CN112708587B

CN112708587B - 一种可高产共轭亚油酸的植物乳杆菌工程菌

Info

Publication number: CN112708587B
Application number: CN201911020755.7A
Authority: CN
Inventors: 杨波; 陈海琴; 高鹤; 赵建新; 张灏; 陈卫
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2039-10-25
Also published as: CN112708587A

Abstract

本发明公开了一种可高产共轭亚油酸的植物乳杆菌工程菌，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明的植物乳杆菌工程菌可高产共轭亚油酸且其所产得的共轭亚油酸异构体多为cis9,trans11‑CLA，将本发明的植物乳杆菌工程菌加入含亚油酸的培养基中培养72h，即可使共轭亚油酸的转化率高达89.9％，且可使共轭亚油酸中cis9,trans11‑CLA的含量高达100％；植物乳杆菌是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，因此，本发明植物乳杆菌工程菌所产得的共轭亚油酸对人体而言，安全性更高。

Description

一种可高产共轭亚油酸的植物乳杆菌工程菌

技术领域

本发明涉及一种可高产共轭亚油酸的植物乳杆菌工程菌，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

自1978年，美国威斯康星州立大学Michael W.Pariza等发现共轭亚油酸以来，关于共轭亚油酸的研究便备受关注。经研究证实，共轭亚油酸具有抗肿瘤、抗氧化、降低动物和人体胆固醇、抗动脉粥样硬化、提高免疫力和提高骨髓密度等多种重要的生物学功能。在美国，共轭亚油酸已作为食品补充剂上市，它是美国食品学会推荐的流行补充剂之一。我国已批准共轭亚油酸可用于具有减肥、调节血脂和免疫调节功能的保健食品的生产。近年来，共轭亚油酸在食品工业中的应用也引起了研究者的广泛关视。

共轭亚油酸可以被视为由必需脂肪酸——亚油酸衍生的共轭双键的多种位置和几何异构体的总称。其主要位置异构体有4种，分别为8,10-CLA、9,11-CLA、10,12-CLA和11,13-CLA，而每种位置异构体又有4种几何异构体。这样，共轭亚油酸的立体异构体就多达十几种。但事实上，无论是天然形成的还是人工合成的共轭亚油酸都以cis9,trans11-CLA、trans10, cis12-CLA、trans9,trans11-CLA和cis9,cis12-CLA4种异构体为主，其中，cis9,trans11-CLA 和trans10,cis12-CLA两种异构体被证实具有很强的生理活性。因此，市场上对cis9, trans11-CLA和trans10,cis12-CLA的需求最大。

天然共轭亚油酸主要存在于瘤胃动物，如牛、羊的乳脂及肉制品中，这是因为反刍动物肠道中厌氧的溶纤维丁酸弧菌产生的亚油酸异构酶能使亚油酸转化为共轭亚油酸，且以cis9, trans11-CLA异构体的形式为主。植物和海洋食品中也含有共轭亚油酸。但是，瘤胃动物、植物和海洋食品中共轭亚油酸的含量都很少，难以满足市场对于共轭亚油酸的需求。因此，人们逐渐将视线转移到了人工合成共轭亚油酸上。

微生物合成法具有污染少、所得共轭亚油酸异构体种类单一的优点，是目前最为热门的人工合成共轭亚油酸的方法。但是，现有的微生物合成法仍存在许多缺陷，缺陷如下：

第一，大部分可高产共轭亚油酸的微生物为致病菌，存在极大的安全性问题，不能直接作为共轭亚油酸生产菌株进行工业化生产，例如，溶纤维丁酸弧菌、丙酸杆菌以及产芽孢梭状芽孢杆菌等；

第二，大部分可高产共轭亚油酸的微生物为严格厌氧菌，在工业或实验室中不易培养且产量较低，难以广泛应用到食品和药品中，例如，溶纤维丁酸弧菌以及双歧杆菌等；

第三，部分可产共轭亚油酸的微生物产量不高，若作为共轭亚油酸生产菌株进行工业化生产，生产效率过低，例如，植物乳杆菌ZS2058(具体可见参考文献：齐慧,杨波等.植物乳杆菌ZS2058生物转化共轭亚油酸机理的研究[D],江南大学,2017)。

上述缺陷使得现有的微生物合成法无法真正实现共轭亚油酸的大规模工业化生产，因此，急需找到一种安全性高、非严格厌氧且产量高的共轭亚油酸生产菌株以克服上述缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种安全性高、非严格厌氧且产量高的植物乳杆菌工程菌。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种植物乳杆菌工程菌，所述植物乳杆菌工程菌以植物乳杆菌为表达宿主，表达氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亚油酸异构酶。

在本发明的一种实施方式中，所述亚油酸异构酶来源于短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)。

在本发明的一种实施方式中，所述亚油酸异构酶来源于短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828。

在本发明的一种实施方式中，编码所述亚油酸异构酶的基因的核苷酸序列如SEQID No.5 所示。

在本发明的一种实施方式中，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum) ST-III。所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-III记载于公开号为CN1207382A的专利申请文本中，保藏编号为CGMCC No.0847。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌以pNZ44质粒为表达载体。

本发明还提供了上述植物乳杆菌工程菌在生产共轭亚油酸方面的应用。

本发明还提供了一种生产共轭亚油酸的方法，所述方法为将上述植物乳杆菌工程菌接种至含有亚油酸的培养基中，于温度为35～40℃的条件下静置培养，得到富含共轭亚油酸的培养液；将富含共轭亚油酸的培养液进行提取，得到共轭亚油酸。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将上述植物乳杆菌工程菌接种至含有亚油酸的培养基中，于温度为37℃的条件下静置培养，得到富含共轭亚油酸的培养液；将富含共轭亚油酸的培养液进行提取，得到共轭亚油酸。

在本发明的一种实施方式中，所述共轭亚油酸为cis9,trans11-CLA。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为MRS培养基。

本发明还提供了上述植物乳杆菌工程菌在生产亚油酸异构酶方面的应用，所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种生产亚油酸异构酶的方法，所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述方法为先将上述植物乳杆菌工程菌接种至培养基中，于温度为35～40℃的条件下静置培养，得到富含亚油酸异构酶的植物乳杆菌工程菌，然后将富含亚油酸异构酶的植物乳杆菌工程菌进行提取，得到亚油酸异构酶。

在本发明的一种实施方式中，所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述方法为先将上述植物乳杆菌工程菌接种至培养基中，于温度为37℃的条件下静置培养，得到富含亚油酸异构酶的植物乳杆菌工程菌，然后将富含亚油酸异构酶的植物乳杆菌工程菌进行提取，得到亚油酸异构酶。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为MRS培养基。

[有益效果]

(1)本发明的植物乳杆菌工程菌可高产共轭亚油酸且其所产得的共轭亚油酸异构体多为cis9,trans11-CLA，将本发明的植物乳杆菌工程菌加入含亚油酸的培养基中培养72h，即可使共轭亚油酸的转化率高达89.9％，且可使共轭亚油酸中cis9,trans11-CLA的含量高达100％。

(2)植物乳杆菌是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，因此，本发明植物乳杆菌工程菌所产得的共轭亚油酸对人体而言，安全性更高。

(3)植物乳杆菌属于兼性好氧菌，相较严格厌氧菌更易培养，适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1：重组质粒pNZ44-bbi以及pNZ44-bbi(U)的PCR验证结果。

图2：植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarum ST-III/pNZ44-bbi(U)所产共轭亚油酸的GC-MS鉴定色谱图。

图3：植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarum ST-III/pNZ44-bbi(U)所产共轭亚油酸的GC-MS质谱碎片图。

具体实施方式

下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自通用生物技术有限公司；下述实施例中涉及的pNZ44质粒的构建方法记载于文献“McGrath,S.et al.,2001.Improvement and optimization of two engineered phage resistancemechanisms in Lactobacoccus lactic.Applied and Environmental Microbiology,67(2):608-616.”中；下述实施例中涉及的细菌基因组DNA 提取试剂盒以及质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，型号分别为DP302、 DP103。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 0.05g/L、吐温801mL/L、琼脂15g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。

MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 0.05g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，使用前添加100μg/mL 的卡那霉素。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

亚油酸异构酶比酶活的检测方法：收集菌体，将菌体加入KPB缓冲液(pH 6.5)中，并将菌体用玻璃珠破碎，得到细胞破碎液；将细胞破碎液于8000g离心10min收集上清，得到粗酶液；调整粗酶液中蛋白含量为0.5mg/mL，并将调整后的粗酶液分装至6个反应玻璃瓶中，每个玻璃瓶1mL；分别在玻璃瓶中加入终浓度为0.1mg/mL亚油酸，于37℃反应60min，得到反应液；反应结束后，迅速在反应液中加入异丙醇以及正己烷，对脂肪酸进行萃取，测定脂肪酸的含量变化(脂肪酸含量变化的检测方法参考下述共轭亚油酸转化率、共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体类型以及共轭亚油酸中各共轭亚油酸异构体占比的检测方法)，从而计算比酶活；比酶活(U/mg)＝W/(T×M)，其中，W为反应生成的共轭亚油酸的质量(μg)， T为反应时间(min)，M为待测样品质量(mg)

其中，亚油酸异构酶比酶活的定义为：于37℃、pH 6.5的条件下，1min内转化生成1mg 共轭亚油酸所需的酶量，单位为U/mg。

共轭亚油酸转化率、共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体类型以及共轭亚油酸中各共轭亚油酸异构体占比的检测方法：按照3mL发酵液+2mL异丙醇+3mL正己烷的比例，在发酵液中加入异丙醇和正己烷，得到混合液；将混合液涡旋振荡30s；静置分层；移取上层的正己烷层至干净的螺旋玻璃瓶内，氮吹至干；接着加入400μL的甲醇，涡旋30s；每个玻璃瓶中加入80μL的重氮甲烷，进行甲酯化，此时溶液为黄绿色，反应15min，如果颜色不褪色，代表甲酯化比较充分；充分甲酯化后的液体经过氮吹至干，分别加入800μL的正己烷进行回溶，离心后，将上清液转移至色谱进样瓶中，暂存至GC-MS检测；

其中，共轭亚油酸转化率＝(共轭亚油酸的质量/对照组中亚油酸的质量)×100％。

实施例1：编码亚油酸异构酶的基因的筛选

具体步骤如下：

通过PacBio测序平台采集短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828(记载于公开号为CN105925514A的专利申请文本中)在亚油酸胁迫下的转录组学数据，采样时间点分别为3h，8h，15h。经过生信分析发现，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828中三个时间点处基因转录水平均增大的基因共8个，根据转化水平变化大小将这8个基因分别注释为编码“未知蛋白1”、“蜜二糖载体蛋白”、“核糖激酶”、亚油酸水合酶、“未知蛋白2”、“转录调控蛋白”、“核糖结合ABC通道蛋白1”以及“核糖结合ABC通道蛋白2”的基因，其中，编码“未知蛋白1”的基因在8h时的转录水平较3 h上升68倍，15h和8h时的转录水平较3h上调了3.5倍和8.2.倍，并且，其未与其他基因形成基因簇，因此，推测该基因参与CLA转化的可能性比较大(“未知蛋白1”的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、编码“未知蛋白1”的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)。

实施例2：编码亚油酸异构酶的基因的克隆

具体步骤如下：

从保菌管中挑取短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828的菌液划线于MRS 固体培养基上，于37℃恒温厌氧工作站中培养48h，获得单菌落；挑取单菌落接种于MRS 液体培养基中，于37℃恒温厌氧工作站中继续静置培养24h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃恒温厌氧工作站中培养24h，获得菌悬液；将获得的菌悬液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取湿菌体中的基因组DNA，并通过PCR反应扩增bbi；PCR反应结束，得到扩增产物，对扩增产物进行纯化后通过1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物条带大小，获得bbi(此bbi基因即为编码“未知蛋白1”的基因)；其中，扩增bbi所用引物见表1；

PCR反应体系包含：KOD 1μL、ddH2O 29μL、上下游引物各1μL、基因组DNA 1μL、dNTP 5μL、10×reaction buffer 5μL以及Mg²⁺3μL；

PCR反应条件为：95℃，5min；(95℃，30s；55℃，30s；68℃，1min)循环30次；68℃，5min；12℃，5min。

表1引物序列

实施例3：编码亚油酸异构酶的基因的优化

具体步骤如下：

在不影响表达蛋白的前体下，减少实施例2获得的bbi中GC的含量，并且，使得对应的密码子更适合于乳杆菌的生物利用，密码子的优化以及基因序列的合成由通用生物系统(安徽)有限公司完成，序列两端的酶切位点分别为Kpn I以及Xba I，序列连接在pU57质粒中，质粒保存在大肠杆菌E.coli DH5α中，得到重组大肠杆菌E.coli DH5α/pU57-bbi(U)；其中，未经优化的bbi序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，经优化的bbi序列的核苷酸序列如 SEQ ID No.5所示。

实施例4：亚油酸异构酶在植物乳杆菌中的表达

具体步骤如下：

将pNZ44质粒导入大肠杆菌E.coli DH5α中，获得大肠杆菌E.coli DH5α/pNZ44；将大肠杆菌E.coli DH5α/pNZ44划线于LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落接种于LB液体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素) 中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量接种至LB液体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)中，于37℃、200rpm的摇床中培养14h，获得菌悬液；将获得的菌悬液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；使用质粒小提试剂盒提取湿菌体中的pNZ44质粒；将获得的pNZ44质粒用50μL的ddH₂O回溶，于-20℃下储存。

使用质粒小提试剂盒提取实施例3获得的重组大肠杆菌E.coli DH5α/pU57-bbi(U)中的重组质粒pU57-bbi(U)；将获得的重组质粒pU57-bbi(U)用50μL的ddH₂O回溶，于-20℃下储存。

使用限制性内切酶Kpn I以及Xba I对获得的pNZ44质粒、实施例2获得的bbi基因以及重组质粒pU57-bbi(U)进行酶切，然后利用T₄连接酶将经酶切、纯化后的DNA进行连接，获得连接产物，具体连接体系如表2。

将获得的连接产物于16℃下过夜连接15h后，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的氯霉素)， 37℃倒置培养24h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pNZ44-bbi以及重组质粒pNZ44-bbi(U)，验证结果见图1。

将获得的重组质粒pNZ44-bbi以及重组质粒pNZ44-bbi(U)分别导入植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ST-III中，获得植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarumST-III/pNZ44-bbi以及植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarum ST-III/pNZ44-bbi(U)。

将获得的植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarum ST-III/pNZ44-bbi以及植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarum ST-III/pNZ44-bbi(U)分别划线于MRS固体培养基上，于37℃恒温培养箱中培养18h，获得单菌落；挑取单菌落分别接种于MRS液体培养基中，于37℃、 200rpm的摇床中培养14h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v) 的接种量分别接种至LB液体培养基中，于温度为37℃的条件下静置培养12h，获得发酵液；将发酵液于4℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；将湿菌体进行破碎后于4℃、 12000g的条件下离心10min，获得细胞破碎上清液；检测获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶酶活，检测结果如下：

植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarum ST-III/pNZ44-bbi发酵获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶酶活为2.5U/mg、植物乳杆菌工程菌Lactobacillusplantarum ST-III/pNZ44-bbi(U)发酵获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶酶活为10.5U/mg。可见，植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarum ST-III/pNZ44-bbi以及植物乳杆菌工程菌 Lactobacillusplantarum ST-III/pNZ44-bbi(U)可成功表达亚油酸异构酶，但植物乳杆菌工程菌Lactobacillusplantarum ST-III/pNZ44-bbi(U)的表达能力更强。

表2连接体系

实施例5：共轭亚油酸的制备

具体步骤如下：

将实施例4获得的植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarum ST-III/pNZ44-bbi以及植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarum ST-III/pNZ44-bbi(U)的活化好的菌液按1％(v/v)的接种量分别接种至含有0.5mg/mL游离亚油酸的MRS液体培养基中，于温度为37℃的条件下静置培养72h，得到发酵液；检测发酵液中共轭亚油酸的转化率，并且，检测所得共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体的类型及各共轭亚油酸异构体占比，检测结果见图2-3。

由检测结果可知，植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarum ST-III/pNZ44-bbi发酵得到的发酵液中并无共轭亚油酸；植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarumST-III/pNZ44-bbi(U) 发酵得到的发酵液中共轭亚油酸的转化率可达89.9％。

如图2-3可知，植物乳杆菌工程菌Lactobacillus plantarum ST-III/pNZ44-bbi(U)发酵得到的共轭亚油酸100％为cis9,trans11-CLA。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种可高产共轭亚油酸的植物乳杆菌工程菌

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）

<400> 1

Met Leu Phe Gln Val Tyr Gly Asp Asn Ala Ile Tyr Gln Trp Ile Gly

1 5 10 15

Trp Ile Leu Val Phe Cys Cys Leu Ile Gly Ala Asn Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Arg Thr Lys Thr Gly Gly Ile Val Ala Phe Leu Val Val Pro Ala Val

35 40 45

Leu Thr Val Tyr Phe Ile Thr Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Met Gly Ala

50 55 60

Asp Trp Ala Leu Asn Asn Pro Thr Tyr Val His Met Thr Ser Trp Phe

65 70 75 80

His Tyr Ala Lys Leu Tyr Ala Ala Thr Ile Gly Cys Ile Gly Phe Met

85 90 95

Ala Leu Lys Tyr Lys Trp Gly Ser Ile Gly Lys Ser His Trp Phe Lys

100 105 110

Cys Phe Pro Phe Val Ile Val Ala Ile Asn Ile Leu Ile Ala Val Val

115 120 125

Ser Asp Phe Glu Ser Ala Ile Arg Gly Trp Gly Thr Thr Trp Ile Ser

130 135 140

Thr Glu Gly Val Thr Leu Tyr Gly Gly Trp His Asn Val Phe Asn Gly

145 150 155 160

Leu Ala Gly Ile Leu Asn Ile Phe Cys Met Thr Gly Trp Phe Gly Ile

165 170 175

Tyr Ala Ser Lys Lys Lys Asp Asp Met Leu Trp Pro Asp Met Thr Trp

180 185 190

Val Phe Ile Val Ala Tyr Asp Leu Trp Asn Phe Cys Tyr Thr Tyr Asn

195 200 205

Cys Leu Pro Thr His Ser Trp Tyr Cys Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala

210 215 220

Pro Thr Val Ala Asn Phe Phe Trp Asn Lys Gly Gly Trp Ile Gln Asn

225 230 235 240

Arg Ala Asn Thr Leu Ala Ile Trp Cys Met Phe Ala Gln Val Phe Pro

245 250 255

Met Phe Gln Asp Tyr Ser Val Phe Ser Thr Gln Ser Val Asn Asn Pro

260 265 270

Asn Val Asn Leu Ala Val Ser Leu Ile Ala Leu Val Ala Asn Val Leu

275 280 285

Ala Leu Gly Tyr Ile Leu Leu Arg Ala Lys Lys Gln Gly Ile Asn Pro

290 295 300

Trp Thr Lys Glu Val Phe Lys Gly Thr Lys Asp Tyr Glu Gln Ala Ile

305 310 315 320

Ala Arg Ala Asp Ala Ser Glu Leu Val Ala

325 330

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）

<400> 2

atgctgtttc aggtctacgg cgacaacgcc atctaccaat ggattggctg gatactcgtc 60

ttctgctgcc ttatcggcgc caatgaactg gctcgtcgca ccaaaaccgg cggcatcgtc 120

gccttcctcg tcgtcccggc tgtgctgacc gtctacttca tcaccatcta caccgccgcc 180

gcaatgggcg ccgactgggc actcaacaac ccgacctacg tgcacatgac cagctggttc 240

cactacgcca agctctacgc ggccaccatc ggctgcatcg gctttatggc cctcaaatac 300

aagtggggct ctatcggcaa atcccactgg ttcaagtgct tcccgttcgt gatcgtggcc 360

atcaacatcc tcatcgccgt ggtctctgac ttcgaatccg ccatccgcgg ctggggcacc 420

acctggatct ccactgaagg cgtgaccctc tacggtggct ggcacaacgt gttcaacggc 480

ttggccggca tcctcaatat cttctgcatg accggctggt tcggcatcta cgcctccaag 540

aagaaggacg acatgctctg gccggacatg acctgggtgt tcatcgtggc ctacgatctg 600

tggaacttct gctacaccta caattgcctg cccacccact cctggtactg cggccttgca 660

ctgctgctgg cgcccaccgt ggccaacttc ttctggaaca agggcggctg gatccagaat 720

cgcgccaata cattggccat ctggtgcatg ttcgcgcagg tattcccgat gttccaggac 780

tactccgtgt tctccaccca gtccgtgaac aacccgaacg tgaaccttgc ggtgtcccta 840

atcgcgctag tggccaacgt gttggcactc ggctacatcc tgctgcgcgc caagaagcag 900

ggcatcaacc cgtggaccaa ggaagtcttc aagggcacca aagactacga gcaggccatc 960

gctcgcgccg atgcatcgga gttggtggcg tag 993

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagcctatgc tgtttcaggt ctacggcga 29

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catatgctac gccaccaact ccgat 25

<210> 5

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgctttttc aagtctatgg tgacaatgct atatatcaat ggattggatg gattttagtc 60

ttttgttgtc ttattggagc taatgaactt gcaagaagaa caaaaacagg aggaattgtt 120

gcatttttag ttgttccagc tgttttaact gtttatttta ttaccatata taccgccgca 180

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cattatgcta aattatatgc cgcaacaatt ggatgtattg gttttatggc tttaaaatat 300

aaatggggaa gcattggaaa atcacattgg tttaaatgtt ttccatttgt cattgtcgct 360

attaatattc ttattgctgt cgtttctgat tttgaatctg caattcgtgg ttggggaaca 420

acttggattt caactgaagg agttacatta tatggtggtt ggcataatgt ttttaatgga 480

ttagctggaa ttttgaatat tttctgtatg actggatggt ttggaatata tgcatcaaaa 540

aagaaagatg atatgctttg gcctgatatg acatgggttt ttattgttgc atatgatctt 600

tggaattttt gttataccta taattgtctt ccaacccatt cttggtattg tggtttagct 660

ttattacttg ctcctacagt tgctaatttc ttttggaata agggtggatg gattcaaaat 720

agagcaaata ctttagctat ttggtgtatg tttgctcaag tttttcctat gtttcaagat 780

tatagcgttt ttagtaccca atcagttaat aatcctaatg ttaatcttgc cgtttcatta 840

attgctttag ttgctaatgt ccttgcatta ggatatattt tacttagagc aaaaaagcaa 900

ggtattaatc catggacaaa agaagttttt aaaggtacaa aagattatga acaagccatt 960

gctcgtgctg atgcttcaga attagttgca taa 993

Claims

1.植物乳杆菌工程菌在生产共轭亚油酸方面的应用；所述植物乳杆菌工程菌以植物乳杆菌为表达宿主，表达氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亚油酸异构酶；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ST-III。

2.一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述方法为植物乳杆菌工程菌接种至含有亚油酸的培养基中，于温度为35~40℃的条件下静置培养，得到富含共轭亚油酸的培养液；将富含共轭亚油酸的培养液进行提取，得到共轭亚油酸；所述植物乳杆菌工程菌以植物乳杆菌为表达宿主，表达氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亚油酸异构酶；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）ST-III。

3.如权利要求2所述的一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述共轭亚油酸为cis9, trans11-CLA。