CN107267419B - 一种生产4-hp的菌株及高产量4-hp的制备方法 - Google Patents

一种生产4-hp的菌株及高产量4-hp的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种生产4‑HP的副偶然分枝杆菌株，其分类命名为Mycobacterium parafortuitum BK12，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NO.M2017084；该菌株是经过诱变筛选后得到的新菌株，能够高效转化甾醇生产4‑HP，产生以4‑HP为主产物的发酵液，简化后续分离提取步骤，并具有较高的生产稳定性。本发明还公开了一种利用所述的副偶然分枝杆菌得到高产量4‑HP的制备方法；本发明所述的高产量4‑HP的制备方法可以将发酵培养基中高达3份的甾醇类转化为4‑HP，且甾醇投放为3份时，转化率达90％，从而在保证单次转化率的基础上，增加单次生产产量。

Description

一种生产4-HP的菌株及高产量4-HP的制备方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种高效生产4-HP的菌株及高产量4-HP的制备方法。
背景技术
甾体类药物是仅次于抗生素的第二类药物，在临床领域有着十分广泛的应用，如肾上腺皮质激素具有抗炎症、抗过敏、抗休克和抗变态反应等功效，广泛用于治疗类风湿性关节炎、支气管哮喘和湿疹等疾病；糖皮质素可治疗和缓解胶原性疾病、过敏性休克等难治或危险性疾病，也是治疗爱迪森氏等内分泌疾病的不可缺少的药物；各类性激素是治疗雄性器官衰退和某些妇科疾病的主要药物，是口服避孕药的主要成分。此外，甾体激素药物还具有改善蛋白代谢、恢复和增强体力、利尿降压等作用。由于甾体结构极其复杂，目前利用全合成的方法比较困难，通常以具有甾体母核结构的甾体中间体采用半合成的方法改造后制得。甾体类药物的需求量不断增加，获得高产量的甾体中间体对于制备甾体类药物至关重要。
20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮(20α-Hydroxymethyl-pregna-4-dien-3-one,4-HP)是一种关键的甾体类药物中间体，在甾体工业化生产中起着重要作用。利用20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮为前体物能够合成黄体酮、17α-OH黄体酮、氢化可的松、倍他米松、地塞米松、可的松、氟美松和依普利酮等多种甾体原料药，具有重要的商业价值。因此，提高20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮的生产能力一直是人们研究的热点。
美国专利US3759791中公开了一种微生物转化生产4-AD的方法，通过分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRLB-3805选择性切除胆固醇和豆甾醇上8个碳原子以上的侧链，从而得到雄烯二酮(4-AD)、4-HP和20α-羟甲基-孕甾-1,4-双烯-3-酮(HPD)；但该方法得到的发酵主要产物是4-AD，4-HP在发酵总产物中的含量仅有4％左右。
美国专利US 4223091公布了一株可以生产4-HP的菌株Mycobacteriumparafortuitum complex MCI 0617，该菌株可以消耗甾醇生产20α-羟甲基-孕甾-1,4-双烯-3-酮(HPD)和20α-羟甲基-孕甾-4-烯-3-酮(4HP)，Mycobacterium parafortuitumcomplex MCI 0617转化总产率达85％，但其中生产的4-HP仅占发酵总产物的7％。
上述两种微生物转化方法，由于缺少高效、专一生产4-HP的微生物，4-HP均以副产物形式出现，且4-HP在发酵产物中所占比例极低，导致分离提取困难、生产成本高等一系列问题，无法满足4-HP的工业生产的需求。
中国专利CN101918436A中公开了一种4-HP的生产方法，通过重组DNA技术获得能够制备4-HP的重组工程菌，但重组工程菌遗传稳定性差，在保存过程中及转化底物过程中易产生重组DNA逃逸，无法稳定表达外源DNA产物；且重组DNA在表达量高时会影响携带重组DNA细胞的正常代谢，严重限制了重组工程菌在工业生产中的长效应用，无法满足4-HP的工业生产的需求。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的微生物转化生产4-HP的转化率低、4-HP只能以微量的副产物形式产生以及发酵过程稳定性差，无法持续生产4-HP的问题，从而提供一株稳定高效生产4-HP的副偶然分枝杆菌，以及应用该菌株制备高产量4-HP的方法。
本发明提供了一种副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12，已保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏地址：中国武汉大学，其保藏编号是CCTCC NO.M2017084，保藏日期是2017年3月6日。
本发明提供了一种含所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12的菌剂，还包括所述菌株生长的培养基。所述培养基可以为普通培养基，能够满足微生物生长对营养的需求，如在固体培养中添加富含淀粉、糖类以及氮源等的常见材料如大豆饼粉、玉米粉、大米粉和蛋白胨等材料；如在液体培养基中，添加富含碳源，氮源等的培养基也能满足本发明的需求。
本发明提供了一种高产量4-HP的制备方法，所述制备方法包括使用所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12或所述的的副偶然分枝杆菌菌株BK12的菌剂。
所述的高产量4-HP的制备方法，包括如下步骤：
(1)接种所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12或所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12的菌剂接种到种子培养基中扩大培养，得到扩大培养液；
(2)接种所需量的步骤(1)中得到的扩大培养液到发酵培养基中，通过微生物转化发酵生产4-HP。
所述的高产量4-HP的制备方法，在所述步骤(2)中，接种的所述扩大培养液中菌种的密度为OD600：5.0-12.0，所述扩大培养液的接种量为所述发酵培养基体积的5-15％。
所述的高产量4-HP的制备方法，所述种子培养基包括如下重量份的组分：碳源0.5-5重量份和氮源0.2-8重量份。
所述的高产量4-HP的制备方法，所述扩大培养的条件为：控制温度28-33℃，搅拌转速100-500rpm，pH 6.5-7.5，培养时间48-60h。
所述的高产量4-HP的制备方法，所述发酵培养基包括如下重量份的组分：甾醇0.5-5重量份、碳源0.1-3份、氮源0.1-6重量份、无机盐0.01-1重量份和水72.6-86.8重量份。
所述的高产量4-HP的制备方法，所述甾醇为植物甾醇和/或动物甾醇。
所述的高产量4-HP的制备方法，所述发酵培养基还包括植物油2-20重量份。
所述的高产量4-HP的制备方法，所述植物油包括大豆油、玉米油、花生油、菜籽油、葵花油中的一种或几种的混合物。
所述的高产量4-HP的制备方法，所述碳源包括葡萄糖、糖蜜、甘油、麦芽糖和可溶性淀粉中的一种或几种的混合物；所述氮源包括酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉和硫酸铵中的一种或几种的混合物；所述无机盐包括镁盐、磷酸盐、钠盐和硝酸盐中的一种或几种的混合物。
所述的高产量4-HP的制备方法，所述发酵培养基包括葡萄糖0.5-2.0重量份、酵母膏0.2-0.5重量份、蛋白胨0.2-0.5重量份、玉米浆2.5-4.0重量份、磷酸二氢钾0.02-0.08重量份、硝酸钠0.02-0.6重量份、大豆油8-18重量份和植物甾醇1-3重量份。
所述的高产量4-HP的制备方法，所述微生物转化的发酵条件为：控制温度28-35℃，pH 5.5-8.5，通气量0.05-1vvm，搅拌转速100-500rpm，发酵时间72-200h。
所述的高产量4-HP的制备方法，所述微生物转化的发酵条件为：控制温度30-32℃，pH 6.8-7.5，通气量0.1-0.5vvm，搅拌转速200-400rpm，发酵时间72-200h。
本发明提供了一种上述的副偶然分枝杆菌菌株BK12或上述的含所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12的菌剂在制备甾体类药物中的应用。
本发明相对现有技术具有如下优点：
1.本发明提供的一种副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NO.M2017084。所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12是经过低能N+离子束诱变筛选后得到的新菌株，利用副偶然分枝杆菌菌株BK12能够高效转化甾醇生产4-HP，平均转化率达90％左右；同时，通过副偶然分枝杆菌菌株BK12生产4-HP，能够有效减少4-HP生产过程中形成的AD、ADD、HPD等杂质，得到以4-HP为主要产物的发酵液，简化了后续分离提取4-HP的步骤，进而提高了4-HP的生产效率；副偶然分枝杆菌菌株BK12菌株相比基因工程菌有更好的遗传稳定性，能稳定转化生产4-HP。
2.本发明提供的高产量4-HP的制备方法，利用副偶然分枝杆菌菌株BK12转化甾醇类底物，转化效率高，能够以4-HP为主要产物的高浓度的转化产物。
3.本发明提供的高产量4-HP的制备方法，对副偶然分枝杆菌菌株BK12扩大培养，得到扩大培养液；本发明提供了优化的扩大培养基的组分和扩大培养条件，能够提高发酵前菌株的数量和质量，进而缩短了发酵时间并保证了菌株的转化发酵能力。
4.本发明提供的高产量4-HP的制备方法，优化了副偶然分枝杆菌菌株BK12发酵培养基的成分和发酵条件，采用该方法生产4-HP，底物的投放浓度在高达3％时，底物转化率达90％；在保证了单次转化率的基础上，加大了单次生产的数量，有利于在工业领域的大规模生产以及应用。
5.本发明提供的高产量4-HP的制备方法，所使用的发酵培养基中包括植物油，植物油选自大豆油、玉米油、花生油、菜籽油、葵花油中的一种或几种的混合物，通过添加植物油，提高了4-HP的转化产率，通过控制植物油的含量有利于控制发酵培养基的粘度，使添加的植物油不会影响发酵时对培养基的搅拌。
6.本发明提供的副偶然分枝杆菌在制备甾体类药物中的应用，为制备甾体类药物，提供了一种能够生产高产量的甾体类药物中间体的微生物菌株。
具体实施方式
以下通过具体实施例来说明本发明的实施方式，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法均采用本技术领域常规技术，实施例中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
实施例1副偶然分枝杆菌菌株BK12的诱变筛选
1.副偶然分枝杆菌菌株BK11的筛选
1.1培养基的配制
(1)富集培养基：KH2PO4 1.0g/L，NaNO4 3.0g/L，NH4Cl 4.0g/L，MgS04·7H20 6.5g/L，FeS04·7H20 0.01g/L，Tween-800.5g/L，植物甾醇10.0g/L。灭菌前调节培养基pH至7.0～7.2。
(2)平板分离培养基：每1L富集培养基中加入20g的琼脂粉，得到液态的平板分离培养基；将液态的平板分离培养基倒入培养皿中，培养基凝固后得到分离平板。
(3)基本平板培养基：酵母提取物5.0g/L，甘油10.0g/L，MgS04·7H2O 3.0g/L，K2HPO4 0.5g/L，NH4CI 1.0g/L，琼脂粉20.0g/L，调节培养基pH至7.0～7.2后高温灭菌，得到液态的基本平板培养基；将液态的基本平板培养基倒入培养皿中，培养基凝固后得到基本培养基平板。
(4)斜面试管培养基：使用步骤(3)中得到的液态的基本平板培养基，将液态的基本平板培养基倒入试管中，培养基凝固后得到斜面试管。
(5)液体种子培养基：酵母提取物5.0g/L，甘油10.0g/L，MgS04·7H2O3.0g/L，K2HPO4 0.5g/L，NH4CI1.0 g/L。灭菌前调节培养基pH至7.0～7.2。
(6)转化培养基/发酵筛选培养基：葡萄糖5.0g/L，酵母膏3.0g/L，玉米浆3g/L，磷酸二氢钾0.4g/L，硝酸钠3.0g/L，大豆油80g/L，植物甾醇15g/L，灭菌前调节培养基pH值至7.0～7.2。
1.2菌种筛选
(1)富集培养：取1g广东本科生物工程有限公司污水处理系统中的活性污泥加入含80mL富集培养基的500mL三角瓶中，温度为30℃,在180rpm转速下培养72h，在培养液明显浑浊后，取1mL作为种子再接种到新配制的富集培养基中，如此进行三次富集培养。
(2)菌株分离：取1mL上述步骤(1)中得到的富集培养物，然后用无菌水进行10倍梯度稀释，取0.2mL梯度稀释液到分离平板中进行涂布，于30℃培养96h。然后挑取约68个单菌落保存到斜面试管培养基上。
(3)液体种子扩大培养：用接种环取一环斜面保存的菌株接种于含25mL液体种子培养基的150mL摇瓶中，温度为30℃、180rpm转速下进行培养，72h备用。
(4)摇瓶发酵筛选：取8mL上述(3)中培养好的液体种子接种于含80mL转化培养基的500mL摇瓶中，温度为30℃、180rpm转速下进行培养，每24h取样一次测定底物植物甾醇的转化情况。用TLC法对这些菌株的发酵产物进行分析，发现8株菌可以转化植物甾醇，积累产物HPD、4-HP、AD和ADD。通过HPLC法进一步定量检测发酵产物的含量和组成，发现菌株BK11可以有效降解植物甾醇，主要产物为HPD和4-HP，且HPD和4-HP的含量比为7:3，经鉴定该菌株为Mycobacterium parafortuitum，选取该菌株继续后续实验。
2.副偶然分枝杆菌菌株BK11的诱变处理
取纯种副偶然分枝杆菌菌株BK11斜面，加入无菌水制成菌悬液。取100μl菌悬液均匀涂布于无菌空平皿上，以无菌风吹干。取镜检无细胞重叠者进行N+离子注入，注入能量为10keV，注入剂量为(2.5-8.5)×1014N+/cm2。
3.副偶然分枝杆菌菌株BK12菌株的筛选
离子注入完成后，以1mL无菌水洗脱，适当稀释后，涂布至含有基本培养基平板上，于30℃恒温培养4天后，挑取生长良好的单菌落加入发酵筛选培养基中进行摇瓶发酵筛选，最终选育一株可以将甾醇类物质高效转化以4-HP作为主要产物的菌株，命名为副偶然分枝杆菌菌株BK12。
实施例2
本实施例提供一种使用副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12转化生产4-HP的方法，具体包括以下步骤：
1.菌种的扩大培养
(1)配制种子培养基：酵母膏1.2kg，葡萄糖1.5kg，水97.3kg，控制pH为7.0；
(2)将保存的所述副偶然分枝杆菌菌株BK12从茄子瓶接种于8L种子培养基中，在250rpm转速下，30℃培养55h，得到适于接种的扩大培养液,扩大培养液的OD600为5。
2.微生物转化生成4-HP
配制发酵培养基：葡萄糖0.5kg，酵母膏0.3kg，蛋白胨0.2kg，玉米浆3.5kg，磷酸二氢钾0.04kg，硝酸钠0.3kg，大豆油8kg，底物植物甾醇1.5kg，水85.3kg，控制pH 7.0；发酵罐体积为100L；
按照所述发酵培养基的体积的10％(V/V)的接种量将步骤1中得到的扩大培养液接种到发酵罐内进行微生物转化发酵，转化温度为31℃，通气量0.12vvm，搅拌转速250rpm，转化96h后发酵结束。
实施例3
本实施例提供一种使用所述副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12转化生产4-HP的方法，具体包括以下步骤：
1.菌种的扩大培养
(1)配制种子培养基：蛋白胨1.5kg，甘油2.0kg，水96.5kg，控制pH为7.5；
(2)将所述副偶然分枝杆菌菌株BK12从茄子瓶接种于8L种子培养基中，在200rpm转速下，32℃培养48h，得到适于接种的扩大培养液,扩大培养液的OD600为7。
2.微生物转化生成4-HP
配制发酵培养基：葡萄糖1.2kg，酵母膏0.2kg，蛋白胨0.5kg，玉米浆2.5kg，磷酸二氢钾0.06kg，硝酸钠0.5kg，大豆油10kg，底物植物甾醇投料2.0kg，水83kg，控制pH 7.6；发酵罐体积为100L；
按照所述发酵培养基的体积的12％(V/V)的接种量将步骤1中得到的扩大培养液接种到发酵罐内进行微生物转化发酵，转化温度为30℃，通气量0.2vvm，搅拌转速300rpm，转化120h后发酵结束。
实施例4
本实施例提供一种使用所述副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12转化生产4-HP的方法，具体包括以下步骤：
1.菌种的扩大培养
(1)配制种子培养基：酵母膏1.5kg，葡萄糖2.0kg，水96.5kg，控制pH为7.2；
(2)将所述副偶然分枝杆菌菌株BK12从茄子瓶接种于8L种子培养基中，在350rpm转速下，32℃培养55h，得到适于接种的扩大培养液,扩大培养液的OD600为8.8。
2.微生物转化生成4-HP
配制发酵培养基：葡萄糖1.2kg，酵母膏0.3kg，玉米浆4.0kg，磷酸二氢钾0.08kg，硝酸钠0.5kg，大豆油10kg，底物植物甾醇投料3.0kg，水83kg，控制pH 7.2；发酵罐体积为100L；
按照所述发酵培养基的体积的15％(V/V)的接种量将步骤1中得到的扩大培养液接种到发酵罐内进行微生物转化发酵，转化温度为32℃，通气量0.25vvm，搅拌转速350rpm，转化144h后发酵结束。
实施例5
本实施例提供一种使用所述副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12转化生产4-HP的方法，具体包括以下步骤：
1.菌种的扩大培养
(1)配制种子培养基：蛋白胨8kg，葡萄糖0.5kg，水91.5kg，控制pH为6.5；
(2)将所述副偶然分枝杆菌菌株BK12从茄子瓶接种于8L种子培养基中，在100rpm转速下，28℃培养60h，得到适于接种的扩大培养液,扩大培养液的OD600为9。
2.微生物转化生成4-HP
配制发酵培养基：甘油3kg，酵母膏0.5kg，蛋白胨0.3kg，磷酸二氢钾0.01kg，大豆油18kg，底物植物甾醇投料1.0kg，水77.2kg，控制pH7.5；发酵罐体积为100L；
按照所述发酵培养基的体积的5％(V/V)的接种量将步骤1中得到的扩大培养液接种到发酵罐内进行微生物转化发酵，转化温度为28℃，通气量0.05vvm，搅拌转速100rpm，转化72h后发酵结束。
实施例6
本实施例提供一种使用所述副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12转化生产4-HP的方法，具体包括以下步骤：
1.菌种的扩大培养
(1)配制种子培养基：甘油5.0kg，酵母膏0.2kg，水94.8kg，控制pH为6.8；
(2)将所述副偶然分枝杆菌菌株BK12从茄子瓶接种于8L种子培养基中，在500rpm转速下，33℃培养58h，得到适于接种的扩大培养液,扩大培养液的OD600为10。
2.微生物转化生成4-HP
配制发酵培养基：甘油0.1kg，酵母膏6kg，磷酸二氢钾0.02kg，硝酸钠0.6kg，花生油2kg，底物动物甾醇投料5.0kg，水86.8kg，控制pH6.8；发酵罐体积为100L；
按照所述发酵培养基的体积的8％(V/V)的接种量将步骤1中得到的扩大培养液接种到发酵罐内进行微生物转化发酵，转化温度为35℃，通气量1.0vvm，搅拌转速200rpm，转化200h后发酵结束。
实施例7
本实施例提供一种使用所述副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12转化生产4-HP的方法，具体包括以下步骤：
1.菌种的扩大培养
(1)配制种子培养基：酵母膏1.2kg，葡萄糖1.5kg，水97.3kg，控制pH为7.0；
(2)将所述副偶然分枝杆菌菌株BK12从茄子瓶接种于8L种子培养基中，在250rpm转速下，30℃培养55h，得到适于接种的扩大培养液,扩大培养液的OD600为12。
2.微生物转化生成4-HP
配制发酵培养基：葡萄糖2.0kg，蛋白胨0.1kg，磷酸二氢钾0.08kg，硝酸钠0.02kg，大豆油2kg，玉米油18kg，底物植物甾醇投料4.0kg，水73.8kg，控制pH 5.5；发酵罐体积为100L；
按照所述发酵培养基的体积的10％(V/V)的接种量将步骤1中得到的扩大培养液接种到发酵罐内进行微生物转化发酵，转化温度为29℃，通气量0.1vvm，搅拌转速400rpm，转化80h后发酵结束。
实施例8
本实施例提供一种使用所述副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12转化生产4-HP的方法，具体包括以下步骤：
1.菌种的扩大培养
(1)配制种子培养基：蛋白胨1.5kg，甘油2.0kg，水96.5kg，控制pH为7.5；
(2)将所述副偶然分枝杆菌菌株BK12从茄子瓶接种于8L种子培养基中，在200rpm转速下，32℃培养48h，得到适于接种的扩大培养液,扩大培养液的OD600为8.5。
2.微生物转化生成4-HP
配制发酵培养基：甘油0.8kg，葡萄糖1.2kg，酵母膏0.2kg，蛋白胨0.2kg，玉米浆4.0kg，硝酸钠1.0kg，大豆油20kg，底物动物甾醇投料3.0kg，水72.6kg,控制pH 8.5；发酵罐体积为100L；
按照所述发酵培养基的体积的12％(V/V)的接种量将步骤1中得到的扩大培养液接种到发酵罐内进行微生物转化发酵，转化温度为33℃，通气量0.5vvm，搅拌转速500rpm，转化160h后发酵结束。
实施例9
本实施例提供一种使用所述副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12转化生产4-HP的方法，具体包括以下步骤：
1.菌种的扩大培养
(1)配制种子培养基：酵母膏1.2kg，葡萄糖1.5kg，水97.3kg，控制pH为7.0；
(2)将所述副偶然分枝杆菌菌株BK12从茄子瓶接种于8L种子培养基中，在250rpm转速下，30℃培养55h，得到适于接种的扩大培养液,扩大培养液的OD600为12。
2.微生物转化生成4-HP
配制发酵培养基：葡萄糖0.1kg，蛋白胨0.1kg，磷酸二氢钾0.01kg，大豆油2kg，底物植物甾醇投料0.5kg，水97.29kg，控制pH 5.5；发酵罐体积为100L；
按照所述发酵培养基的体积的10％(V/V)的接种量将步骤1中得到的扩大培养液接种到发酵罐内进行微生物转化发酵，转化温度为29℃，通气量0.1vvm，搅拌转速400rpm，转化80h后发酵结束。
实施例10
本实施例提供一种使用所述副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12转化生产4-HP的方法，具体包括以下步骤：
1.菌种的扩大培养
(1)配制种子培养基：蛋白胨8kg，葡萄糖0.5kg，水91.5kg，控制pH为6.5；
(2)将所述副偶然分枝杆菌菌株BK12从茄子瓶接种于8L种子培养基中，在100rpm转速下，28℃培养60h，得到适于接种的扩大培养液,扩大培养液的OD600为9。
2.微生物转化生成4-HP
配制发酵培养基：甘油3kg，酵母膏4.5kg，蛋白胨1.5kg，磷酸二氢钾0.4kg，硝酸钠0.6kg，大豆油20kg，底物植物甾醇投料5.0kg，水65kg，控制pH7.5；发酵罐体积为100L；
按照所述发酵培养基的体积的5％(V/V)的接种量将步骤1中得到的扩大培养液接种到发酵罐内进行微生物转化发酵，转化温度为28℃，通气量0.05vvm，搅拌转速100rpm，转化72h后发酵结束。
实验例1
检测在实施例2-实施例10所示发酵培养基和发酵条件下生产4-HP的底物转化率和4-HP产量，具体步骤如下：
1.样品制备
样品制备：取发酵结束的转化液1mL，加入等体积乙酸乙酯，震荡均匀后放置分层。取上层有机相约800μL，用有机膜(0.4μm)过滤后，备用，用于GC法分析检测残余甾醇和HPLC法分析检测4-HP。
2.GC法分析检测残余甾醇
将上述制备的样品与同体积的浓度为1g/L的胆固醇内标参照物混合后用有机膜(0.4μm)过滤后供GC检测，具体检测步骤如下：采用岛津2010Plus气相色谱仪进行GC分析；检测器为FID检测器，色谱柱为二甲基聚硅氧烷柱(30m x 0.25mm x 0.25μm)；入口温度为300℃，柱温箱为320℃，FID检测器温度为300℃；载气为氮气，压力为81.7Kp，柱流量为1ml/min，氢气流量为40ml/min，空气流量为400ml/min，氮气流量为9.3ml/min；进样体积为1μL。
3.HPLC法分析检测4-HP
采用C18反相层析柱(Agilent Extend-C18，4.6mm×250mm，5μm)；流动相为70％甲醇：30％水(v/v)，流速为1.0mL/min；柱温为32℃；紫外检测波长为254nm；进样体积为20μL。
每个样品经三次平行处理，实施例2-实施例8所述的制备方法获得的产物检测结果如表1所示。
表1底物转化率和4-HP产量
底物转化率(％) 4-HP产量(g/L)
实施例2(底物投料浓度1.5份) 95 9.2
实施例3(底物投料浓度2.0份) 92 12.8
实施例4(底物投料浓度3.0份) 90 18.8
实施例5(底物投料浓度1.0份) 100 6.6
实施例6(底物投料浓度5.0份) 80 23.2
实施例7(底物投料浓度4.0份) 85 21.4
实施例8(底物投料浓度3.0份) 92 18.5
实施例9(底物投料浓度3.0份) 100 3.15
实施例10(底物投料浓度3.0份) 75 22.05
由表1可知，以所述副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12转化制备4-HP，能够显著提高甾醇的转化效率，得到高产量的4-HP；在实施例2-实施例10中所示的发酵培养基和发酵条件下，底物转化率均在75％以上，4-HP产量最高达到23.2g/L，表明在在实施例2-实施例10中所述的不同制备方法均能利用底物进行充分转化，副偶然分枝杆菌菌株的转化稳定性高，能够生产高浓度的4-HP，并有效减小在4-HP转化过程中生成的AD、ADD等杂质，产生以4-HP为主要产物的发酵液；同时在不同生产条件下，菌株都具有较高的稳定性，能够稳定生产4-HP。其中在实施例4中所示的制备方法中，投料量为3.0份，底物转化率达90％，得到18.8g/L的4-HP产物，在保证了单次转化率的基础上，加大了单次生产的数量，有利于在工业领域的大规模生产以及应用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (16)

1.一种副偶然分枝杆菌(Mycobacterium parafortuitum)菌株BK12，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是CCTCC NO.M2017084。
2.一种含权利要求1所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12的菌剂，其特征在于，还包括所述菌株生长的培养基。
3.一种4-HP的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括使用权利要求1所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12或权利要求2所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12的菌剂。
4.根据权利要求3所述的4-HP的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12或权利要求2所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12的菌剂接种到种子培养基中扩大培养，得到扩大培养液；
(2)接种所需量的步骤(1)中得到的扩大培养液到发酵培养基中，通过微生物转化发酵生产4-HP。
5.根据权利要求4所述的4-HP的制备方法，其特征在于，在所述步骤(2)中，接种的所述扩大培养液中菌种的密度为OD600：5.0-12.0，所述扩大培养液的接种量为所述发酵培养基体积的5-15％。
6.根据权利要求4-5任一项所述的4-HP的制备方法，其特征在于，所述种子培养基包括如下重量份的组分：碳源0.5-5重量份和氮源0.2-8重量份。
7.根据权利要求4-5任一项所述的4-HP的制备方法，其特征在于，所述扩大培养的条件为：控制温度28-33℃，搅拌转速100-500rpm，pH 6.5-7.5，培养时间48-60h。
8.根据权利要求4-5任一项所述的4-HP的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下重量份的组分：甾醇0.5-5重量份、碳源0.1-3份、氮源0.1-6重量份、无机盐0.01-1重量份和水65-97.29重量份。
9.根据权利要求8所述的4-HP的制备方法，其特征在于，所述甾醇为植物甾醇和/或动物甾醇。
10.根据权利要求8所述的4-HP的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基还包括植物油2-20重量份。
11.根据权利要求10所述的4-HP的制备方法，其特征在于，所述植物油包括大豆油、玉米油、花生油、菜籽油和葵花油中的一种或几种的混合物。
12.根据权利要求4-5任一项所述的4-HP的制备方法，其特征在于，所述碳源包括葡萄糖、糖蜜、甘油、麦芽糖和可溶性淀粉中的一种或几种的混合物；所述氮源包括酵母膏、蛋白胨、玉米浆、大豆粉和硫酸铵中的一种或几种的混合物；所述无机盐包括镁盐、磷酸盐、钠盐和硝酸盐中的一种或几种的混合物。
13.根据权利要求4-5任一项所述的4-HP的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基包括葡萄糖0.5-2.0重量份、酵母膏0.2-0.5重量份、蛋白胨0.2-0.5重量份、玉米浆2.5-4.0重量份、磷酸二氢钾0.02-0.08重量份、硝酸钠0.02-0.6重量份、大豆油8-18重量份和植物甾醇1-3重量份。
14.根据权利要求4-5任一项所述的4-HP的制备方法，其特征在于，所述微生物转化的发酵条件为：控制温度28-35℃，pH 5.5-8.5，通气量0.05-1vvm，搅拌转速100-500rpm，发酵时间72-200h。
15.根据权利要求14所述的4-HP的制备方法，其特征在于，所述微生物转化的发酵条件为：控制温度30-32℃，pH 6.8-7.5，通气量0.1-0.5vvm，搅拌转速200-400rpm，发酵时间72-200h。
16.一种如权利要求1所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12或权利要求2所述的含所述的副偶然分枝杆菌菌株BK12的菌剂在制备黄体酮、17α-OH黄体酮、氢化可的松、倍他米松、地塞米松、可的松、氟美松和依普利酮中的应用。
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