CN101063155B - 一种利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法。该利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法，是将亚油酸和亚油酸异构酶在超临界二氧化碳中反应1至3小时，得到共轭亚油酸；所述反应的压力为25-35Mpa，反应温度为32-44℃。本发明利用超临界流体-超临界二氧化碳作为酶催化反应介质，降低了生产成本低，安全环保，提高共轭亚油酸的转化率。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法。
背景技术
共轭亚油酸(Conjugated Linoleic Acid，CLA)是一种非常令人感兴趣的营养添加剂，大量的体内体外试验证明CLA能诱导能量利用并导致体重的下降，且不储存脂肪；能缓和如厌食、蛋白质分解等免疫反应的副作用；具有抗突变、抑制癌细胞中的蛋白质和核酸的合成，此外CLA还可提高人类某些生理状态，如提高体内维生素A的水平。由于CLA具有丰富的营养价值，同时食品中含量很低，所以如何低成本、高纯度地制备CLA成为研究焦点，CLA的商业化生产方法为亚油酸的碱异构化法。碱异构化法的原料是含有77％亚油酸的葵花籽油，经过KOH(或NaOH)强碱的作用转化成CLA，这种方法比较简单，且产物易于处理，在商业上应用较广，但其缺点是产生一系列具有位置和几何异构的CLA混合物。相比之下，利用乳酸菌中提取的亚油酸异构酶生产CLA具有重要意义。因为CLA的微生物异构化具有选择性，其亚油酸异构酶能专一地作用于脂肪酸的12C双键，而不是9C双键，因而能把亚油酸主要转化为c9，t11-CLA，而且微生物在培养方面较为灵活、方便。而乳酸菌兼性厌氧，培养条件易于控制，是人体益生菌，可直接用于食品、保健品和药品。同时乳酸菌含有的亚油酸异构酶对作用底物具有很强的专一性。
常用的酶催化反应介质有水、有机溶剂(丙酮、正己烷等)、超临界流体(主要为超临界二氧化碳，SCCO2)。由于油脂在水中的溶解度小及微生物污染等问题，以水为反应介质的酶催化反应受到了一定限制。近年来有研究表明酶在有机溶剂中能够保持良好的催化活性，因此人们选用有机溶剂代替水为酶催化反应介质。但有机溶剂存在如下问题：其一，较大的多相传质阻力限制了反应速率的提高；其二，溶剂残留降低了产品质量，被“绿色食品”市场所不容；另外，有机溶剂较高的价格使产品成本大为增加。作为酶催化反应介质之一，超临界二氧化碳(SCCO2)因具有如下优点而日益受到人们的重视：
1、二氧化碳廉价、阻燃、化学惰性；
2、SCCO2具有高扩散系数、低粘度和低表面张力等特性，可有效降低反应过程中的传质阻力，有利于反应进行；
3、二氧化碳的临界温度(Tc＝304.19K)接近室温，临界压力(Pc＝7.382MPa)也比较适中，操作安全；
4、以SCCO2为反应介质，反应后期的产物提纯与溶剂分离过程简单：
5、SCCO2无毒，随着人类对自身健康和对环境保护的日益重视，它的应用前景将更为广阔。
由于超临界二氧化碳具有上述优点，因此，越来越多的研究人员将其作为酶催化反应介质。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法。
本发明所提供的利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法，是将亚油酸和亚油酸异构酶在超临界二氧化碳中反应1至3小时，得到共轭亚油酸；所述反应的压力为25-35Mpa，反应温度为32-44℃。
上述方法中，反应条件具体可为1)所述反应温度为32℃，反应压力为25Mpa，反应时间为2小时；2)所述反应温度为40℃，反应压力为35Mpa，反应时间为3小时；3)所述反应温度为44℃，反应压力为30Mpa，反应时间为1小时。
所述亚油酸和亚油酸异构酶的配比可为2-5mg亚油酸∶1-3mL亚油酸异构酶(酶比活力为6.84U/ml)；所述亚油酸和亚油酸异构酶的配比优选为5mg亚油酸∶2mL亚油酸异构酶。
所述亚油酸异构酶可按照包括如下步骤的方法从亚油酸异构酶产生菌的菌体中提取纯化：
1)用超高压均质法破碎亚油酸异构酶产生菌的菌体细胞，得到均质液，将该均质液进行离心，收集含有蛋白质的上清液得到粗酶液；
所述超高压均质法的均质工作压力为130-160MPa，均质阀片直径为0.05-0.15mm；
2)将步骤1)得到的粗酶液进行(NH4)2SO4饱和度为40-90％的(NH4)2SO4分级沉淀，收集沉淀，用磷酸钾缓冲液悬浮，得到酶液；所述磷酸钾缓冲液的摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0；
3)将步骤2)得到的酶液进行离子交换层析，所述离子交换层析采用pH为5.5-7.0、摩尔浓度为0.1-0.7mol/L的NaCl溶液进行线性洗脱，收集具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液；
4)将步骤3)得到的具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液用摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0的磷酸钾缓冲液进行透析脱盐；
5)将经过步骤4)透析的酶液凝胶过滤层析；所述凝胶过滤层析中采用的洗脱液为摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0的磷酸钾缓冲液，得到亚油酸异构酶。
其中，所述离子交换层析中，可采用pH为5.5-7.0、摩尔浓度为0.3-0.5mol/L的NaCl溶液进行线性洗脱。
所述超高压均质法的工艺参数具体可为：均质工作压力为130MPa、均质阀片直径为0.05mm，140MPa、均质阀片直径为0.1mm，或150MPa、均质阀片直径为0.15mm。所述磷酸钾缓冲液的摩尔浓度和pH具体可选择：摩尔浓度为0.1mol/L、pH为pH6.0，0.08mol/L、pH为pH5.5，或0.15mol/L、pH为pH7.0。
所述凝胶过滤层析采用的凝胶层析柱具体可为Sephacryl 200HR、也可采用其它的分子量范围与上述填料相近似的层析柱，如Sephadex。
所述离子交换层析采用的层析柱具体可为DEAE-Sepharose Fast Flow层析柱，也可采用其它的弱阴离子交换层析柱。
所述(NH4)2SO4的饱和度具体可为60％、80％或90％。
所述亚油酸异构酶产生菌可为现有的任何亚油酸异构酶产生菌，如可为乳酸杆菌属(Lactobacillus)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)和真杆菌属(Eubacterium)等中的一种或一种以上的菌种或菌株。如乳酸杆菌属(Lactobacillus)中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974，已于2007年03月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市海淀区中关村北一条13号)，保藏登记号为CGMCC No.1974。
本发明利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法，利用超临界流体-超临界二氧化碳作为酶催化反应介质，降低了生产成本低，安全环保，提高共轭亚油酸的转化率。
附图说明
图1为实施例1的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析洗脱图谱
图2为实施例1的酶活检测图
图3为实施例1的凝胶过滤层析洗脱及酶活检测图谱
图4为实施例2的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析洗脱图谱
图5为实施例2的酶活检测图
图6为实施例2的凝胶过滤层析洗脱及酶活检测图谱
图7为实施例3的DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析洗脱图谱
图8为实施例3的酶活检测图
图9为实施例3的凝胶过滤层析洗脱及酶活检测图谱
具体实施方式
本发明中设定的超临界二氧化碳反应条件如下：
反应时间 0～4h
反应压力 20～50Mpa
反应温度 30～50℃。
通过试验进行优化。优化指标为CLA产量，采用紫外分光光度法测定CLA含量。优选出优化的反应条件为：
反应时间 1～3h
反应压力 25～35Mpa
反应温度 32～44℃。
实施例1、利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸
一、提取纯化亚油酸异构酶
1、亚油酸异构酶发酵液的获得
该实施例中所用的发酵培养基按照如下方法配制：
(1)葵花籽油乳化液的配制：葵花籽油(上海佳格食品有限公司，多力牌100％纯正葵花籽油)300mg，吐温-80(Tween-80)0.36ml，去离子水5ml，超声波乳化(25℃，超声频率40KHz)10min，0.22μm微孔过滤膜过滤除菌，得到葵花籽油乳化液。
(2)脱脂乳培养基的配制：将12g脱脂奶粉(三元乳品股份有限公司)溶解于100ml水中，115℃、10min灭菌备用。
(3)发酵培养基的配制：将(1)的葵花籽油乳化液加入到(2)的脱脂乳培养基中，使葵花籽油的终浓度为10mg/ml，得到发酵培养基。
将经活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974用接种环挑取2环于种子培养基中，37℃培养8h后，取2％(体积比)种子培养液转接至装有4L发酵液的5L发酵罐中，37℃培养24小时。其中，发酵罐的通风量(通氮气)：0-24小时，0.5vvm。
2、亚油酸异构酶的提取
将步骤1中的发酵液进行10000×g，15min的离心，收集细胞。向收集的细胞中加入0.1M磷酸钾缓冲液(pH6.0)和溶菌酶，使菌体的最终含量为2×1011CFU/ml，溶菌酶的终浓度为40g/L。用纳米NCJJ0.005/150型超高压均质机(河北廊坊通用机械有限公司)进行细胞破碎。其中，超高压均质的均质工作压力为140MPa，均质阀片直径0.1mm，重复四次，每次处理10min，处理温度为0℃。均质液经10000×g离心60min，取上清液部分，作为进一步纯化的粗酶液。
3、亚油酸异构酶的纯化
a.(NH4)2SO4分级沉淀
在冰水浴条件下，向步骤1得到的粗酶液中加入(NH4)2SO4至饱和度为80％(在冰浴中将研磨细的(NH4)2SO4边搅拌边缓慢的加入到粗酶液中，每升粗酶液加入(NH4)2SO4516克，4℃静置过夜、离心(10000×g，30min)收集沉淀(蛋白)，将每次所得沉淀用2-3倍体积的磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)悬浮，用聚乙二醇浓缩，得到酶液。
b.离子交换层析
所得的酶液上样到用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)预平衡的DEAE-Sepharose FastFlow层析柱(1.0cm×20cm)(Pharmacia公司)，用0～0.8mol/LNaCl的缓冲液以3ml/min流速进行线性洗脱每管收集5mL，NaCl线性洗脱出4个蛋白峰，如图1。其中峰III为酶活力峰，如图2所示，即NaCl摩尔浓度为0.3-0.5mol/L洗脱峰具有亚油酸异构酶活性。
其中，亚油酸异构酶酶活，以在最适条件(30℃，5h，pH6.0)下，以亚油酸为底物进行反应，每小时生成1μg共轭亚油酸的酶量定义为一个酶活力单位。其中，共轭亚油酸采用紫外分光光度法测定，具体方法如下：1)将CLA标准品用正己烷配成不同浓度梯度溶液，测定233nm处吸光度值，以CLA浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2)5ml洗脱液中加入10ml V(氯仿)/V(甲醇)＝2∶1，4500r/min(2000g)离心5min，收集下层液体，用无水Na2SO4干燥，并真空干燥脱除有机溶剂。将上述提取物用10ml正己烷溶解，待测。3)紫外分光光度计在200～350nm范围内扫描，并读取233nm处的吸收值，参比为正己烷溶液，其他步骤同样品。
c.酶液透析脱盐
将步骤b中收集的具有亚油酸异构酶活性的酶液装入透析袋中，浸入1000ml磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)中，4℃下磁力搅拌12h，用10mM的NaCl缓冲液(pH6.0)检查脱盐情况，至无沉淀产生时，达到透析平衡。
d.凝胶过滤层析
将步骤c中到达到透析平衡的酶液上样到用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)预平衡的Sephacryl 200HR凝胶层析柱(1.6cm×100cm)(Pharmacia公司)，以0.3ml/min流速，用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)洗脱，每管收集3mL，对每管洗脱液进行酶活检测，收集具有亚油酸异构酶活性的部分。结果如图3所示，第30-37管收集液，具有亚油酸异构酶活性。该具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液的酶比活力为246.24U/mg洗脱峰酶液。其中，亚油酸异构酶活性的测定方法同步骤b。
二、利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸
将5mg亚油酸(SIGMA公司、O5507)与2ml步骤一的亚油酸异构酶液(6.84U/ml)混合，装入高压釜中，水浴加热到32℃后，密封，用低压二氧化碳排除反应釜和管路中的空气，调节二氧化碳压力到25Mpa，同时开启搅拌并记时反应2h。
采用紫外分光光度法测定CLA异构体的总量，具体方法如下：1)将CLA标准品用正己烷配成不同浓度梯度溶液，测定233nm处吸光度值，以CLA浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。2)2ml反应液中加入4ml V(氯仿)/V(甲醇)＝2∶1，4500r/min(2000g)离心5min，收集下层液体，用无水Na2SO4干燥，并真空干燥脱除有机溶剂。将上述脂肪酸提取物用5ml正己烷溶解，待测。3)紫外分光光度计在200～350nm范围内扫描，并读取233nm处的吸收值，参比为不加酶液的反应液，其他步骤同样品。
结果表明CLA的生成量为0.897mg。测得生成CLA异构体总量的转化率(CLA异构体总量/亚油酸量)为17.94％。
实施例2、利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸
1、亚油酸异构酶发酵液的获得
该实施例中所用的发酵培养基按照如下方法配制：
该实施例中所用的发酵培养基按照如下方法配制：
(1)葵花籽油乳化液的配制：葵花籽油(上海佳格食品有限公司，多力牌100％纯正葵花籽油)400mg，吐温-80(Tweenum 80)0.44ml，去离子水5ml，超声波乳化(25℃，超声频率40KHz)10min，0.22μm微孔过滤膜过滤除菌，得到葵花籽油乳化液。
(2)脱脂乳培养基的配制：将12g脱脂奶粉(北京三元乳品股份公司提供)溶解于100ml水中，115℃、10min灭菌备用。
(3)发酵培养基的配制：将(1)的葵花籽油乳化液加入到(2)的脱脂乳培养基中，使葵花籽油的终浓度为8mg/ml，得到发酵培养基。
将经活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974用接种环挑取2环于种子培养基中，37℃培养8h后，取2％(体积比)种子培养液转接至装有4L发酵液的5L发酵罐中，37℃微氧(充N2驱除空气)培养12小时。其中，发酵罐的通风量(通氮气)：0-12小时，0.5vvm。
2、亚油酸异构酶的提取
将步骤1中的发酵液进行10000×g，15min的离心，收集细胞。向收集的细胞中加入0.08M磷酸钾缓冲液(pH5.5)和溶菌酶，使细胞的最终含量为5×1010CFU/ml，溶菌酶的终浓度为20g/L。用纳米NCJJ0.005/150型超高压均质机(河北廊坊通用机械有限公司)进行细胞破碎。其中，超高压均质的均质工作压力为130MPa，均质阀片直径0.05mm，重复四次，每次处理10min，处理温度为0℃。均质液经10000×g离心60min，取上清液部分，作为进一步纯化的粗酶液。
3、亚油酸异构酶的纯化
a.(NH4)2SO4分级沉淀
在冰水浴条件下，向步骤1得到的粗酶液中加入(NH4)2SO4至饱和度为90％(在冰浴中将研磨细的(NH4)2SO4边搅拌边缓慢的加入到粗酶液中，每升粗酶液加入(NH4)2SO4603克，4℃静置过夜、离心(10000×g，30min)收集沉淀(蛋白)，将每次所得沉淀用2-3倍体积的磷酸钾缓冲液0.08M pH5.5悬浮，用聚乙二醇浓缩，得到酶液。
b.离子交换层析
所得的酶液上样到用磷酸钾缓冲液(0.08M pH5.5)预平衡的DEAE-SepharoseFast Flow层析柱(1.0cm×20cm)(Pharmacia公司)，用0～0.8MNaCl的缓冲液以3ml/min流速进行线性洗脱每管收集5mL，NaCl线性洗脱出4个蛋白峰，如图4。其中峰III为酶活力峰，如图5所示，即NaCl摩尔浓度为0.3-0.5mol/L洗脱峰具有亚油酸异构酶活性。
其中，亚油酸异构酶酶活的测定方法同实施例1。
c.酶液透析脱盐
将步骤b中收集的具有亚油酸异构酶活性的酶液装入透析袋中，浸入1000ml磷酸钾缓冲液(0.08M pH5.5)中，4℃下磁力搅拌12h，用10mM的NaCl缓冲液(pH5.5)检查脱盐情况，至无沉淀产生时，达到透析平衡。
d.凝胶过滤层析
将步骤c中到达到透析平衡的酶液上样到用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)预平衡的Sephacryl 200HR凝胶层析柱(1.6cm×100cm)(Pharmacia公司)，以0.3ml/min流速，用磷酸钾缓冲液(0.08M pH5.5)洗脱，每管收集3mL，对每管洗脱液进行酶活检测，收集具有亚油酸异构酶活性的部分。结果如图6所示，第31-36管洗脱液具有亚油酸异构酶活性。该具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液的酶比活力235.11U/mg洗脱峰酶液。其中，亚油酸异构酶活性的测定方法同实施例1。
二、利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸
将5mg亚油酸(SIGMA公司、O5507)与2ml步骤一的亚油酸异构酶液(6.84U/ml)混合，装入高压釜中，水浴加热到40℃后，密封，用低压二氧化碳排除反应釜和管路中的空气，调节二氧化碳压力到35Mpa，同时开启搅拌并记时反应3h。
采用紫外分光光度法测定CLA异构体的总量，测定方法同实施例1。
结果表明CLA的生成量为0.841mg，测得生成CLA异构体总量的转化率(CLA异构体总量/亚油酸量)为16.82％。
实施例3、利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸
1、亚油酸异构酶发酵液的获得
该实施例中所用的发酵培养基按照如下方法配制：
(1)葵花籽油乳化液的配制：葵花籽油(上海佳格食品有限公司，多力牌100％纯正葵花籽油)600mg，吐温-80(Tween-80)0.5ml，去离子水5ml，超声波乳化(25℃，超声频率40KHz)10min，0.22μm微孔过滤膜过滤除菌，得到葵花籽油乳化液。
(2)脱脂乳培养基的配制：将12g脱脂奶粉(三元乳品股份有限公司)溶解于100ml水中，115℃、10min灭菌备用。
(3)发酵培养基的配制：将(1)的葵花籽油乳化液加入到(2)的脱脂乳培养基中，使葵花籽油的终浓度为6mg/ml，得到发酵培养基。
将经活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974用接种环挑取2环于种子培养基中，37℃培养8h后，取2％(体积比)种子培养液转接至装有4L发酵液的5L厌氧发酵罐中，37℃微氧培养(充N2驱除空气)培养8小时。其中，发酵罐的通风量(通氮气)：0-8小时，0.5vvm。
2、亚油酸异构酶的提取
将步骤1中的发酵液进行10000×g，15min的离心，收集细胞。向收集的细胞中加入0.15M磷酸钾缓冲液(pH7.0)和溶菌酶，使菌体的最终含量为细胞的最终含量为2×1012CFU/ml，溶菌酶的终浓度为50g/L。用纳米NCJJ0.005/150型超高压均质机(河北廊坊通用机械有限公司)进行细胞破碎。其中，超高压均质的均质工作压力为150MPa，均质阀片直径0.15mm，重复四次，每次处理10min，处理温度为0℃。均质液经10000×g离心60min，取上清液部分，作为进一步纯化的粗酶液。
3、亚油酸异构酶的纯化
a.(NH4)2SO4分级沉淀
在冰水浴条件下，向步骤1得到的粗酶液中加入(NH4)2SO4至饱和度为60％(在冰浴中将研磨细的(NH4)2SO4边搅拌边缓慢的加入到粗酶液中，每升粗酶液加入(NH4)2SO4361克，4℃静置过夜、离心(10000×g，30min)收集沉淀(蛋白)，将每次所得沉淀用2-3倍体积的磷酸钾缓冲液(0.15M pH7.0)悬浮，用聚乙二醇浓缩，得到酶液。
b.离子交换层析
所得的酶液上样到用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)预平衡的DEAE-Sepharose FastFlow层析柱(1.0cm×20cm)(Pharmacia公司)，用0～0.8MNaCl的缓冲液以3ml/min流速进行线性洗脱每管收集5mL，NaCl线性洗脱出4个蛋白峰，如图7。其中峰III为酶活力峰，如图8所示，即NaCl摩尔浓度为0.3-0.5mol/L洗脱峰具有亚油酸异构酶活性。
其中，亚油酸异构酶酶活的测定方法同实施例1。
c.酶液透析脱盐
将步骤b中收集的具有亚油酸异构酶活性的酶液装入透析袋中，浸入1000ml磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)中，4℃下磁力搅拌12h，用10mM的NaCl缓冲液(pH6.0)检查脱盐情况，至无沉淀产生时，达到透析平衡。
d.凝胶过滤层析
将步骤c中到达到透析平衡的酶液上样到用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)预平衡的Sephacryl 200HR凝胶层析柱(1.6cm×100cm)(Pharmacia公司)，以0.3ml/min流速，用磷酸钾缓冲液(0.1M pH6.0)洗脱，每管收集3mL，对每管洗脱液进行酶活检测，收集具有亚油酸异构酶活性的部分。结果如图9所示，第31-36管洗脱液具有亚油酸异构酶活性。该具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液的酶比活力219.33U/mg洗脱峰酶液。其中，亚油酸异构酶活性的测定方法同实施例1。
二、利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸
将5mg亚油酸(SIGMA公司、O5507)与2ml步骤一的亚油酸异构酶液(6.84U/ml)混合，装入高压釜中，水浴加热到44℃后，密封，用低压二氧化碳排除反应釜和管路中的空气，调节二氧化碳压力到30Mpa，同时开启搅拌并记时反应1h。
采用紫外分光光度法测定CLA异构体的总量，具体测定方法同实施例1。
结果表明CLA的生成量为0.856mg，CLA异构体总量的转化率(CLA异构体总量/亚油酸量)为17.12％。
Claims (9)
1.一种利用亚油酸异构酶生产共轭亚油酸的方法，是将亚油酸和亚油酸异构酶在超临界二氧化碳中反应1至3小时，得到共轭亚油酸；所述反应的压力为25-35Mpa，反应温度为32-44℃；
所述亚油酸异构酶的产生菌为乳酸杆菌属(Lactobacillus)中的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SY CGMCC No.1974。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应温度为32℃，反应压力为25Mpa，反应时间为2小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应温度为40℃，反应压力为35Mpa，反应时间为3小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述反应温度为44℃，反应压力为30Mpa，反应时间为1小时。
5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述亚油酸和亚油酸异构酶的配比为2-5mg亚油酸∶6.84-20.52U.
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述亚油酸和亚油酸异构酶的配比为5mg亚油酸∶13.68U。
7.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述亚油酸异构酶按照包括如下步骤的方法从亚油酸异构酶产生菌的菌体中提取纯化：
1)用超高压均质法破碎亚油酸异构酶产生菌的菌体细胞，得到均质液，将该均质液进行离心，收集含有蛋白质的上清液得到粗酶液；
所述超高压均质法的均质工作压力为130-160MPa，均质阀片直径为0.05-0.15mm；
2)将步骤1)得到的粗酶液进行(NH4)2SO4饱和度为40-90％的(NH4)2SO4分级沉淀，收集沉淀，用磷酸钾缓冲液悬浮，得到酶液；所述磷酸钾缓冲液的摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0；
3)将步骤2)得到的酶液进行离子交换层析，所述离子交换层析采用pH为5.5-7.0、摩尔浓度为0.1-0.7mol/L的NaCl溶液进行线性洗脱，收集具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液；
4)将步骤3)得到的具有亚油酸异构酶活性的洗脱峰酶液用摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0的磷酸钾缓冲液进行透析脱盐；
5)将经过步骤4)透析的酶液凝胶过滤层析；所述凝胶过滤层析中采用的洗脱液为摩尔浓度为0.08-0.15mol/L、pH为5.5-7.0的磷酸钾缓冲液，得到亚油酸异构酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述离子交换层析中，采用pH为5.5-7.0、摩尔浓度为0.3-0.5mol/L的NaCl溶液进行线性洗脱。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述超高压均质法的均质工作压力为130MPa、均质阀片直径为0.05mm，140MPa、均质阀片直径为0.1mm，或150MPa、均质阀片直径为0.15mm；所述磷酸钾缓冲液的摩尔浓度为0.1mol/L、pH为pH6.0，0.08mol/L、pH为pH5.5，或0.15mol/L、pH为pH7.0；所述凝胶过滤层析采用的凝胶层析柱为Sephacryl 200HR；所述离子交换层析采用的层析柱为DEAE-Sepharose FastFlow层析柱；所述(NH4)2SO4的饱和度为60％、80％或90％。
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