条件包括：萃取温度 50-65℃、萃取压力28-35MPa、分离温度40-60℃以及分离压力5-12MPa。按照上述方法纯化后得到的维生素K2，其纯度可达到95％以上。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1、发酵：
(1)以纳豆枯草芽孢杆菌作为生产菌种，接入LB培养基中，在摇床中以转速220rpm，温度37℃，培养12h，制备种子液。
(2)发酵培养基：葡萄糖2-20g/L；大豆蛋白胨1-8g/L，酵母粉1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，硫酸镁2-10g/L，pH调至6.5-7.5。；
(3)将种子液以2％的接种量加入到发酵培养基中，300rpm，37℃发酵96h，经HPLC检测发酵液中维生素K2含量250μg/mL。
2、陶瓷膜分离：
(1)发酵液经陶瓷膜循环，菌体及颗粒度较大的杂质被截留，收集透过液；
(2)过程中截留液取样，离心取上清液经HPLC检测K2含量，直至K2含量低于10μg/mL，停止陶瓷膜过滤；
3、蛋白沉淀：
(1)将透过液加入搅拌罐内，搅拌转速150rpm，向透过液中加入浓度 1M-5M的盐酸或硫酸溶液，调节透过液的pH至4.0-5.0，直至不再出现新的沉淀蛋白；
4、蛋白分离：
(1)将沉淀后的透过液泵入碟片离心机，离心转速8000rpm，分离得到沉淀蛋白；
5、蛋白酶解：
(1)将分离后的沉淀蛋白加入5倍体积的纯水，搅拌至蛋白全部复溶；
(2)加入市售中性蛋白酶，酶的加入量100U/mL，搅拌转速100rpm，酶解温度50℃，酶解蛋白，过程中维持pH6.0-8.0，酶解时间6h；
6、喷雾干燥：
(1)将酶解后的料液通过喷雾干燥，进风温度180-200℃，出风温度 80-100℃，制得粉剂；
7、造粒：
(1)收集喷雾干燥后的粉剂，按照固液比1:1，在粉末中加入75％的乙醇，充分搅拌均匀；
(2)将上述粉末加入旋转制粒机中进行造粒，造粒颗粒度5*10mm；
(3)将制成的颗粒置于真空干燥箱中烘干，烘干温度70℃，真空度＜ -0.8MPa，烘干至含水量10％。
8、超临界萃取：
(1)烘干后的颗粒加入二氧化碳超临界萃取设备的萃取釜内,其中，设置萃取温度50-60℃，萃取压力30-35MPa；产品分离温度50-60℃，分离压力 5-8MPa；杂质分离温度40-50℃，分离压力3-6MPa，萃取分离得到维生素K2。
(2)从分离釜中收集纯化后的维生素K2浓缩液。
经检测，分离得到纯度达95％的维生素K2，对比初始发酵液中的K2总量，萃取得率为89％。
对比例1
1、发酵：
(1)以纳豆枯草芽孢杆菌作为生产菌种，接入LB培养基中，在摇床中以转速220rpm，温度37℃，培养12h，制备种子液。
(2)发酵培养基：葡萄糖2-20g/L；大豆蛋白胨1-8g/L，酵母粉1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，硫酸镁2～10g/L，pH调至6.5-7.5。
(3)将种子液以2％的接种量加入到发酵培养基中，300rpm，37℃发酵96h，经HPLC检测发酵液中维生素K2含量250ug/mL。
2、陶瓷膜分离：
(1)发酵液经陶瓷膜循环，菌体及颗粒度较大的杂质被截留，收集透过液；
(2)过程中截留液取样，离心取上清液经HPLC检测K2含量，直至K2 含量低于10ug/mL，停止陶瓷膜过滤；
3、真空浓缩：
(1)将透过液进入真空浓缩器，进行减压浓缩，浓缩温度60℃，真空度 -0.6MPa；
(2)最终透过液浓缩至初始体积的1/8，此时料液中的K2浓度为1875μ g/mL；
4、萃取：
(1)将以上浓缩后的料液，加入5倍体积的正己烷，搅拌2小时后，再加入1倍体积的异丙醇，搅拌1小时，静置分层后，收集上层有机相。
(2)将收集得到的有机相减压蒸馏，得到维生素K2浓缩液。
经检测，分离得到纯度达55％的维生素K2，对比初始发酵液中的K2总量，萃取得率为67％。
对比例2
1、发酵：
(1)以纳豆枯草芽孢杆菌作为生产菌种，接入LB培养基中，在摇床中以转速220rpm，温度37℃，培养12h，制备种子液。
(2)发酵培养基：葡萄糖2-20g/L；大豆蛋白胨1-8g/L，酵母粉1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，硫酸镁2-10g/L，pH调至6.5-7.5。
(3)将种子液以2％的接种量加入到发酵培养基中，300rpm，37℃发酵96h，经HPLC检测发酵液中维生素K2含量250ug/mL。
2、陶瓷膜分离：
(1)发酵液经陶瓷膜循环，菌体及颗粒度较大的杂质被截留，收集透过液；
(2)过程中截留液取样，离心取上清液经HPLC检测K2含量，直至K2含量低于10μg/mL，停止陶瓷膜过滤；
3、蛋白沉淀：
(1)将透过液加入搅拌罐内，搅拌转速150rpm，向透过液中加入浓度 1M-5M的盐酸或硫酸溶液，调节透过液的pH至4.0-5.0，直至不再出现新的沉淀蛋白；
4、蛋白分离：
(1)将沉淀后的透过液泵入碟片离心机，离心转速8000rpm，分离得到沉淀蛋白；
5、真空干燥：
(1)将沉淀蛋白置于真空干燥箱中，温度60℃，真空度-0.8MPa，烘干至水分5％±1％；
6、造粒：
(1)收集真空干燥后的粉剂，按照固液比1:1，在粉末中加入纯水，充分搅拌均匀；
(2)将上述粉末加入旋转制粒机中进行造粒，造粒颗粒度5*10mm；
(3)将制成的颗粒置于真空干燥箱中烘干，烘干温度70℃，真空度＜ -0.8MPa，烘干至含水量8％。
7、超临界萃取：
(1)烘干后的颗粒加入二氧化碳超临界萃取设备的萃取釜内,其中，设置萃取温度50-60℃，萃取压力30-35MPa；产品分离温度50-60℃，分离压力 5-8MPa；杂质分离温度40-50℃，分离压力3-6MPa，萃取分离得到维生素K2。
(2)从分离釜中收集纯化后的维生素K2浓缩液。
经检测，分离得到纯度达91％的维生素K2，对比初始发酵液中的K2总量，萃取得率为36％。
表1
| 维生素K<sub>2</sub>纯度 | 维生素K<sub>2</sub>得率 | |
| 实施例1 | 95％ | 89％ |
| 对比例1 | 55％ | 67％ |
| 对比例2 | 91％ | 36％ |
由表1可以看出，与对比例1的有机溶剂萃取工艺对比，本发明所述提取方法所得维生素K2纯度和得率提高，尤其是纯度提高了近1倍；与对比例2 虽然经过pH值4.0-5.0形成水不溶性复合物沉淀，但未进行蛋白酶酶解的提取方法相比，本发明所述提取方法所得维生素K2得率有显著性提升。可见，本发明提供的维生素K2提取方法是一种兼具高提取率和高纯度的水溶液提取方法，制备成本低，绿色环保，有利于大规模生产。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种维生素K2的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以孔径度50-400nm的滤膜过滤维生素K2发酵液，收集滤液；
(2)调节滤液pH值至4.0-5.0，收集沉淀；
(3)以水溶解沉淀得到反应液，调节溶液pH值至6.0-8.0并加入蛋白酶酶解，水解温度45-55℃，提取得到维生素K2。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述维生素K2发酵液选自纳豆枯草芽孢杆菌。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(1)所述滤膜为陶瓷膜或有机膜。
4.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(2)所述收集沉淀前，还包括搅拌滤液。
5.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述蛋白酶选自木瓜蛋白酶和/或枯草芽孢杆菌中性蛋白酶。
6.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述酶解的温度为40-60℃。
7.根据权利要求1或6所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述酶解的时间为2-6h。
8.根据权利要求1或6所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述酶解过程还伴随搅拌。
9.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤(3)所述酶解后还包括下述纯化步骤：
(a)对酶解后得到的溶液干燥，制粒，得到含维生素K2的颗粒；
(b)对含维生素K2的颗粒进行二氧化碳超临界萃取，得到纯化的维生素K2。
10.根据权利要求9所述的提取方法，其特征在于，步骤(b)所述超临界萃取的条件包括：设置萃取温度50-60℃，萃取压力30-35MPa；产品分离温度50-60℃，分离压力5-8MPa；杂质分离温度40-50℃，分离压力3-6MPa。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111669617.9A CN114315549A (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种维生素k2的提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111669617.9A CN114315549A (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种维生素k2的提取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114315549A true CN114315549A (zh) | 2022-04-12 |
Family
ID=81020165
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111669617.9A Pending CN114315549A (zh) | 2021-12-31 | 2021-12-31 | 一种维生素k2的提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114315549A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1192414A (ja) * | 1997-09-25 | 1999-04-06 | New Food Creation Gijutsu Kenkyu Kumiai | ビタミンｋ２ 濃縮物の製造法 |
| JP2001000175A (ja) * | 1998-05-17 | 2001-01-09 | Hiroyuki Sumi | 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養方法、該方法によって培養される微生物の培養物、該培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体ならびに該微生物の培養物またはビタミンＫ誘導体を含む食品、飲料または飼料 |
| CN104328064A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-02-04 | 丽水双健生物工程有限公司 | 一种纳豆芽孢杆菌及其在发酵生产维生素k2中的应用 |
| CN109824496A (zh) * | 2019-03-12 | 2019-05-31 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种从破壁纳豆芽孢杆菌菌体中提取纯化维生素k2的方法 |
| CN113403348A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-17 | 山东润德生物科技有限公司 | 一种维生素k2的制备方法 |
-
2021
- 2021-12-31 CN CN202111669617.9A patent/CN114315549A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1192414A (ja) * | 1997-09-25 | 1999-04-06 | New Food Creation Gijutsu Kenkyu Kumiai | ビタミンｋ２ 濃縮物の製造法 |
| JP2001000175A (ja) * | 1998-05-17 | 2001-01-09 | Hiroyuki Sumi | 枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）の培養方法、該方法によって培養される微生物の培養物、該培養物由来の水溶性ビタミンＫ誘導体ならびに該微生物の培養物またはビタミンＫ誘導体を含む食品、飲料または飼料 |
| CN104328064A (zh) * | 2014-09-16 | 2015-02-04 | 丽水双健生物工程有限公司 | 一种纳豆芽孢杆菌及其在发酵生产维生素k2中的应用 |
| CN109824496A (zh) * | 2019-03-12 | 2019-05-31 | 中国科学院合肥物质科学研究院 | 一种从破壁纳豆芽孢杆菌菌体中提取纯化维生素k2的方法 |
| CN113403348A (zh) * | 2021-06-18 | 2021-09-17 | 山东润德生物科技有限公司 | 一种维生素k2的制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王颖等: "高效液相色谱法测定多组分配方含维生素K2制剂中七烯甲萘醌的含量", 食品安全质量检测学报, vol. 11, no. 7, 30 April 2020 (2020-04-30), pages 2136 - 2139 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107043330B (zh) | 一种从含1,5-戊二胺盐的溶液体系中提取1,5-戊二胺的方法 | |
| US11155483B1 (en) | Method for efficiently producing PHA | |
| CN109251954B (zh) | 一种海参多肽的生产方法 | |
| CN109400458B (zh) | 一种从微生物发酵液中分离提取辅酶q10的方法 | |
| CN111349218A (zh) | 聚羟基脂肪酸酯的分离方法及其制备的聚羟基脂肪酸酯 | |
| CN107083406A (zh) | (r)‑3‑羟基丁酸的生产方法 | |
| CN111574570B (zh) | 一种蛹虫草培养残基的综合利用方法 | |
| CN107337593B (zh) | 一种辅酶q10纯品的制备方法 | |
| CN113005161A (zh) | 一种聚唾液酸的制备方法及聚唾液酸制品 | |
| JP4275621B2 (ja) | ユビキノン−１０含有溶液の製造方法 | |
| CN114315549A (zh) | 一种维生素k2的提取方法 | |
| US20110201054A1 (en) | Process for improved recovery of fermentation products from intracellular and extracellular presence | |
| CN107778357B (zh) | 一种纽莫康定b0的提取、纯化方法 | |
| CN114213302A (zh) | 一种在水溶液中转化7-脱氢胆固醇制备维生素d3的方法 | |
| CN112481330A (zh) | 一种藻源β-1,3-葡聚糖发酵生产方法 | |
| CN106883286B (zh) | 一种酪氨酸衍生物的提取纯化方法 | |
| CN106496020B (zh) | 一种从微生物发酵液或酶转化液中提取α-酮戊二酸的方法 | |
| CN110607331B (zh) | 一种制备和提取l-亮氨酸的工艺 | |
| CN117050021B (zh) | 一种从发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法 | |
| CN112143759B (zh) | 一种提高红曲菌菌丝体中橙色素得率的方法及应用 | |
| CN109628516B (zh) | 一种l-异亮氨酸的生产和提取工艺 | |
| CN103602652A (zh) | 一种食品级中性蛋白酶的提纯方法 | |
| CN111925421B (zh) | 一种从发酵液中提取纽莫康定b0的方法与应用 | |
| WO2020056714A1 (zh) | 高纯度核黄素磷酸钠的制备方法 | |
| CN116178270A (zh) | 一种提取纯化麦角硫因的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |