CN114213302A - 一种在水溶液中转化7-脱氢胆固醇制备维生素d3的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种在水溶液中转化7‑脱氢胆固醇制备维生素D3的方法，通过过滤截留“7‑脱氢胆固醇‑蛋白”复合物、等电点沉降纯化的方式分离7‑脱氢胆固醇；在水溶性条件下进行光转化和热异构反应生成维生素D3。本发明提供的是一种在水溶液中转化7‑脱氢胆固醇制备维生素D3的方法，纯化7‑脱氢胆固醇的过程绿色环保，光转化率高，维生素D3收率高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种在水溶液中转化7-脱氢胆固醇 制备维生素D3的方法。
背景技术
维生素D3，又称胆钙化醇(Cholecalciferol，VD3)，一种环戊烷多氢菲 类化合物，属于固醇类，是维持机体健康所必需的一种脂溶性维生素。人体内 的VD3主要来源于两个方面：一是从动物类食品中获得，一是以储存在皮肤下 的7-脱氢胆固醇为底物经紫外线照射合成。
7-脱氢胆固醇，又称维生素D3原(7-dehydrocholesterol，7-DHC)，一 种淡黄色结晶粉末，属于一种固醇类物质，存在于动物皮肤内的皮脂腺及其分 泌物中。7-脱氢胆固醇在日光或紫外线照射下可转变为维生素D3，因此其是维 生素D3的前体物质，具有调节钙、磷代谢的生物活性。
传统维生素D3制备方法是以羊毛粗酯为原料，经皂化反应制成胆固醇，再 采用化学合成法的方法，制备成维生素D3。但以羊毛粗酯为生产原料，不仅存 在原料来源的不稳定性，而且产品种还会存在携带动物源疾病的风险，并且化 学合成法不但存在副产物多、条件难控制、环境污染，还会产生多种异构体等 问题。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等微生物中存在7-脱氢胆固醇合 成途径，目前采用酿酒酵母等微生物发酵生产7-脱氢胆固醇，再经紫外线照射 转化制备维生素D3的方法，避免了动物原疾病的风险，弥补了传统制备方法的 不足。但将发酵液中7-脱氢胆固醇提取出来，现有技术中均采用大量有机溶剂 进行萃取。
中国专利CN 113025512和中国专利112813129中均公开了一种通过生物技 术构建高产7-脱氢胆固醇的酵母菌的方法，但未公开其转化为维生素D3和提纯 的方法。中国专利CN102850248公开了一种以7-脱氢胆固醇溶液为原料，在有 机溶剂(甲醇、正己烷)中进行光化学反应的维生素D3制备方法，先通过柱层 析法得到高含量的维生素P3，再通过热异构和结晶方式得到维生素D3纯品，但 该方法不仅使用大量有机溶剂，而且光转化率低，仅为10-20％，收率也仅为40％。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种在水溶液中转化7-脱氢胆固醇 制备维生素D3的方法，纯化7-脱氢胆固醇的过程绿色环保，光转化率高，维生 素D3收率高。
为了实现上述目的，本发明提供了一种维生素D3的制备方法，包括以下 步骤：
(1)微生物发酵制备7-脱氢胆固醇，得到7-脱氢胆固醇发酵液；
(2)以50-200nm滤膜过滤7-脱氢胆固醇发酵液，收集被截留部分，得 到截留液；
(3)对截留液进行菌体裂解，离心收集上清，得到裂解液；
(4)调节裂解液pH值至4.5-5.0，静置，收集沉淀，得到沉淀物；
(5)以水溶解沉淀并调节溶液pH值至7.0，以290-305nm的紫外光照射， 得到第一反应溶液；
(6)将第一反应溶液加热至50-60℃，得到含维生素D3的溶液。
优选的，步骤(1)用于发酵7-脱氢胆固醇的微生物选自酿酒酵母、毕赤 酵母和热带假丝酵母中的一种或多种。
优选的，步骤(2)所述过滤方法为陶瓷膜过滤。
优选的，步骤(3)所述菌体裂解方法为超声破碎。
优选的，步骤(5)的反应温度为30-40℃。
优选的，步骤(5)所述紫外光照射时间为3-5h。
优选的，所述方法还包括：(7)以有机溶剂萃取含维生素D3的溶液，分 离有机相，干燥，得到维生素D3纯品。
优选的，步骤(7)所述有机溶剂为5:1-2:1的环己烷和异丙醇溶液。
优选的，步骤(7)所述有机溶剂与含维生素D3的溶液的体积比为2-3:1。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
7-脱氢胆固醇为固醇类物质，其本身不溶于水因而传统的7-脱氢胆固醇 提取方法均使用有机溶剂进行提取。本发明意外发现，发酵液中的7-脱氢胆 固醇以“7-脱氢胆固醇-蛋白复合物”的形式存在，为水溶性复合物，因此， 本发明通过过滤截留“7-脱氢胆固醇-蛋白”复合物、等电点沉降纯化的方式 分离7-脱氢胆固醇；在水溶性条件下进行光转化和热异构反应生成维生素D3。
采用本发明本发明提供方法制备的维生素D3，纯化7-脱氢胆固醇时不使 用或仅使用少量有机溶剂，绿色环保，成本低且更为安全；本发明所述方法的 7-脱氢胆固醇光转化率在70％以上，维生素D3收率在80％以上。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行描述。显然，所描述 的实施例仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。需要 说明的是，基于本发明中的这些实施例，本领域普通技术人员所获得 的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟 悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无 特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产 品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于 本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提供了一种维生素D3的制备方法，包括以下步骤：
本发明首先通过微生物发酵方法7-脱氢胆固醇，得到7-脱氢胆固醇发酵 液。在本发明中，用于发酵7-脱氢胆固醇的微生物包括但不限于酵母菌，所 述酵母菌可以是酿酒酵母、毕赤酵母和热带假丝酵母中的一种或多种；也可以 是通过基因工程改造的工程菌；在本发明的一些具体实施方式中，所述发酵 7-脱氢胆固醇的微生物为酒酿酵母；优选的，酒酿酵母发酵7-脱氢胆固醇的 条件包括：按5％-10％的比例接种酿酒酵母种子液到含酵母粉10-15g/L、蛋白 胨8-10g/L、葡萄糖50-60g/L、KH2PO48-10g/L、MgSO42-4g/L的发酵液中进行 发酵培养，培养温度30±0.5℃，发酵培养36-50h。。
得到7-脱氢胆固醇发酵液后，本发明以50-200nm滤膜过滤7-脱氢胆固醇 发酵液，收集被截留部分，得到截留液。本发明意外发现，通过微生物发酵方 法获得的发酵液中，固醇类物质7-脱氢胆固醇与可溶性蛋白结合，形成“7- 脱氢胆固醇-蛋白复合物”。本发明通过50-200nm滤膜将发酵液中的部分杂质 去除，“7-脱氢胆固醇-蛋白复合物”和菌体等大分子物质被截留。在本发明的 一些具体实施方式中，所述过滤设备采用陶瓷膜。
得到截留液后，本发明对截留液进行菌体裂解，离心收集上清，得到裂解 液。本发明对菌体裂解可进一步释放细胞内的“7-脱氢胆固醇-蛋白复合物” 至溶液中。本发明所述菌体裂解可以采用本领域已知的各类方式，包括但不限 于反复冻融、超声破碎、渗透法、裂解液裂解中的一种或多种；在本发明的一 些具体实施方式中，所述菌体裂解采用超声破碎法，无需额外添加试剂。在本 发明的一些具体实施方式中，超声破碎的频率优选为15-25Hz。通过离心可去 除菌体碎片。
得到裂解液后，本发明调节裂解液pH值至4.5-5.0，静置，收集沉淀， 得到沉淀物。pH值4.5-5.0为“7-脱氢胆固醇-蛋白复合物”的蛋白等电点， 本发明通过等电点沉降初步纯化7-脱氢胆固醇。在本发明中，所述静置时间 优选为15-120min，更优选为30-60min。
得到沉淀物后，本发明以水溶解沉淀并调节溶液pH值至7.0，以290-305nm 的紫外光照射，得到第一反应溶液。“7-脱氢胆固醇-蛋白复合物”为水溶性物 质，以水复溶后可直接作为光反应的底物进行反应，7-脱氢胆固醇在紫外光照 射下反应生成维生素D3的前体物质“预-维生素D3”。在本发明中，紫外光照 射时间优选为3-5h，如3h、3.5h、4h、4.5h、5h等。在本发明中，紫外光照 射时的溶液反应温度优选为30-40℃。
得到第一反应溶液后，本发明将第一反应溶液加热至50-60℃，得到含维 生素D3的溶液。反应过程中，维生素D3的前体物质“预-维生素D3”通过热异 构反应转化为维生素D3。
本发明优选的，为了进一步纯化维生素D3，还可以包括如下步骤：以有机 溶剂萃取含维生素D3的溶液，分离有机相，减压干燥，得到维生素D3纯品。 除了上述方法外也可以采用其他纯化方法获得维生素D3纯品。在本发明的一 些具体实施方式中，用于萃取维生素D3的有机溶剂为5:1-2:1的环己烷和异 丙醇溶液；优选的，有机溶剂与含维生素D3的溶液的体积比为2-3:1。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它 们理解为对本发明保护范围的限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
1.酿酒酵母发酵液经过孔径为200nm的陶瓷膜过滤，收集截留液。截留液 经过频率为20Hz的超声波进行细胞破碎，离心后收集清液。
2.离心清液加入1％盐酸调节pH至5.0，生成沉淀，离心收集此沉淀。
3.向步骤2中收集的沉淀中加入5倍体积的纯水，加1％NaOH调节pH至 7.0，搅拌30分钟，此时沉淀溶解，溶液澄清。
4.溶液升温至30℃，经过波长为290nm的紫外线照射4小时，然后加热 至60℃，搅拌1小时。
5.向步骤4溶液中加入3倍体积的环己烷和异丙醇混合溶液(环己烷：异 丙醇为2：1)，搅拌1小时后，静置分层，收集上层有机相，减压浓缩，获得 纯度为80.5％的维生素D3。
实施例2
1.酿酒酵母发酵液经过孔径为100nm的陶瓷膜过滤，收集截留液。截留液 经过频率为25HZ的超声波进行细胞破碎，离心后收集清液。
2.离心清液加入1％盐酸调节pH至5.5，生成沉淀，离心收集此沉淀。
3.向步骤2中收集的沉淀中加入4倍体积的纯水，加1％NaOH调节pH至 7.0，搅拌30分钟，此时沉淀溶解，溶液澄清。
4.溶液升温至35℃，经过波长为300nm的紫外线照射3小时，然后加热 至50℃，搅拌1小时。
5.向步骤4溶液中加入3倍体积的环己烷和异丙醇混合溶液(环己烷：异 丙醇为2：1)，搅拌1小时后，静置分层，收集上层有机相，减压浓缩，获得 纯度为81.7％的维生素D3。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰， 这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种维生素D3的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)微生物发酵制备7-脱氢胆固醇，得到7-脱氢胆固醇发酵液；
(2)以50-200nm滤膜过滤7-脱氢胆固醇发酵液，收集被截留部分，得到截留液；
(3)对截留液进行菌体裂解，离心收集上清，得到裂解液；
(4)调节裂解液pH值至4.5-5.0，静置，收集沉淀，得到沉淀物；
(5)以水溶解沉淀并调节溶液pH值至7.0，以290-305nm的紫外光照射，得到第一反应溶液；
(6)将第一反应溶液加热至50-60℃，得到含维生素D3的溶液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)用于发酵7-脱氢胆固醇的微生物选自酿酒酵母、毕赤酵母和热带假丝酵母中的一种或多种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述过滤方法为陶瓷膜过滤。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述菌体裂解方法为超声破碎。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)的反应温度为30-40℃。
6.根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)所述紫外光照射时间为3-5h。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括：
(7)以有机溶剂萃取含维生素D3的溶液，分离有机相，干燥，得到维生素D3纯品。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)所述有机溶剂为体积比5:1-2:1的环己烷和异丙醇溶液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(7)所述有机溶剂与含维生素D3的溶液的体积比为2-3:1。
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