CN102586139A - 一种高产ad/add的菌株及高效生产ad/add的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用高产菌株发酵生产AD和/或ADD的方法。本发明公开了一种能够高效转化甾醇类物质生产AD和/或ADD的分歧杆菌菌株，其分类命名为Mycobacterium.sp-BK-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.5707。本发明还公开了利用所述菌株转化甾醇生产AD和/或ADD的方法。本发明所述的菌株依靠现有微生物转化甾醇类物质生产AD和/或ADD的工艺可以将发酵培养基中浓度高达3.5％的甾醇类完全转化为AD和/或ADD，且转化率接近70-80％左右，从而在保证了单次转化率的基础上，加大了单次生产的数量。

Description

一种高产AD/ADD的菌株及高效生产AD/ADD的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用高产菌株发酵生产AD和/或ADD的方法。

背景技术

雄甾-4-烯-3.17-二酮(androst-4-ene-3，17-dione，简称雄烯二酮、AD)和雄甾-1，-4-二烯-3.17-二酮(androsta-1，4-diene-3，17-dione，简称雄二烯二酮、ADD)均是重要的甾类药物中间体，雄烯二酮(AD)既可作为雄性激素、促蛋白合成激素等激素类物质的前体，也可用于合成螺甾内酯、氢化可的松、氧化泼尼松，地塞米松等药物；而雄二烯二酮(ADD)可用于雌性激素、口服避孕药等药物的合成。相对ADD而言，AD在医药行业的使用范围更广更深，超过90％甾体激素类药物都是以AD作为基础原料进行生产的。

到目前为止，AD及ADD的制备方法主要有薯蓣皂苷元途径的化学合成法和甾醇物质侧链降解的微生物转化法。由于穿地龙等薯蓣类植物日益枯竭，而且化学合成的污染大，成本高，所以其逐步被微生物转化法所取代。现已发现，微生物中如节杆菌属、短杆菌属、诺卡氏菌属、链霉菌属和分枝杆菌属能将甾醇类物质降解为二氧化碳和水，同时代谢过程中伴有AD/ADD等中间产物的形成。据报道，分枝杆菌(Mycobacterium)MB3683和MB3605是比较常用AD/ADD的生产菌株，常规的生产方法是先在适当的培养基中培养菌体，然后将菌体移至含有甾醇类物质的发酵罐中，经过大约120-168小时的生物转化生产AD/ADD，然后用适当的有机溶剂将AD/ADD进行萃取、分离、结晶并精制，即可得到白色的结晶粉末状的AD/ADD。

但利用甾醇物质的微生物转化法中，受限于甾醇类物质在水溶性的培养基中溶解度很小，导致微生物无法充分利用并将其转化，因而导致发酵周期较长，且AD/ADD的有效转化率很低。一般为了解决这一问题，通常会往培养基加入司盘(Span)、吐温(Tween)等乳化剂以改善底物的分散度，进而增加微生物与底物的接触机率以期望提高整个体系的生物转化率，但是实际效果并不明显。现有技术中，也报道了一些通过添加乙醇、甘油等有机溶剂的单相发酵系统，能够提高甾醇类物质的溶解性，提高微生物的生物转化率；但是添加过多的有机溶剂对细胞有毒害作用，最终也会影响产品的得率。

针对上述问题，现有技术中开发出利用如聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG)等聚合物与发酵液构成的双水相发酵系统提升AD/ADD的产量，该双水相发酵系统能提高甾醇类物质的溶解度，而且对微生物的生长繁殖影响不大，进而提高AD/ADD的转化率，但是受限于聚合物的价格因素而阻碍其在工业领域的大规模生产及应用。此外，还有一种利用与水不相容的有机溶剂如辛醇等，与发酵液形成不相溶的双液相系统，该系统的优点是甾醇类物质的溶解度和生物转化率都有比较明显的提高，而且AD/ADD几乎全部集中在有机相，分离比较容易；但缺点是溶剂对微生物的毒害作用、以及由于溶剂挥发所产生的安全问题，均不利于工业推广。

中国专利CN101525651A公开了一种双液相系统中生物降解植物甾醇制备“雄烯二酮”的方法，该专利通过添加葵花油作为有机相，与水相发酵液形成油/水双液相培养系统，并利用分枝杆菌Mycobacterium sp-UV-8在此系统中繁殖并有效转化植物甾醇生产AD，整体转化率在80％左右，但是该系统中葵花油用量至少达到20％V/V，而投料量却只有0.6％，虽然其转化率可以达到80％，但单次生产量仍然很低，远达不到生产要求。

中国专利CN1639154A公开了一种将植物甾醇发酵制备雄二烯二酮的方法，该方法通过镰孢菌属菌株(Fusarium)利用AD合成ADD，该法首先利用分枝杆菌Mycobacterium MB3683将植物甾醇的侧链降解为AD或者直接提供AD作为底物，然后利用事先培养好的镰孢菌属(Fusarium)培养物移入上述含有AD的发酵液中进行生物转化，并最终获得所需的ADD，随后将其分离并纯化即可。该法虽然可以获得高纯度ADD，但是整个体系的甾醇投料量只有1.0％，且两阶段培养周期耗时高达95～136h之间，而AD转化为ADD的转化率只有25-40％，这也就意味着若由甾醇直接转化为ADD的转化率只有20-30％，不仅转化率很低；而且所获得ADD晶体中含有约5％左右的AD，需要通过其他方法才能分离去除。

中国专利CN101760494A公开了一种采用静息细胞的雄烯二酮生物发酵方法，该专利所述的发酵方法将具有降解植物甾醇得到AD/ADD的微生物菌种的静息细胞，加入到植物甾醇转化液中进行第一次静息细胞转化反应，使转化液中的植物甾醇转化得到AD/ADD结束后，去除菌体细胞，并将转化液经溶剂提取得到AD/ADD。该方法中的底物投料量也能达到1-2％，整体转化率可以达到80％左右。该技术实质为二步培养法，首先获得菌体然后进行生物转化。该法着眼于菌丝的重复利用，缩短发酵周期，但需要不断的移出AD/ADD和更换培养液，并洗涤菌丝，操作步骤复杂，菌种容易退化并有染菌甚至是感染噬菌体的风险。

上述几种发酵生产AD和/或ADD的方法的底物投料量较低的主要原因在于现有技术中的生产菌株的底物消化能力较差，导致虽然整个反应的转化率较好，但依然限制了该工艺的大规模应用。而且，上述几个专利所述的方法均采用特殊的突变株，而一般野生的分枝杆菌(Mycobacterium)生物转化甾醇类物质时，产物多为AD/ADD的共混物，两者比例为4-9∶1，两者的比例无法随意调整，而且并未有经济可行的分离方法将两者分离开来。

发明内容

为此，本发明所要解决的技术问题在于现有技术中AD和/或ADD单次底物投料量较低的问题，进而提供一株可转化高投料量的AD和/或ADD的分歧杆菌株。

本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种利用所筛选的分歧杆菌株转化高投料量底物生产AD和/或ADD的方法。

本发明所要解决的第三个技术问题在于提高一种产物中AD和ADD的比例可控制的生产方法。

为解决上述技术问题，本发明公开了一种分歧杆菌菌株，其分类命名为Mycobacterium.sp-BK-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址：中国.北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，其保藏编号是CGMCC No.5707，保藏日期是2012年1月10日。

本发明还公开了一种微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其包括使用本发明的菌株。示例性地，在本发明的方法中，将上述分歧杆菌菌株，在含有植物油和甾醇类物质的适于分歧杆菌菌株生长的发酵培养中培养，将甾醇类物质转化为AD和/或ADD的步骤。优选的，在本发明的方法中将甾醇类物质完全转化为AD和/或ADD。

所述方法包括在含有甾醇类物质的适于分歧杆菌菌株生长的发酵培养中培养，以将甾醇类物质转化为AD和/或ADD的步骤。

所述的发酵培养基还含有植物油。

所述发酵培养基包括组分可为：植物油15-30％V/V(即所述植物油的体积占所述发酵培养基总装液量的体积比)、甾醇类物质10-50g/L、碳源30-70g/L、氮源15-50g/L、无机盐2.5-7.5g/L、其余为水。

所述植物油可为大豆油、葵花油、菜籽油、花生油和妥尔油中的一种或几种的混合物。

所述植物油优选为大豆油。

所述甾醇类物质可为植物甾醇和/或动物甾醇。

所述碳源可包括淀粉、葡萄糖，乳清、糖蜜、大豆油、葵花油、菜籽油、花生油和妥尔油中的一种或几种的混合物；所述氮源可包括蛋白胨、酵母提取物、鱼粉、棉籽粉、豆粕粉、玉米浆、玉米浆干粉、硝酸盐和无机铵盐中的一种或几种的混合物；所述无机盐可包括磷酸盐、硝酸盐、无机铵盐、镁离子、亚铁离子、钙离子、钠离子、锰离子、钴离子中的一种或几种的混合物。

所述碳源优选为葡萄糖或糖蜜；所述氮源优选为玉米浆、玉米浆干粉或豆粕粉；所述无机盐优选为磷酸盐或硝酸盐。

所述培养条件可为：控制温度28-35℃，pH5.0-9.0，通气量0.1-1.0vvm，搅拌转速100-500rpm，发酵时间72-240小时。

本发明所述通过控制发酵过程的pH变化可以控制发酵液中AD和/或ADD的比例的控制过程示例性的为：控制培养条件的pH为5.5-6.0，所得发酵液中AD与ADD的比例为2.3～3∶1；控制培养条件的pH为6.1-7.5，所得发酵液中AD与ADD的比例为3.1～9∶1；控制培养条件的pH为7.6-9.0，所得发酵液中AD与ADD的比例为9.1～19∶1。所述pH的控制过程可以通过自动或人工调控添加酸等常规方式使发酵液PH维持在特定值从而控制AD和/或ADD的比例。

本步骤的过程监控可采用薄层色谱法快速定性监控，具体过程可如下：取发酵液的油相，加入三倍的乙酸乙酯萃取，毛细管点板，层析液为乙酸乙酯∶正己烷＝3∶7，层析完毕后在波长为254的三用紫外分析仪观察，油相显示“棕色”，甾醇类物质显示“灰色”，AD显示“绿色”，ADD现实“紫色”。本步骤也可采用气相色谱法定量测定底物的消耗量和AD和/或ADD的转化情况，具体过程如下：取发酵液的油相，加入三倍的乙酸乙酯萃取，取1μl的乙酸乙酯相进行气相色谱分析，分析条件为：安捷伦填充柱DB-5(0.25μl×30m)，柱温280℃恒温，载气流速40ml/min，柱压16psi，内标物为胆固醇。

本发明还提供了一种分歧杆菌菌株在生产AD和/或ADD中的应用。

本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：

1、发明人从自然观环境中筛选并分离得到一株可转化高投料量甾醇类物质而转化生产AD和/或ADD的菌株，命名为Mycobacterium.sp-BK-1并保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该菌株依靠现有微生物转化甾醇类物质生产AD和/或ADD的工艺可以将发酵培养基中浓度高达3.5％的甾醇类完全转化为AD和/或ADD，且转化率接近70-80左右，在保证了单次转化率的基础上，加大了单次生产的数量；

2、本发明所述的生产AD和/或ADD的方法，通过控制发酵过程中pH值的变化可以达到调节AD和/或ADD比例的效果，可以按照目的产物的需求合理设计生产路线。

具体实施方式

实施例1菌株的活化及增殖培养

配制活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，磷酸二氢钾1，硝酸铵1，硫酸镁0.5，琼脂20，控制PH 7.0。并将培养基在121℃、0.1Mpa、蒸汽灭菌20min。灭菌后将培养基分装在250ml的茄型瓶，每瓶装料量为50ml。

将保存的菌株Mycobacterium.sp-BK-1(保藏编号CGMCC No.5707)从-80℃冰箱取出，无菌接种在上述斜面培养基上，30℃培养5天。

配制摇瓶种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨5，酵母粉2.5，硫酸镁0.5，控制PH 7.0，121℃、0.1Mpa、蒸汽灭菌20min。将种子培养基分装在500ml的三角瓶，每瓶装液量为100ml。

用25ml无菌水从上述斜面培养基内洗下培养物，每100ml种子培养基中接入2ml洗涤的菌液，接种12瓶摇瓶种子培养基，30℃，摇床转速220rpm，摇瓶培养72小时。

实施例2发酵生产AD和/或ADD

配制发酵罐培养基(g/L)：磷酸二氢钾1，磷酸氢二钠0.5，精制糖蜜60，硫酸镁0.3，硝酸铵3，甾醇25，豆油147(豆油的平均密度为0.92g/ml，约为0.159L，约占发酵液体积比的16％)，控制pH 6.8，配制发酵罐体积7.5L，装液量为4L，121℃、0.1Mpa、蒸汽灭菌20min，备用。

按照10％的接种量将实施例1中种子摇瓶中得到的培养物移入发酵罐中进行生物转化，31℃，搅拌转速350rpm，通气流量1.0L/L/min，发酵时间培养168小时。

该发酵罐接种时控制PH为6.5，随后PH自行变化，发酵结束时，检测发酵液的PH为8.7；检测得到甾醇残量5.7％，计算转化率为73％；发酵液中AD和/或ADD总量为11.98g/L，且其中AD∶ADD＝91∶9。

实施例3

本实施例所选用的发酵培养基及操作步骤同实施例2，其区别在于操作接种时PH控制在7.0，调控24小时pH7.5，48小时控制在8.0，72小时后控制在8.5以上。发酵结束时，检测发酵液的PH为9.1；检测得到甾醇残量为7.2％，转化率68.0％；AD和/或ADD总量为10.41g/L，其中AD∶ADD＝96∶4。

实施例4

本实施例所选用的发酵培养基及操作步骤同实施例2和3，其区别在于操作接种时PH控制在6.0直至发酵结束，发酵结束后，检测发酵液中甾醇残量为15.6％，计算底物转化率为63.1％；AD和/或ADD总量为8.73g/L，其中AD∶ADD＝73∶27。

实施例5培养基组分和PH值对AD和/或ADD

配制发酵罐培养基(g/L)：磷酸二氢钾0.8，磷酸氢二钠0.4，精制糖蜜50，硫酸镁0.5，硝酸铵5，甾醇35，豆油184(约占发酵液体积的20％)，控制pH 6.8，配制发酵罐体积7.5L，装液量为4L，121℃、0.25Mpa、蒸汽灭菌30min，备用。

按照10％的接种量将实施例1中种子摇瓶中得到的培养物移入发酵罐中进行生物转化，33℃，搅拌转速200rpm，通气流量0.5L/L/min，发酵时间培养204小时。该发酵罐接种时控制PH为6.5，随后PH自行变化，发酵结束时，检测发酵液的PH为8.8；检测得到甾醇残量3.7％，计算转化率为78％；发酵液中AD和/或ADD总量为17.35g/L，且其中AD∶ADD＝89∶11。

实施例6

配制发酵罐培养基(g/L)：磷酸二氢钾1.2，磷酸氢二钠0.8，玉米浆70，硫酸镁0.3，硫酸铵4，甾醇25，豆油184，控制pH 6.8，配制发酵罐体积7.5L，装液量为4L，121℃、0.15Mpa、蒸汽灭菌30min，备用。

按照10％的接种量将实施例1中种子摇瓶中得到的培养物移入发酵罐中进行生物转化，31℃，搅拌转速300rpm，通气流量0.75L/L/min，发酵时间培养168小时。接种时PH控制在7.0，调控24小时pH7.5，48小时控制在8.0，72小时后控制在8.5以上。检测得到甾醇残量3.2％，计算转化率为72％；发酵液中AD和/或ADD总量为11.50g/L，且其中AD∶ADD＝93∶7。

实施例7

配制发酵罐培养基(g/L)：磷酸二氢钾1.4，磷酸氢二钠0.6，玉米浆干粉50，硫酸镁1.0，氯化铵3.5，甾醇30，豆油184，控制pH 6.8，配制发酵罐体积7.5L，装液量为4L，121℃、0.2Mpa、蒸汽灭菌30min，备用。

按照15％的接种量将实施例1中种子摇瓶中得到的培养物移入发酵罐中进行生物转化，32℃，搅拌转速450rpm，通气流量1.0L/L/min，发酵时间培养192小时。接种时PH控制在6.0直至发酵结束。检测得到甾醇残量4.8％，计算转化率为67％；发酵液中AD和/或ADD总量为12.63g/L，且其中AD∶ADD＝69∶31。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (16)

1.一种分歧杆菌菌株，其分类命名为Mycobacterium.sp-BK-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号是CGMCC No.5707。

2.一种微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其包括使用权利要求1所述的分歧杆菌菌株。

3.根据权利要求2所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于，包括在含有甾醇类物质的适于分歧杆菌菌株生长的发酵培养中培养，以将甾醇类物质转化为AD和/或ADD的步骤。

4.根据权利要求3所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于，所述的发酵培养基还含有植物油。

5.根据权利要求4所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于，包括在如下发酵培养基中培养的步骤：植物油15-30％V/V、甾醇类物质15-35g/L、碳源30-70g/L、氮源15-50g/L、无机盐2.5-7.5g/L、其余为水。

6.根据权利要求5所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于：所述植物油为大豆油、葵花油、菜籽油、花生油和妥尔油中的一种或几种的混合物。

7.根据权利要求6所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于：所述植物油为大豆油。

8.根据权利要求6或7所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于：所述甾醇类物质为植物甾醇和/或动物甾醇。

9.根据权利要求5-8任一所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于：所述碳源包括淀粉、葡萄糖，乳清、糖蜜、大豆油、葵花油、菜籽油、花生油和妥尔油中的一种或几种的混合物；所述氮源包括蛋白胨、酵母提取物、鱼粉、棉籽粉、豆粕粉、玉米浆、玉米浆干粉、硝酸盐和无机铵盐中的一种或几种的混合物；所述无机盐包括磷酸盐、硝酸盐、无机铵盐、镁离子、亚铁离子、钙离子、钠离子、锰离子、钴离子中的一种或几种的混合物。

10.根据权利要求9所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于：所述碳源为葡萄糖或糖蜜；所述氮源为玉米浆、玉米浆干粉或豆粕粉；所述无机盐为磷酸盐或硝酸盐。

11.根据权利要求2-10任一所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于，所述培养条件为：控制温度28-35℃，pH5.0-9.0，通气量0.1-1.0vvm，搅拌转速100-500rpm，发酵时间72-240小时。

12.根据权利要求11所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于：控制培养条件的pH为5.5-6.0，所得发酵液中AD与ADD的比例为2.3～3∶1。

13.根据权利要求11所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于：控制培养条件的pH为6.1-7.5，所得发酵液中AD与ADD的比例为3.1～9∶1。

14.根据权利要求11所述的微生物转化法发酵AD和/或ADD的方法，其特征在于：控制培养条件的pH为7.6-9.0，所得发酵液中AD与ADD的比例为9.1～19∶1。

15.权利要求1所述的分歧杆菌菌株在生产AD和/或ADD中的应用。

16.由权利要求2-14中任一项方法所制备的AD和/或ADD。