CN110527650A - 一种假诺卡氏菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种假诺卡氏菌在微生物转化催化甾醇化合物羟基化的应用，所述的假诺卡氏菌由南京老山国家森林公园的土壤中分离纯化获得原始菌株，并经紫外线、微波、硫酸二乙酯及原生质体融合技术进行复合诱变后筛选得到本发明的假诺卡氏菌HRW001。经中国普通微生物菌种保藏管理中心鉴定，分类命名为假诺卡氏菌 Pseudonocardia sp. HRW001，保藏编号为CGMCC No. 17524。本发明通过假诺卡氏菌液体发酵后获得大量菌体，进行微生物转化催化甾醇化合物羟基化，具有较高的催化活性和专一性。本发明的假诺卡氏菌是生物转化催化甾醇化合物羟基化的重要微生物，可催化多种甾醇化合物羟基化，具有较大的应用价值。

Description

一种假诺卡氏菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物转化技术领域，具体涉及一种假诺卡氏菌Pseudonocardiasp.HRW001，以及利用其进行微生物转化催化甾醇化合物羟基化的应用。
背景技术
假诺卡氏菌科是一类进化上相近、形态各异、肽聚糖含有Meso-DAP(内消旋二氨基庚二酸)、全细胞水解液中含有半乳糖和阿拉伯糖、不含枝菌酸的放线菌。该科的许多成员都能发酵产生重要的生物活性物质，包括抗生素、酶类、维生素等。同时，该科中极少有病原菌，是一类安全的微生物。
细胞色素P450酶(P450s或者CYPs)是一类依赖于亚铁血红素，催化多种复杂氧化反应的多功能酶。它可以催化的底物多种多样，广泛存在于各种生物体内，包括细菌、真菌、哺乳动物以及人体。它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。根据氨基酸序列的同源程度，其成员又依次分为家族、亚家族和酶个体三级，其催化反应类型多达20余类，如羟化、环氧化、脱烷基化、碳-碳偶联、氧化裂解等。日本科学家Yasutake、Fujii等人研究发现假诺卡氏菌属的羟基化酶属于CYP107家族，而链霉菌属的羟基化酶属于CYP105家族。它们都属于CYP450蛋白家族成员，拥有相似的特点：都是可溶性细胞质蛋白，含有非共价键结合的血红素，在酶发挥催化功能过程中，需要电子传递链的参与，如NADPH、Fdx和Fdr等辅酶参与传递电子到CYP450酶上。
类固醇(Steroids)，是一类多元环萜类化合物，具有特殊的分子结构通式，即在环戊烷多氢菲(四个环)的母核上连接三个侧链，其生理功能丰富多样，对机体的诸多代谢活动都起着至关重要的调节作用。甾醇(Sterol)是含有羟基的类固醇，同样种类丰富、功能多样。传统的以类固醇为起始原料或中间体制备甾体类药物，一般用化学合成法，存在合成和分离纯化工艺复杂、成本高、收率低等现象。近年来，由于生物转化法的高度专一性和高催化活性，逐渐引起了广泛的关注。
微生物转化甾醇化合物的羟基化反应，是甾体药物合成中应用较广泛的一种反应。目前报道中，以假诺卡氏菌和链霉菌属催化转化骨化三醇和骨化二醇的技术居多，且都存在菌株转化效率低、转化周期长、转化底物单一的问题。如专利CN108048493A公开了一种微生物转化制造1，25-二羟基维生素D3的制造方法，采用诺卡氏菌nocardiasp.Fpsw2013097对1α-羟基维生素D3进行25位羟基转化，最高收率54％；专利CN103898004A公开了一种假诺卡氏菌及其发酵生产骨化二醇的方法，介绍了一种工业化发酵转化骨化二醇的方法。因此，亟待筛选到一株高转化活性菌株，同时优化转化体系，并寻找多种可微生物转化的甾醇底物，进一步挖掘微生物转化的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.HRW001，以及利用其进行微生物转化催化甾醇化合物羟基化的应用。
本发明的第一目的是提供一种自主筛选的具有高转化活性的假诺卡氏菌HRW001；
本发明的第二目的是提供利用该假诺卡氏菌微生物转化甾醇类底物羟基化的方法；
本发明的第三目的是提供可利用该假诺卡氏菌微生物转化羟基化的甾醇底物种类。
实现上述发明目的的技术方案是：
本发明提供一种假诺卡氏菌HRW001，分类命名为Pseudonocardia sp.HRW001，该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17524。
所述的假诺卡氏菌由南京老山国家森林公园腐败的枯木落叶中分离后，经紫外线、微波、硫酸二乙酯及原生质体进行复合诱变后筛选得到本发明的菌株HRW001。
菌株HRW001的显微特征为：
基内菌丝和气生菌丝丰茂，形成Z字形断裂，均产生孢子链。气生菌丝产生的孢子杆状，基内菌丝产生的孢子椭圆、大小不一。
菌株HRW001在不同培养基中的培养形态如下表1：
表1
菌株HRW001的生理生化特性如下表2：
表2
经16s rRNA基因序列测序比对，本发明菌株HRW001为新菌株，分类命名为假诺卡氏菌(Pseudonocardia sp.HRW001)，该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17524。
本发明还提供一种利用上述假诺卡氏菌HRW001微生物转化甾醇类底物羟基化的方法，具体是将假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养、离心分离后得到假诺卡氏菌HRW001菌体，并将所述菌体应用于生物转化甾醇化合物羟基化。
进一步地，本发明提供一种制备假诺卡氏菌HRW001菌体的方法，包括如下步骤：
(1)将假诺卡氏菌HRW001甘油管菌株接入固体平板培养基中进行活化，培养温度为25-37℃，静置培养2-5d；
(2)活化后的固体平板菌株接入一级种子培养基进行一级种子扩大培养，培养温度为25-37℃，转速100-200rpm，培养周期2-4d；
(3)按1-5％的接种量将一级种子液接入二级种子培养基进行二级种子扩大培养，培养温度为25-37℃，转速100-400rpm，通气量0.5-2vvm，罐压0.02-0.04MPa，培养周期2-3d；
(4)按5-20％的接种量将二级种子液接入发酵培养基进行发酵培养，培养温度为25-37℃，初始pH为6.5-7.0，发酵20h后流加20％氨水控制pH在7.0-7.5左右，转速100-300rpm，通气量0.5-2vvm，罐压0.02-0.04MPa，培养周期2-5d，得到发酵液；
(5)发酵液低温离心过滤后，收集菌体备用。
其中，在步骤(1)、(2)、(3)、(4)中，培养基中包含碳源，该碳源包括葡萄糖、玉米浆粉、糖蜜、甘油和葡萄糖浆中的至少一种。
在另一实施方案中，培养基中还包含氮源，该氮源包括硫酸铵、大豆粉、酵母提取物、蛋白胨、硝酸钠、谷氨酸钠、氨水中的至少一种。
在另一实施方案中，培养基中还包括微量元素，该微量元素包括甘氨酸、谷氨酸、色氨酸、赖氨酸、L-天冬酰胺、维生素B1、维生素B6、维生素B12中的至少一种。
在另一实施方案中，培养基中还包括无机盐，该无机盐包括硫酸镁、氯化钾、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的至少一种。
优选的，上述培养基组分比例分别为：
固体平板培养基(w/v)：葡萄糖0.1-0.5％、酵母粉0.05-0.1％、L-天冬酰胺0.01-0.05％、磷酸氢二钾0.01-0.05％、琼脂粉1-2％。
一级种子培养基(w/v)：葡萄糖0.5-1％、酵母粉0.1-0.3％、L-天冬酰胺0.01-0.05％、磷酸氢二钾0.01-0.05％。
二级种子培养基(w/v)：葡萄糖1-2％、酵母粉0.1-0.3％、L-天冬酰胺0.01-0.05％、磷酸氢二钾0.01-0.05％。
发酵培养基(w/v)：葡萄糖1-4％、酵母粉0.05-0.1％、蛋白胨1-4％、L-天冬酰胺0.01-0.05％、磷酸氢二钾0.01-0.05％、氯化钠0.01-0.05％、消泡剂0.01-0.05％。
其中，步骤(5)中，发酵液在1-4℃、4000-10000rpm的条件下离心10-50min，收集菌体，并以生物转化培养基洗涤2次备用。
本发明提供一种将所述假诺卡氏菌HRW001菌体应用于生物转化甾醇化合物羟基化的方法，将假诺卡氏菌HRW001菌体重悬于新鲜的生物转化培养基中，加入底物甾醇化合物，对其进行微生物转化。
在另一实施方案中，生物转化培养基，具体成分比例为：甲基倍他环糊精0.1-1％(w/v)、三羟甲基氨基甲烷5-30mM、丁二酸钠5-30mM、氯化镁1-5mM、氯化亚铁0.1-1mM、大豆油0.01-0.1％(w/v)、NADPH 50-200mM。
在另一实施方案中，将菌体按4-10％(w/v)比例加入生物转化培养基中，重新悬浮。转化培养条件为转化温度30-40℃、搅拌转速300-500rpm、通气量0.1-0.5vvm、甾醇化合物添加量为0.1-2.0g/L、转化时间24-48h。
按上述转化工艺，经过大量的甾醇化合物生物转化反应试验，筛选得到可利用假诺卡氏菌HRW001进行微生物转化羟基化的甾醇化合物包括但不限于：
有益效果：与现有技术相比，本发明首先筛选得到一株高转化活性的假诺卡氏菌HRW001，具有较高的催化甾醇化合物羟基化的活性。其次通过三级发酵培养获得大量菌体细胞，并在生物转化培养基中完成催化，避免了现有工艺在发酵液中转化的很多弊端，极大的提高了转化效率，降低了分离纯化的难度和成本。最后本发明同时还对大量甾醇化合物进行了生物转化羟基化试验，发现了部分可以被假诺卡氏菌HRW001催化的甾醇化合物，充分挖掘了假诺卡氏菌HRW001的应用价值。
附图说明
图1为Pseudonocardia sp.HRW001微生物转化阿法骨化醇(1α-(OH)VD3)为骨化三醇(1α,25-(OH)2VD3)反应前后的HPLC图谱对比。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围，如无特别说明，所用原料均可通过市售或自制获得。
以下的实施例1-5及对比例1-2涉及使用200L发酵罐发酵、转化阿法骨化醇为骨化三醇。
实施例1：
将假诺卡氏菌HRW001甘油管菌株接入固体平板培养基中进行活化，培养温度为25℃，静置培养2d。活化后的固体平板菌株接入1L摇瓶中进行一级种子扩大培养，装液量为300mL，培养温度为25℃，转速100rpm，培养周期2d。按1％的接种量将一级种子液接入50L二级种子罐中进行二级种子扩大培养，装液量为30L，培养温度为25℃，转速100rpm，通气量0.5vvm，罐压0.02MPa，培养周期2d；按5％的接种量将二级种子液接入200L发酵罐中进行发酵培养，装液量为150L，培养温度为25℃，初始pH为6.5，发酵20h后流加20％氨水控制pH在7.0左右，转速100rpm，通气量0.5vvm，罐压0.02MPa，培养周期2d，得到发酵液。
其中发酵培养基组成比例分别为：固体平板培养基(w/v)：葡萄糖0.1％、酵母粉0.05％、L-天冬酰胺0.01％、磷酸氢二钾0.01％、琼脂粉1％。一级种子培养基(w/v)：葡萄糖0.5％、酵母粉0.1％、L-天冬酰胺0.01％、磷酸氢二钾0.01％。二级种子培养基(w/v)：葡萄糖1％、酵母粉0.1％、L-天冬酰胺0.01％、磷酸氢二钾0.01％。发酵培养基(w/v)：葡萄糖1％、酵母粉0.05％、蛋白胨1％、L-天冬酰胺0.01％、磷酸氢二钾0.01％、氯化钠0.01％、消泡剂0.01％。
发酵液在1℃、4000rpm的条件下离心10min，收集菌体，并以生物转化培养基洗涤2次备用。
其中生物转化培养基的具体成分比例为：甲基倍他环糊精0.1％(w/v)、三羟甲基氨基甲烷5mM、丁二酸钠5mM、氯化镁1mM、氯化亚铁0.1mM、大豆油0.01％(w/v)、NADPH 50mM。
将菌体按4％(w/v)比例加入生物转化培养基中，重新悬浮，加入底物阿法骨化醇化合物，对其进行微生物转化。转化培养条件为转化温度30℃、搅拌转速300rpm、通气量0.1vvm，阿法骨化醇添加量为0.1g/L，转化时间24h。
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物骨化三醇浓度，并计算生物转化率。
实施例2：
将假诺卡氏菌HRW001甘油管菌株接入固体平板培养基中进行活化，培养温度为28℃，静置培养4d。活化后的固体平板菌株接入1L摇瓶中进行一级种子扩大培养，装液量为300mL，培养温度为28℃，转速150rpm，培养周期3d。按2％的接种量将一级种子液接入50L二级种子罐中进行二级种子扩大培养，装液量为30L，培养温度为28℃，转速300rpm，通气量1vvm，罐压0.03MPa，培养周期3d；按10％的接种量将二级种子液接入200L发酵罐中进行发酵培养，装液量为150L，培养温度为28℃，初始pH为6.5，发酵20h后流加20％氨水控制pH在7.0左右，转速200rpm，通气量1vvm，罐压0.03MPa，培养周期3d，得到发酵液。
其中发酵培养基组成比例分别为：固体平板培养基(w/v)：葡萄糖0.2％、酵母粉0.06％、L-天冬酰胺0.02％、磷酸氢二钾0.02％、琼脂粉1.5％。一级种子培养基(w/v)：葡萄糖0.6％、酵母粉0.1％、L-天冬酰胺0.02％、磷酸氢二钾0.02％。二级种子培养基(w/v)：葡萄糖1.2％、酵母粉0.1％、L-天冬酰胺0.02％、磷酸氢二钾0.02％。发酵培养基(w/v)：葡萄糖2％、酵母粉0.02％、蛋白胨2％、L-天冬酰胺0.02％、磷酸氢二钾0.02％、氯化钠0.02％、消泡剂0.02％。
发酵液在2℃、6000rpm的条件下离心30min，收集菌体，并以生物转化培养基洗涤2次备用。
其中生物转化培养基的具体成分比例为：甲基倍他环糊精0.2％(w/v)、三羟甲基氨基甲烷10mM、丁二酸钠15mM、氯化镁2mM、氯化亚铁1mM、大豆油0.02％(w/v)、NADPH200mM。
将菌体按6％(w/v)比例加入生物转化培养基中，重新悬浮，加入底物阿法骨化醇化合物，对其进行微生物转化。转化培养条件为转化温度32℃、搅拌转速350rpm、通气量0.2vvm，阿法骨化醇添加量为0.4g/L，转化时间36h。
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物骨化三醇浓度，并计算生物转化率。
实施例3：
将假诺卡氏菌HRW001甘油管菌株接入固体平板培养基中进行活化，培养温度为33℃，静置培养3d。活化后的固体平板菌株接入1L摇瓶中进行一级种子扩大培养，装液量为300mL，培养温度为33℃，转速150rpm，培养周期3d。按3％的接种量将一级种子液接入50L二级种子罐中进行二级种子扩大培养，装液量为30L，培养温度为33℃，转速200rpm，通气量1.5vvm，罐压0.03MPa，培养周期2d；按15％的接种量将二级种子液接入200L发酵罐中进行发酵培养，装液量为150L，培养温度为33℃，初始pH为6.5，发酵20h后流加20％氨水控制pH在7.0左右，转速300rpm，通气量1.5vvm，罐压0.03MPa，培养周期4d，得到发酵液。
其中发酵培养基组成比例分别为：固体平板培养基(w/v)：葡萄糖0.3％、酵母粉0.08％、L-天冬酰胺0.03％、磷酸氢二钾0.03％、琼脂粉1.5％。一级种子培养基(w/v)：葡萄糖0.8％、酵母粉0.2％、L-天冬酰胺0.03％、磷酸氢二钾0.03％。二级种子培养基(w/v)：葡萄糖1.5％、酵母粉0.2％、L-天冬酰胺0.03％、磷酸氢二钾0.03％。发酵培养基(w/v)：葡萄糖2％、酵母粉0.05％、蛋白胨2％、L-天冬酰胺0.03％、磷酸氢二钾0.03％、氯化钠0.03％、消泡剂0.03％。
发酵液在3℃、8000rpm的条件下离心40min，收集菌体，并以生物转化培养基洗涤2次备用。
其中生物转化培养基的具体成分比例为：甲基倍他环糊精0.5％(w/v)、三羟甲基氨基甲烷20mM、丁二酸钠20mM、氯化镁3mM、氯化亚铁0.5mM、大豆油0.04％(w/v)、NADPH100mM。
将菌体按8％(w/v)比例加入生物转化培养基中，重新悬浮，加入底物阿法骨化醇化合物，对其进行微生物转化。转化培养条件为转化温度37℃、搅拌转速400rpm、通气量0.4vvm，阿法骨化醇添加量为0.7g/L，转化时间36h。
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物骨化三醇浓度，并计算生物转化率。
实施例4：
将假诺卡氏菌HRW001甘油管菌株接入固体平板培养基中进行活化，培养温度为37℃，静置培养5d。活化后的固体平板菌株接入1L摇瓶中进行一级种子扩大培养，装液量为300mL，培养温度为37℃，转速200rpm，培养周期4d。按5％的接种量将一级种子液接入50L二级种子罐中进行二级种子扩大培养，装液量为30L，培养温度为37℃，转速400rpm，通气量2vvm，罐压0.04MPa，培养周期3d；按20％的接种量将二级种子液接入200L发酵罐中进行发酵培养，装液量为150L，培养温度为37℃，初始pH为6.5，发酵20h后流加20％氨水控制pH在7.0左右，转速300rpm，通气量2vvm，罐压0.04MPa，培养周期5d，得到发酵液。
其中发酵培养基组成比例分别为：固体平板培养基(w/v)：葡萄糖0.5％、酵母粉0.1％、L-天冬酰胺0.05％、磷酸氢二钾0.05％、琼脂粉2％。一级种子培养基(w/v)：葡萄糖1％、酵母粉0.3％、L-天冬酰胺0.05％、磷酸氢二钾0.05％。二级种子培养基(w/v)：葡萄糖2％、酵母粉0.3％、L-天冬酰胺0.05％、磷酸氢二钾0.05％。发酵培养基(w/v)：葡萄糖4％、酵母粉0.1％、蛋白胨4％、L-天冬酰胺0.05％、磷酸氢二钾0.05％、氯化钠0.05％、消泡剂0.05％。
发酵液在4℃、10000rpm的条件下离心50min，收集菌体，并以生物转化培养基洗涤2次备用。
其中生物转化培养基的具体成分比例为：甲基倍他环糊精1％(w/v)、三羟甲基氨基甲烷30mM、丁二酸钠30mM、氯化镁5mM、氯化亚铁1mM、大豆油0.1％(w/v)、NADPH 150mM。
将菌体按10％(w/v)比例加入生物转化培养基中，重新悬浮，加入底物阿法骨化醇化合物，对其进行微生物转化。转化培养条件为转化温度40℃、搅拌转速500rpm、通气量0.5vvm，阿法骨化醇添加量为2.0g/L，转化时间48h。
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物骨化三醇浓度，并计算生物转化率。
实施例5：
将假诺卡氏菌HRW001甘油管菌株接入固体平板培养基中进行活化，培养温度为30℃，静置培养4d。活化后的固体平板菌株接入1L摇瓶中进行一级种子扩大培养，装液量为300mL，培养温度为30℃，转速200rpm，培养周期2d。按4％的接种量将一级种子液接入50L二级种子罐中进行二级种子扩大培养，装液量为30L，培养温度为30℃，转速300rpm，通气量1vvm，罐压0.03MPa，培养周期2d；按20％的接种量将二级种子液接入200L发酵罐中进行发酵培养，装液量为150L，培养温度为32℃，初始pH为6.5，发酵20h后流加20％氨水控制pH在7.0左右，转速200rpm，通气量1vvm，罐压0.03MPa，培养周期4d，得到发酵液。
其中发酵培养基组成比例分别为：固体平板培养基(w/v)：葡萄糖0.5％、酵母粉0.1％、L-天冬酰胺0.05％、磷酸氢二钾0.05％、琼脂粉2％。一级种子培养基(w/v)：葡萄糖1％、酵母粉0.2％、L-天冬酰胺0.05％、磷酸氢二钾0.03％。二级种子培养基(w/v)：葡萄糖1.5％、酵母粉0.2％、L-天冬酰胺0.05％、磷酸氢二钾0.03％。发酵培养基(w/v)：葡萄糖3％、酵母粉0.05％、蛋白胨2％、L-天冬酰胺0.05％、磷酸氢二钾0.03％、氯化钠0.05％、消泡剂0.01％。
发酵液在4℃、10000rpm的条件下离心30min，收集菌体，并以生物转化培养基洗涤2次备用。
其中生物转化培养基的具体成分比例为：甲基倍他环糊精0.5％(w/v)、三羟甲基氨基甲烷20mM、丁二酸钠25mM、氯化镁2mM、氯化亚铁0.5mM、大豆油0.05％(w/v)、NADPH200mM。
将菌体按6％(w/v)比例加入生物转化培养基中，重新悬浮，加入底物阿法骨化醇化合物，对其进行微生物转化。转化培养条件为转化温度35℃、搅拌转速500rpm、通气量0.1vvm，阿法骨化醇添加量为1.0g/L，转化时间36h。
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物骨化三醇浓度，并计算生物转化率。
对比例1：
按实施例5所述方法对菌株Pseudonocardia autotrophica NBRC 12743进行发酵培养和利用所得菌体进行阿法骨化醇转化为骨化三醇的试验。
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物骨化三醇浓度，并计算生物转化率。
对比例2：
按实施例5所述方法对菌株Pseudonocardia autotrophicaATCC 13181进行发酵培养和利用所得菌体进行阿法骨化醇转化为骨化三醇的试验。
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物骨化三醇浓度，并计算生物转化率。
分别按实施例1-5及对比例1-2所述发酵培养及转化方法进行试验，并测定阿法骨化醇转化为骨化三醇的转化率，实验结果对比见表1。
表1不同菌株、不同培养和转化方法对阿法骨化醇转化为骨化三醇的实验结果
序号 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 实施例5 对比例1 对比例2
转化率(％) 50.3 68.4 75.7 56.1 85.2 13.5 20.7
由上述实验结果可见，将本发明筛选所得假诺卡氏菌HRW001应用于甾醇化合物生物转化羟基化，具有较高的催化活性和专一性，附图1所示为Pseudonocardia sp.HRW001微生物转化阿法骨化醇(1α-(OH)VD3)为骨化三醇(1α,25-(OH)2VD3)反应前后的HPLC图谱对比，催化阿法骨化醇转化为骨化三醇的转化率最高达85.2％。本发明菌株与对比菌株相比，转化率大大提升。利用本发明建立的发酵和转化工艺进行大批量生产，可实现甾醇化合物高效的羟基化转化，从而极大的提高了转化效率，降低了分离纯化的难度和成本。
实施例6：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物A羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达83.7％。
实施例7：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物B羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达76.8％。
实施例8：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物C羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达82.6％。
实施例9：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物D羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达83.4％。
实施例10：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物E羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达86.1％。
实施例11：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物F羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达67.4％。
实施例12：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物G羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达71.9％。
实施例13：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物H羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达74.8％。
实施例14：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物I羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达96.5％。
实施例15：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物J羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达91.2％。
实施例16：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物K羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达88.3％。
实施例17：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物L羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达90.5％。
实施例18：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物M羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达80.4％。
实施例19：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物N羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达76.1％。
实施例20：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物O羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达74.8％。
实施例21：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物P羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达71.3％。
实施例22：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物Q羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达75.1％。
实施例23：
按实施例5所述方法对假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养和利用所得菌体进行微生物转化化合物R羟基化的反应过程如下：
经过上述发酵培养及转化过程后，HPLC检测产物的浓度，并计算生物转化率，达76.5％。

Claims (10)

1.一种假诺卡氏菌HRW001，其特征在于：分类命名为Pseudonocardia sp. HRW001，该菌株已于2019年04月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 17524。
2.利用权利要求1所述的假诺卡氏菌HRW001微生物转化甾醇类底物羟基化的方法，其特征在于，将假诺卡氏菌HRW001进行发酵培养、离心分离后得到假诺卡氏菌HRW001菌体，并将所述菌体应用于生物转化甾醇化合物羟基化。
3.一种制备权利要求2所述假诺卡氏菌HRW001菌体的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将假诺卡氏菌HRW001甘油管菌株接入固体平板培养基中进行活化，培养温度为25-37℃，静置培养2-5 d；
（2）活化后的固体平板菌株接入一级种子培养基进行一级种子扩大培养，培养温度为25-37℃，转速100-200 rpm，培养周期2-4 d；
（3）按1-5%的接种量将一级种子液接入二级种子培养基进行二级种子扩大培养，培养温度为25-37℃，转速100-400 rpm，通气量0.5-2 vvm，罐压0.02-0.04 MPa，培养周期2-3d；
（4）按5-20%的接种量将二级种子液接入发酵培养基进行发酵培养，培养温度为25-37℃，初始pH为6.5-7.0，发酵20 h后流加20%氨水控制pH在7.0-7.5左右，转速100-300 rpm，通气量0.5-2 vvm，罐压0.02-0.04 MPa，培养周期2-5 d，得到发酵液；
（5）发酵液低温离心过滤后，收集菌体备用。
4.根据权利要求3所述制备假诺卡氏菌HRW001菌体的方法，其特征在于：在步骤（1）、（2）、（3）、（4）中，培养基中包含碳源，该碳源包括葡萄糖、玉米浆粉、糖蜜、甘油和葡萄糖浆中的至少一种；培养基中还包含氮源，该氮源包括硫酸铵、大豆粉、酵母提取物、蛋白胨、硝酸钠、谷氨酸钠、氨水中的至少一种；培养基中还包括微量元素，该微量元素包括甘氨酸、谷氨酸、色氨酸、赖氨酸、L-天冬酰胺、维生素B1、维生素B6、维生素B12中的至少一种；培养基中还包括无机盐，该无机盐包括硫酸镁、氯化钾、氯化钠、氯化钙、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的至少一种。
5.根据权利要求3所述制备假诺卡氏菌HRW001菌体的方法，其特征在于：固体平板培养基（w/v）：葡萄糖 0.1-0.5%、酵母粉 0.05-0.1%、L-天冬酰胺 0.01-0.05%、磷酸氢二钾0.01-0.05%、琼脂粉 1-2%；
一级种子培养基（w/v）：葡萄糖 0.5-1%、酵母粉 0.1-0.3%、L-天冬酰胺 0.01-0.05%、磷酸氢二钾 0.01-0.05%；
二级种子培养基（w/v）：葡萄糖 1-2%、酵母粉 0.1-0.3%、L-天冬酰胺 0.01-0.05%、磷酸氢二钾 0.01-0.05%；
发酵培养基（w/v）：葡萄糖 1-4%、酵母粉 0.05-0.1%、蛋白胨 1-4%、L-天冬酰胺 0.01-0.05%、磷酸氢二钾 0.01-0.05%、氯化钠 0.01-0.05%、消泡剂 0.01-0.05%。
6.根据权利要求3所述制备假诺卡氏菌HRW001菌体的方法，其特征在于：步骤（5）中，发酵液在1-4℃、4000-10000 rpm的条件下离心10-50 min，收集菌体，并以生物转化培养基洗涤2次备用。
7.一种将权利要求2所述假诺卡氏菌HRW001菌体应用于生物转化甾醇化合物羟基化的方法，其特征在于，将假诺卡氏菌HRW001菌体重悬于新鲜的生物转化培养基中，加入底物甾醇化合物，对其进行微生物转化。
8.根据权利要求7所述假诺卡氏菌HRW001菌体应用于生物转化甾醇化合物羟基化的方法，其特征在于：生物转化培养基的组成为，甲基倍他环糊精0.1-1%（w/v）、三羟甲基氨基甲烷5-30 mM、丁二酸钠5-30 mM、氯化镁1-5 mM、氯化亚铁0.1-1 mM、大豆油0.01-0.1%（w/v）、NADPH 50-200 mM。
9.根据权利要求7所述假诺卡氏菌HRW001菌体应用于生物转化甾醇化合物羟基化的方法，其特征在于：转化培养条件为，转化温度30-40℃、搅拌转速300-500 rpm、通气量0.1-0.5 vvm、甾醇化合物添加量为0.1-2.0 g/L、转化时间24-48 h。
10.权利要求1所述的假诺卡氏菌HRW001生物转化羟基化的甾醇化合物包括但不限于：
。
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