CN1928071A - 植物乳杆菌及用该菌生物制备共轭亚油酸的方法 - Google Patents
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Abstract
植物乳杆菌CCTCC No.M206033及用该菌生物制备共轭亚油酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明提供的植物乳杆菌CCTCC No.M206033，在有氧环境中生长良好，该菌发酵时底物亚油酸与乳杆菌细胞直接接触，在膜结合的亚油酸异构酶作用下，亚油酸被转化为共轭亚油酸。其生物转化方法为该菌株先在含0.5mg/ml LA的MRS培养基中预培养12～14小时，以2.0×1010cfu/ml的菌体浓度转接到含1.0mg/ml游离亚油酸的pH6.5的MRS培养基中，37℃培养36小时，产量达221.5μg/ml，或以相同的菌体浓度转接到含1.0mg/ml游离亚油酸的0.1mol/L pH6.5的磷酸钾缓冲液中37℃培养24小时，产量达312.4μg/ml。
Description
技术领域
植物乳杆菌CCTCC No.M206033及用该菌生物制备共轭亚油酸的方法，特别是一种转化游离亚油酸生产共轭亚油酸的植物乳杆菌菌株和转化生产的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
亚油酸(简称LA)是一种含有顺-9，顺-12构象的十八碳二烯酸。共轭亚油酸(简称CLA)是各种含有共轭双键的亚油酸异构体的通称，是人类近20年来发现的最重要的功能性脂肪酸，其中顺-9，反-11和反-10，顺-12异构体具有生物活性。共轭亚油酸广泛存在于各类天然食物中，主要存在于瘤胃动物牛、羊等的乳脂及肉制品中，每克乳脂中CLA含量从2～25mg不等，且CLA的含量随奶牛的年龄增长而增加。
1978年，美国威斯康辛营养研究所的科学家们在研究肉类烘烤过程中产生致癌诱变剂时，偶然发现一种亚油酸的异构体能够抑制诱变。研究表明，共轭亚油酸除了具有很强的抗癌功能，还具有降脂减肥、调节人体代谢、提高免疫力、降血脂、降胆固醇、抗动脉粥样硬化、调节血糖、防治糖尿病、抗氧化、提高骨骼密度、抗疲劳、改善睡眠等功能。因此20世纪90年代中期，共轭亚油酸作为营养补充食品率先在美国上市销售后，迅速在北美、欧洲和日本等少数发达国家和地区热销，形成了健康营养物质消费的新时尚。
人工获得共轭亚油酸可通过化学法合成(吴冀华，2001)，或者通过某些微生物转化天然脂肪酸两种主要途径。生物法主要是利用微生物生长过程中合成的酶作用于底物，转化亚油酸生成共轭亚油酸。1967年Kepler和Tove(J.Biol.Chem.，242：5686-5692(1967))指出，顺-9，反11-18:2是瘤胃细菌如溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)作用于LA的第一个中间产物。瘤胃细菌中含有亚油酸异构酶，解释了反刍动物组织中有较高CLA的原因。有人将瘤胃中能把LA转化为CLA的细菌进行了富集，并对能大量合成反-10，顺12-18:2的菌株根据菌液浓度进行了排序(Park Y.et al.，Lipids.，34(3)：234-248(1999))。此外，从绵羊瘤胃中分离的5种严格厌氧细菌(1株Ruminococcus albus、2株Eubacterium spp、2株Fusocillus spp)，都能通过氢化作用把LA转化为CLA，但CLA在总产物中所占的比例高低不一。不过溶纤维丁酸弧菌等瘤胃细菌严格厌氧，不适合用于工业化生产CLA。另外，溶纤维丁酸弧菌等瘤胃细菌还含有不利于CLA合成的还原酶，该还原酶能把CLA进一步转化成其他化合物，某些反刍细菌还能使LA加氢变成硬脂酸。1998年Jiang等(Applied Microbiology.，85：95-102(1998))用MRS作初选培养基检测了7株乳杆菌、4株乳球菌、2株链球菌和6株丙酸菌将LA转化为CLA的能力，结果发现，在实验者所采用的条件下，仅有3株丙酸菌细胞培养物有合成CLA的能力，此外发现培养基组成、吐温80、蛋白质等因素会影响CLA的合成。1999年，美国科学家Pariza M W，Yang X.Y.([P]U.S.：5856149(1999))首先报道了一株乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri)具有一种细胞膜结合酶，它能以游离的亚油酸为原料合成CLA。
2001年日本的科学家Ogawa等(Appli.Envir.Microbiol.，67：1246-1252(2001))报道了嗜酸乳酸杆菌AKU 1137以LA为原料转化为CLA的过程不是从一个非共轭双键一步异构化为共轭双键，而是涉及到羟基脂肪酸(10-羟基-12顺-十八碳烯酸和10-羟基-12反-十八碳烯酸)中间产物的合成。这是首次揭示LA到CLA转化的机制，该嗜酸乳酸杆菌转化的产物主要是顺-9，反11-18:2；反-9，顺11-18:2和反-9，反11-18:2，几乎全部存在于菌体中或以游离脂肪酸的形式与菌体相连。
与化学合成法相比，生物法的转化率相对较低，但生物法合成共轭亚油酸具有特异性，产物中具有生物活性的顺-9，反11-18:2异构体含量很高，其它异构体含量少，而且生物法转化共轭亚油酸反应条件温和，能耗低，污染小，产品的安全性较高。Pariza等人([P]U.S.：5856149(1999))的研究表明，利用乳酸杆菌(Lactobacillus reuteri PYR8)转化共轭亚油酸，每克细胞转化产生7.8mg共轭亚油酸。得到的CLA中顺-9，反-11异构体的含量在98％以上，仅有少量的顺-9，顺11及反-9，顺-11异构体存在。
研究表明：溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)等瘤胃细菌则由于严格厌氧无法投入工业应用。乳酸杆菌发酵转化生产共轭亚油酸，在有氧气存在对异构酶的活性以及异构体的产率都没有影响，此外乳杆菌对于共轭亚油酸的耐受力较强，而且在食品领域具有潜在的应用价值。乳杆菌逐渐成为工业化发酵制备共轭亚油酸的研究热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物乳杆菌CCTCC No.M206033及用该菌生物制备共轭亚油酸的方法。
本发明的技术方案：一种将游离亚油酸生物转化为共轭亚油酸的菌珠，其分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZH008，保藏编号为CCTCCNo.M206033。
用CCTCC No.M206033生物制备共轭亚油酸的方法
通过预培养时间、培养基pH、转化培养时间、转化接种量等条件的选择，总结出该菌转化亚油酸生物制备共轭亚油酸的方法为：
(1)生物转化采用的菌株为CCTCC No.M206033；
(2)培养基为：
预培养基为含0.5mg/ml游离亚油酸的MRS培养基；
转化培养基为：含1.0mg/ml游离亚油酸的pH6.5的MRS培养基或含1.0mg/ml游离亚油酸的0.1mol/L pH6.5的磷酸钾缓冲液；
(3)预培养条件：1％接种量，37℃培养12-14小时；
(4)转化培养条件：预培养后的菌体以2.0×1010cfu/ml的菌体浓度转接到含1.0mg/ml游离亚油酸的pH6.5的MRS培养基中，37℃培养36小时；
或预培养后的菌体以2.0×1010cfu/ml的菌体浓度转接到含1.0mg/ml游离亚油酸的0.1mol/L pH6.5的磷酸钾缓冲液中，37℃培养24小时。
本发明的有益效果：我们通过大量的筛选工作，从生牛乳、泡菜汁液和新疆牧民自制酸奶三种来源中分离得到一种可转化游离亚油酸生成共轭亚油酸的菌珠，经鉴定确认它为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZH008，保藏编号CCTCC No.M206033。该菌发酵时底物亚油酸与乳杆菌细胞直接接触，在膜结合的亚油酸异构酶作用下，亚油酸被转化为共轭亚油酸顺-9，反-11异构体。该菌在有氧环境中生长良好。本发明还通过一系列实验，确定了共轭亚油酸高产率的发酵条件。为国内生物法转化亚油酸制备共轭亚油酸提供一种高效的生产工艺。因此本发明具有十分重要的商业价值和应用前景。
附图说明
图1CCTCC NO.M206033不同生长期转化CLA的能力。
图2在MRS培养基(含1.0mg/mlLA)中，转化培养时间对CCTCCNO.M206033转化CLA产率的影响。
生物样品保藏说明
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZH008已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏单位简称CCTCC，保藏日期2006年4月10日，保藏编号CCTCCNO.M206033。
具体实施方式
实施例1，植物乳杆菌CCTCC No.M206033生物制备共轭亚油酸的生产工艺
预培养时间对CLA转化率的影响：
以1％的接种量接入CCTCC No.M206033于MRS培养基(含0.5mg/ml LA或不含LA)，分别收集中经0，6h，12h，18h和24h，37℃培养的细胞，以2.0×1010cfu/ml的终浓度将上述细胞转接到1ml MRS(含1.0mg LA)中37℃培养24h，气相色谱检测其中CLA含量，结果见图1。
从图1可知，通过LA预培养CCTCC No.M206033细胞转化CLA的能力普遍得到提高，特别是处于对数生长期末期(12h)的细胞，其转化CLA的能力增加的最为显著，其CLA平均转化率从3.9％提高到11.7％。
以上实验确认以1％的接种量，在0.5mg/ml LA存在的情况下，预培养至对数期末期时对转化CLA最为有利，菌株转化生产共轭亚油酸比未经LA诱导培养下的能力强。
转化培养pH值对CLA转化率的影响：
收集CCTCC No.M206033在MRS(含0.5mg/ml LA)中经12h，37℃预培养的细胞(菌数约为2.0×1010cfu/ml)，添加上述细胞到1ml，LA添加量为1.0mg，pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5或8.0的MRS及磷酸盐缓冲液(KPB)反应体系中37℃培养24h，气相色谱法检测其中CLA含量结果如表1所示。
表1培养基不同pH值条件下以及不同pH缓冲液CLA转化结果
| CLA(μg/ml) | pH | ||||
| 6.0 | 6.5 | 7.0 | 7.5 | 8.0 | |
| MRSKPB | 102.865.4 | 128.572.3 | 113.658.7 | 86.331.8 | 67.410.2 |
从表1可以知道，无论是在MRS还是在KPB中反应，pH6.0～7.0为较合适的反应pH值，pH6.5为最适反应pH值。
转化培养时间对CLA转化率的影响：
(1)以含有1mg/ml LA的MRS为培养基：
收集经0.50mg/ml LA预培养12h的CCTCC No.M206033细胞，以2.0×1010cfu/ml的细胞终浓度转接上述细胞到1ml pH6.5的MRS培养基(含1.0mgLA)中37℃分别培养0、12h、24h、36h、48h，60h、72h，气相色谱检测其中CLA含量，结果如图2。
从图2中可以看出，在0～36h范围内，随着培养时间的增加植物乳杆菌CCTCC No.M206033在MRS体系中产生的CLA增加的比较显著。当培养时间超过36h，MRS体系中CLA含量增加的就很缓慢了。这个结果与Lin T.Y等(FoodChemistry，1999，67：1-5.)的实验结果相类似，同时也说明在我们采用的条件下，要获得高CLA含量的培养物，36h是比较合适的培养时间，产量为221.5μg/ml，再延长培养时间已没有必要。
或(2)以含有1mg/ml LA的0.1mol/L pH6.5的磷酸钾缓冲液为培养基：
收集400mlMRS培养基中经亚油酸诱导生长12h的植物乳杆菌CCTCCNO.M206033。悬浮于40ml 0.1mol/l pH6.5的磷酸钾缓冲溶液，使菌体浓度为2.0×1010cfu/ml，添加40mgLA乳浊液，120rpm，37℃分别反应12h，24h，36h和90h.。分离提取脂肪酸，用气相色谱分析脂肪酸组成。
结果显示，植物乳杆菌CCTCC NO.M206033完整细胞在磷酸钾缓冲溶液(0.1mol/l pH6.5)中能有效的将LA转化为CLA，主要是顺9，反11-CLA，当反应24h，31.24％的LA转化为顺-9，反11-CLA；顺-9，反11-CLA的产量为312.4μg/ml。
转化接种量对CLA转化率的影响：
为了考察细胞添加量对CCTCC No.M206033转化CLA能力的影响，我们收集经0.5mg/ml LA预培养12h的CCTCC NO.M206033细胞(菌体浓度分别为1.0×109、2.0×109、8.0×109、2.0×1010或4.0×1010cfu/ml)，添加上述细胞到1ml MRS(含1.0mg LA)中37℃培养36h，气相色谱检测其中CLA含量，结果如表2。
表2不同细胞浓度下CLA转化率
| 细胞浓度(cfu/ml) | 1.0×109 | 2.0×109 | 8.0×109 | 2.0×1010 | 4.0×1010 |
| CLA(μg/ml) | 12.6 | 67.3 | 218.7 | 287.4 | 260.3 |
| CLA转化率(％) | 1.3 | 6.7 | 21.9 | 28.7 | 26.0 |
从表2可以看出，随着菌体量的增加MRS反应体系中CLA的含量及转化率也随之增加，当细胞量从1.0×109cfu/ml增加到2.0×1010cfu/ml时CLA的转化率增加的最为明显，转化率从1.3％增加到28.7％。但随着菌体量的继续增加，CLA转化率反而有所下降。所以我们选择2×1010cfu/ml的细胞浓度作为CCTCCNO.M206033细胞转化CLA比较理想的细胞添加量。
综上所述，植物乳杆菌CCTCC NO.M206033以1％的接种量，在含0.5mg/mlLA的MRS培养基诱导培养至对数期末期(12-14h)后，以2.0×1010cfu/ml菌体浓度转接到pH6.5，含1.0mg/ml LA的MRS培养基中，37℃作用36h时CLA转化率最高。预培养物也可以相同菌体浓度转接到含有1mg/ml LA的0.1mol/LpH6.5的磷酸钾缓冲液中，37℃作用24小时后CLA转化率最高。
Claims (2)
1、一种将游离亚油酸生物转化为共轭亚油酸的菌珠，其分类命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ZH008，保藏编号为CCTCC No.M206033。
2、一种用植物乳杆菌CCTCC No.M206033生物制备共轭亚油酸的方法，其特征是：
(1)生物转化采用的菌株为CCTCC No.M206033；
(2)培养基为：
预培养基为含0.5mg/ml游离亚油酸的MRS培养基；
转化培养基为含1.0mg/ml游离亚油酸、pH6.5的MRS培养基或含1.0mg/ml游离亚油酸的0.1mol/L pH6.5的磷酸钾缓冲液；
(3)预培养条件：1％接种量，37℃培养12-14小时；
(4)转化培养条件：预培养后的菌体以2.0×1010cfu/ml的菌体浓度转接到含1.0mg/ml游离亚油酸的pH6.5的MRS培养基中，37℃培养36小时；
或预培养后的菌体以2.0×1010cfu/ml的菌体浓度转接到含1.0mg/ml游离亚油酸的0.1mol/L pH6.5的磷酸钾缓冲液中，37℃培养24小时。
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