CN113061542B

CN113061542B - 一种可产共轭亚油酸的毕赤酵母工程菌及其应用

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Publication number: CN113061542B
Application number: CN202010206203.1A
Authority: CN
Inventors: 陈海琴; 杨波; 赵建新; 李秀清; 高鹤; 张灏; 陈卫
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-03-23
Filing date: 2020-03-23
Publication date: 2023-06-16
Anticipated expiration: 2040-03-23
Also published as: CN113061542A

Abstract

本发明公开了一种可产共轭亚油酸的毕赤酵母工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明的毕赤酵母工程菌可用于生产共轭亚油酸，将本发明的毕赤酵母工程菌发酵获得的含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液添加至含0.9g/L游离亚油酸的反应体系中进行反应，仅反应3h，即可使反应液中共轭亚油酸的产量高达0.855g/L、转化率高达95％，并且，反应中的共轭亚油酸全部为cis9,trans11‑CLA，无其他共轭亚油酸异构体。

Description

一种可产共轭亚油酸的毕赤酵母工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种可产共轭亚油酸的毕赤酵母工程菌及其应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是一组含有共轭双键的十八碳二烯酸的总称，是亚油酸(Linoleic acid，LA)的立体几何异构体。由于共轭双键位置不同且双键具有顺式及反式两种几何结构，共轭亚油酸的种类十分丰富。

在共轭亚油酸的众多异构体中，cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA被证实具有重要的生理活性，例如，研究表明，cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA均具有抗癌的生理活性，其中，cis9,trans11-CLA的抗癌能力更强(具体可见参考文献：Durgam VR，Fernandes G.The growth inhibitory effect of conjugated linoleic acid on MCF-7cells is related to estrogen response system.Cancer Letters，1997，116(2):121-130[2]Pariza M W.Conjugated linoleic acid,a newly recognized nutrient[J].Chemistry&industry,1997,12:464-4.)，并且，研究表明，cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA均具有调节体脂的作用，其中，trans10,cis12-CLA可显著降低脂肪含量，而cis9,trans11-CLA可显著降低脂肪含量(具体可见参考文献：Rodriguez E，Ribot J，PalouA.Trans-10,cis-12,but not cis-9,trnas-11CLA isomer inhibits brown adipocytethermogenic capacity.American Journal of Physiology，2002，282(6):R1789-R1797.和Bouthegourd J C，Even P C，Gripois D，et al.A CLA mixture prevents bodytriglyceride accumulation without affecting energy expenditure in syrianhamsters.The Journal ofNutrition，2002，132(9):2682-2689.)，因此，CLA已成为食品、药品、化妆品等行业的研究热点，在食品、药品、化妆品等领域拥有极大的应用前景，而为了更好地研究和利用CLA，合成高纯度的CLA单体，尤其是高纯度的cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA单体势在必行。

CLA在自然界中含量较少，主要存在于反刍动物牛、羊等的肉和奶及其制品中，非反刍动物及其它食品中含量较少。为了获得大量的CLA，人工合成法是最有效的途径。目前，关于CLA的合成方法很多，主要有生物合成和化学合成两种方法。

其中，化学合成法主要是通过碱异构化、过渡金属催化相应的底物获得CLA，但是，利用化学合成法获得CLA的过程会产生很多有毒性的副产物，这些副产物对环境以及人体均具有毒害作用，并且，利用化学合成法制备得到的共轭亚油酸异构体种类多，很难进行有效的分离(具体可见参考文献：Philippaerts,A.,VanAelst,J.,Sels,B.,2013.Conjugatedlinoleic acids and conjugated vegetable oils:from nutraceutical to bio-polymer.Eur.J.Lipid Sci.Technol.115,717–720.和Nicod,N.,Parker,R.S.,Giordano,E.,Maestro,V.,Davalos,A.,Visioli,F.,2015.Isomerspecificeffects of conjugatedlinoleic acid on HDL functionality associated with reverse cholesteroltransport.J.Nutr.Biochem.26,165-172.)，因此，化学合成法无法真正实现高纯度CLA单体，尤其是高纯度cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA单体的大规模工业化生产。

生物合成法则主要是通过采用特定的酶或微生物催化相应的底物获得CLA，其具有污染少，合成的CLA异构体种类较为单一的优势，但是，该方法也存在明显的缺陷，例如，利用微生物催化相应的底物获得CLA时所涉及的菌株多为双歧杆菌等严格厌氧菌，严格厌氧菌在工业或实验室中不易培养且产量较低，难以广泛应用到食品、药品、化妆品中；利用酶催化相应的底物获得CLA时需同时使用多种酶，多酶催化中间产物多、途径复杂，不适合CLA的工业化生产。

另外，虽然利用生物合成法生产得到的CLA异构体种类较为单一，但是，其距离获得高纯度的CLA单体，尤其是高纯度的cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA单体仍有一定的距离。

上述缺陷使得现有的生物合成法无法真正实现高纯度CLA单体，尤其是高纯度cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA单体的大规模工业化生产，因此，急需找到一种产量高的生产高纯度CLA单体，尤其是高纯度cis9,trans11-CLA和trans10,cis12-CLA单体的方法以克服现有生物合成法存在的缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种产量高的生产共轭亚油酸单体，尤其是cis9,trans11-CLA单体的方法。

[技术方案]

为解决上述问题，本发明提供了一种毕赤酵母工程菌，所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母为宿主表达编码亚油酸异构酶的基因；所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母PichiaPink^TM Strain 2。

在本发明的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述毕赤酵母工程菌以PichiapPink-HC-3CZHEK质粒为表达载体；所述PichiapPink-HC-3CZHEK质粒是通过将去除α-factor后的pPinkα-HC质粒与3CZHEK基因相连获得的。

在本发明的一种实施方式中，所述3CZHEK基因的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。

本发明还提供了一种生产共轭亚油酸的方法，所述方法为先将上述毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；将菌体破碎，收集含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液；将含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液添加至含亚油酸的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到共轭亚油酸；

或者，所述方法为先将上述毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；将菌体破碎，收集含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液；将含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液进行分离，得到亚油酸异构酶；将亚油酸异构酶添加至含亚油酸的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到共轭亚油酸；

或者，所述方法为先将上述毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；用缓冲液重悬菌体，得到反应体系；将亚油酸添加至反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到共轭亚油酸；

或者，所述方法为先将上述毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；将菌体添加至含亚油酸的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到共轭亚油酸。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为25～35℃、转速为150～250rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的温度为28℃、转速为200rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为30～45℃、转速为150～250rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为37℃、转速为200rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有诱导剂。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂为甲醇。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基中，甲醇的浓度为15～25mL/L。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基中，甲醇的浓度为20mL/L。

在本发明的一种实施方式中，所述亚油酸为游离亚油酸。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，亚油酸的浓度为0.5～1.5g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，亚油酸的浓度为0.9g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液或亚油酸异构酶的添加量为25～35U/L。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，毕赤酵母工程菌菌体的浓度为40～60mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中，毕赤酵母工程菌菌体的浓度为50mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述共轭亚油酸为cis9,trans11-CLA。

本发明还提供了上述毕赤酵母工程菌或上述方法在生产共轭亚油酸方面的应用。

本发明还提供了一种生产亚油酸异构酶的方法，所述方法为先将上述毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；将菌体破碎，收集细胞破碎上清液；将细胞破碎上清液进行分离，得到氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的亚油酸异构酶。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基含有诱导剂。

在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂为甲醇。

本发明还提供了上述毕赤酵母工程菌或上述方法在生产亚油酸异构酶方面的应用。

[有益效果]

(1)本发明的毕赤酵母工程菌可用于生产共轭亚油酸，将本发明的毕赤酵母工程菌发酵获得的含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液添加至含0.9g/L游离亚油酸的反应体系中进行反应，仅反应3h，即可使反应液中共轭亚油酸的产量高达0.855g/L、转化率高达95％，并且，反应中的共轭亚油酸全部为cis9,trans11-CLA，无其他共轭亚油酸异构体；将本发明的毕赤酵母工程菌直接添加至含1.5g/L游离亚油酸的反应体系中进行反应，仅反应1h，即可使反应液中共轭亚油酸的产量高达1.41g/L、转化率高达94％，并且，反应中的共轭亚油酸全部为cis9,trans11-CLA，无其他共轭亚油酸异构体。

(2)本发明的毕赤酵母工程菌可用于生产亚油酸异构酶，将本发明的毕赤酵母工程菌接种至含有20mL/L甲醇的培养基中诱导培养24h，即可使细胞破碎上清液中亚油酸异构酶的比酶活高达19.5U/mg。

(3)毕赤酵母属于严格好氧菌，相较严格厌氧菌更易实现工业化培养，并且，以毕赤酵母作为生产菌株的工业化生产工艺已十分成熟，因此，本发明的毕赤酵母工程菌更适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1：bbi基因的PCR扩增结果。

图2：重组质粒pINA 1312sp-obbi的质粒图谱。

图3：重组质粒pINA 1312sp-obbi的PCR验证结果。

图4：重组质粒pPink-HC-obbi-His的质粒图谱。

图5：重组质粒pPink-HC-obbi-His以及毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His的PCR验证结果；其中，M：Marker；1：重组质粒pPink-HC-obbi-His；2：毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His。

图6：16个阳性转化子的Dot Blot检测结果。

图7：5个阳性转化子的Western Blot检测结果；其中，M：Marker；1：毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-3CZHEK；2：毕赤酵母PichiaPink^TM Strain 2；3～7：转化子。

图8：不同诱导时间下毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His发酵获得的细胞破碎上清液的Western Blot检测结果。

图9：不同诱导时间下毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His发酵获得的细胞破碎上清液生产共轭亚油酸的转化率。

图10：不同诱导剂浓度下毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His发酵获得的细胞破碎上清液的Western Blot检测结果。

图11：不同诱导剂浓度下毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His发酵获得的细胞破碎上清液生产共轭亚油酸的转化率。

具体实施方式

下述实施例中涉及的游离亚油酸母液(浓度30mg/mL)购自Sigma公司；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自通用生物有限公司；下述实施例中涉及的pINA1312质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的pINA1312sp质粒的构建方法记载于文献“Zhang B，Chen H，Li M，Gu Z，SongY，Ratledge C，ChenYQ，Zhang H，Chen W(2013)Genetic engineering of Yarrowia lipolytica forenhanced production of trans-10，cis-12conjugated linoleic acid.Microb CellFact.12：70”中；下述实施例中涉及的毕赤酵母PichiaPink^TM Strain 2和pPinkα-HC质粒购自Invotrogen公司；下述实施例中涉及的基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，型号为DP302。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 0.05g/L、吐温801mL/L、琼脂15g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。

MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 0.05g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。

YNBD液体培养基：酵母含氮碱基(不含氨基酸)6.7g/L、葡萄糖20g/L，pH为5.5。

YPD液体培养基：蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L，pH为6.5。

YPD固体培养基：蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L，pH为6.5。

BMGY培养基：将酵母粉10g/L、鱼粉蛋白胨20g/L和700mL/L去离子水混合后，121℃灭菌20min，冷却后加入100mL/L浓度为1M的磷酸钾缓冲液(pH 6.0)、100mL/L 10×YNB、2mL/L 500×生物素和100mL/L 10×甘油，4℃保存。

BMMY培养基：将酵母粉10g/L、鱼粉蛋白胨20g/L和700mL/L去离子水混合后，121℃灭菌20min，冷却后加入100mL/L浓度为1M的磷酸钾缓冲液(pH 6.0)、100mL/L 10×YNB、2mL/L 500×生物素和100mL/L 10×甲醇，4℃保存。

YPDS培养基：蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L、1mol/L山梨醇，pH为6.5。

PAD选择培养基：无氨基酸酵母氮源(YNB)13.4g/L、补充氨基酸混合物-不含腺嘌呤(CSM-ADE)1.25g/L、生物素5mg/L、葡萄糖20g/L、琼脂糖3g/L。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

亚油酸异构酶比酶活的检测方法：收集菌体，将菌体加入KPB缓冲液(pH 6.5)中，并将菌体用玻璃珠破碎，得到细胞破碎液；将细胞破碎液于8000g离心10min收集上清，得到细胞破碎上清液；调整细胞破碎上清液中蛋白含量为0.5mg/mL(蛋白浓度通过Bradford法测定，Bradford法记载于参考文献“Bradford,M.M.1976.A rapid and sensitive methodfor the quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing theprinciple ofprotein-dyebinding.Anal.Biochem.72:248–254.”中)，并将调整后的细胞破碎上清液分装至6个反应玻璃瓶中，每个玻璃瓶1mL；分别在玻璃瓶中加入终浓度为0.1mg/mL亚油酸，于37℃反应60min，得到反应液；反应结束后，迅速在反应液中加入异丙醇以及正己烷，对脂肪酸进行萃取，测定脂肪酸的含量变化(脂肪酸含量变化的检测方法参考下述共轭亚油酸产量和共轭亚油酸转化率的检测方法)，从而计算比酶活；比酶活(U/mg)＝W/(T×M)；其中，W为反应生成的共轭亚油酸的质量(μg)，T为反应时间(min)，M为待测样品质量(mg)；

其中，亚油酸异构酶比酶活的定义为：于37℃、pH 6.5的条件下，1min内转化生成1mg共轭亚油酸所需的酶量，单位为U/mg。

共轭亚油酸产量和共轭亚油酸转化率的检测方法：采用重氮甲烷法甲酯化脂肪酸，在反应液中加入1mL异丙醇和2mL正己烷，充分混匀后，吸取上层正己烷层进行氮吹，向氮气吹干的提脂瓶中加入400μL甲醇和40μL三甲基硅烷化重氮甲烷，溶液黄色维持15min不变，则甲酯化完成，若黄色褪去，则再添加20μL三甲基硅烷化重氮甲烷，直至黄色维持15min不褪去，将甲酯化结束的样品进行氮吹，向氮气吹干的提脂瓶中加入1mL正己烷回溶，转入气相瓶，进行气相色谱分析；其中，脂肪酸提取方法参考文献“Volkov A,Liavonchanka A,Kamneva O,et al.Myosin cross-reactive antigen of Streptococcus pyogenes M49encodes a fatty acid double bond hydratase that plays a role in oleic aciddetoxification and bacterial virulence.Joural ofBiological Chemistry,2010,285(14):10353-10361.”；

其中，共轭亚油酸产量＝(共轭亚油酸峰面积/内标峰面积)×0.1mL×2.0mg/mL；

共轭亚油酸转化率＝(共轭亚油酸的质量/对照组中亚油酸的质量)×100％。

实施例1：编码亚油酸异构酶的基因的筛选

通过PacBio测序平台采集短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828(记载于公开号为CN105925514A的专利申请文本中)在亚油酸胁迫下的转录组学数据，采样时间点分别为3h，8h，15h。经过生信分析发现，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828中三个时间点处基因转录水平均增大的基因共8个，根据转化水平变化大小将这8个基因分别注释为编码“未知蛋白1”、“蜜二糖载体蛋白”、“核糖激酶”、亚油酸水合酶、“未知蛋白2”、“转录调控蛋白”、“核糖结合ABC通道蛋白1”以及“核糖结合ABC通道蛋白2”的基因，其中，编码“未知蛋白1”的基因在8h时的转录水平较3h上升68倍，15h和8h时的转录水平较3h上调了3.5倍和8.2.倍，并且，其未与其他基因形成基因簇，因此，推测该基因参与CLA转化的可能性比较大(“未知蛋白1”的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、编码“未知蛋白1”的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，测序工作由北京六合华大基因科技有限公司完成)。

实施例2：编码亚油酸异构酶的基因的克隆

从保菌管中挑取短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828的菌液划线于MRS固体培养基上，于37℃恒温厌氧工作站中培养48h，获得单菌落；挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，于37℃恒温厌氧工作站中继续静置培养24h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃恒温厌氧工作站中培养24h，获得菌悬液；将获得的菌悬液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；使用基因组DNA提取试剂盒提取湿菌体中的基因组DNA，以bbi-F和bbi-R为引物，通过PCR反应进行扩增；PCR反应结束，得到扩增产物，对扩增产物进行纯化后通过1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物条带大小(PCR扩增结果见图1)，获得bbi(此bbi基因即为编码“未知蛋白1”的基因)；其中，扩增bbi所用引物见表1；

PCR反应体系包含：基因组DNA 500ng、MgSO₄2μL、dNTP 5μL、10×KOD buffer 5μL、KOD plus 1μL、上下游引物各1.5μL、ddH₂O补足50μL；

PCR反应条件为：95℃，5min；(95℃，30s；55℃，30s；68℃，1min)循环30次；68℃，5min；12℃，5min。

表1引物序列

实施例3：编码亚油酸异构酶的基因的优化

根据酵母的密码子偏好性，利用Genscript OptimumGene TM软件对bbi基因进行优化，优化后的基因命名为obbi基因，obbi基因由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，并克隆至载体pUC57上，得到重组质粒pUC57-obbi；其中，bbi基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，obbi基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

实施例4：毕赤酵母工程菌的构建及筛选

1、构建

使用限制性内切酶BamHI和KpnI对pINA 1312sp质粒以及实施例2获得的重组质粒pUC57-obbi进行酶切，然后利用T₄连接酶将经酶切、纯化后的DNA进行连接，获得连接产物；将获得的连接产物于16℃下过夜连接15h后，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)，37℃倒置培养12～16h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pINA 1312sp-obbi，重组质粒pINA 1312sp-obbi的质粒图谱见图2，验证结果见图3。

合成核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的3CZHEK基因(合成工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)；以3CZHEK-F1和3CZHEK-R1为引物，通过PCR扩增在3CZHEK基因两侧引入核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的同源片段，得到目的基因；使用限制性内切酶Stu I和Swa I对目的基因和pPinkα-HC质粒进行酶切，然后利用T₄连接酶将经酶切、纯化后的酶切产物进行连接，获得连接产物1；将获得的连接产物1于16℃下过夜连接15h后，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL氨苄青霉素)，37℃倒置培养12～16h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pPink-HC-3CZHEK；在3CZHEK基因两侧引入同源片段所用引物见表2；

以F2、R2为引物，以重组质粒pINA 1312sp-obbi为模板进行PCR扩增，通过PCR反应在obbi基因两侧引入酶切位点Nco I和Stu I，得到目的基因；使用限制性内切酶Nco I和Stu I对重组质粒pPink-HC-3CZHEK和目的基因进行酶切，然后利用T₄连接酶将经酶切、纯化后的酶切产物进行连接，获得连接产物2；将获得的连接产物2于16℃下过夜连接15h后，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL氨苄青霉素)，37℃倒置培养12～16h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pPink-HC-obbi-His，重组质粒pPink-HC-obbi-His的质粒图谱见图4，验证结果见图5。

表2引物序列

从-80℃的冰箱中取出保存有毕赤酵母PichiaPink^TM Strain 2的甘油管；蘸取毕赤酵母PichiaPink^TM Strain 2菌液划线于YPD固体培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养至长出单菌落；挑取单菌落接种至有20mLYPD液体培养基中，置于28℃、200rpm的摇床中振荡培养1d，得到培养液；将培养液按1％(v/v)的接种量接种至有50mLYPD液体培养基中，置于28℃、200rpm摇床中振荡至OD₆₀₀＝1.3～1.5，得到活化液；将50mL离心管经灭菌后进行预冷；将活化液转移至已灭菌的预冷后的50mL离心管中，4℃、1500g离心5min，收集细胞，用50mL温度为4℃的灭菌水重悬菌体，得到重悬液1；将重悬液1转移至已灭菌的预冷后的50mL离心管中，4℃、1500g离心5min，收集细胞，用30mL温度为4℃的灭菌水重悬菌体，得到重悬液2；将重悬液2转移至已灭菌的预冷后的50mL离心管中，4℃、1500g离心5min，收集细胞，用5mL温度为4℃的1M山梨醇溶液重悬菌体，得到重悬液3；将重悬液3转移至已灭菌的预冷后的50mL离心管中，4℃、1500g离心5min，收集细胞，用2mL温度为4℃的1M山梨醇溶液重悬菌体，得到重悬液4；将重悬液4转移至已灭菌的预冷后的50mL离心管中，4℃、1500g离心5min，收集细胞，用100μL温度为4℃的1M山梨醇溶液重悬菌体至终体积约为150μL，得到毕赤酵母感受态细胞；将毕赤酵母感受态细胞保存在冰水混合物中，当天使用。

使用限制性内切酶EcoN I对重组质粒pPink-HC-obbi-His进行酶切，得到线性化的重组质粒pPink-HC-obbi-His；将5～20μg线性化的重组质粒pPink-HC-obbi-His与80μL毕赤酵母感受态细胞混匀，转移至0.2cm用冰预冷10min后的电转化杯中，冰浴5min；将电击杯插入Eppendorf电击仪中，以2500V电压进行电击，电击时间约5ms；电击完毕后，在电击杯中加入1mL用冰预冷10min后YPDS培养基混匀，转移至1.5mL的EP管中，于28℃静置培养2h，得到转化液；取100～300μL转化液涂布到PAD选择培养基上，28℃培养至白色转化子生成；挑取白色转化子至YPD固体培养基平板上，于28℃恒温培养箱中培养至长出单菌落；挑取单菌落接种于10mLYPD液体培养基中，在28℃、200rpm的摇床中振荡培养24h，得到菌液；用基因组DNA提取试剂盒提取菌液的基因组DNA，以P1和P2为引物，通过PCR反应进行扩增；PCR反应结束，得到扩增产物，对扩增产物进行纯化后通过1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物条带大小(PCR扩增结果见图5)，验证结果表明扩增得到了大小为1701bp的特异性条带，与理论值一致，获得阳性转化子；其中，扩增obbi所用引物见表3；

PCR反应体系包含：10μLTaq mix，1μL上游引物，1μL下游引物，1μL模板，去离子水补足20μL；

PCR反应条件为：95℃30s，55℃30s，72℃延伸1000bp/min，30个循环后72℃补充延伸10min。

表3引物序列

2、筛选

以毕赤酵母PichiaPink^TM Strain 2作为空白对照，挑取步骤1获得的16个阳性转化子分别接种至10mL灭菌的BMGY培养基中，在28℃、200rpm摇床内振荡培养24h，得到种子液1～17；将种子液1～17分别按1％(v/v)的接种量接种至200mLBMGY培养基中，在28℃、200rpm摇床内振荡培养24h，得到菌液1～17；将菌液1～17转移至灭菌的50mL离心管中，3000g离心3min，收集沉淀1～17；将沉淀1～17用40mLBMMY培养基充分重悬后，在28℃、200rpm摇床内诱导培养24h，得到发酵液1～17；将发酵液8000g离心3min，收集菌体1～17；将菌体1～17重悬于裂解液后，加入等体积玻璃珠，通过震荡器震荡破碎，得到细胞破碎上清液1～17；向细胞破碎上清液中1～17加入5x Loading buffer后，95℃金属浴10min进行变性，得到样品1～17；将样品1～17按等蛋白量(蛋白浓度使用BCA浓度测定试剂盒检测)点在NC膜上，待膜干后，用5％脱脂乳进行封闭，以His抗体作为一抗，鼠二抗与之结合，与化学发光显影液反应后进行显影拍照，获得细胞破碎上清液的Dot Blot检测结果，每份样品设置2组平行对照(检测结果见图6)；挑选蛋白表达量最高(即颜色最深)的5份细胞破碎上清液进行Western Blot实验(检测结果见图7)，得到蛋白表达量最高(即印记最大)的转化子，得到毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His。

检测毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His发酵获得的细胞破碎上清液中亚油酸异构酶的比酶活，检测结果如下：

毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His发酵获得的细胞破碎上清液中亚油酸异构酶的比酶活为19.5U/mg。可见，毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His可产亚油酸异构酶。

实施例5：亚油酸异构酶的制备

1、诱导时间对亚油酸异构酶产量的影响

挑取实施例4获得的毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His的单菌落接种至10mL灭菌的BMGY培养基中，在28℃、200rpm摇床内振荡培养24h，得到种子液；将种子液分别按1％(v/v)的接种量接种至200mL BMGY培养基中，在28℃、200rpm摇床内振荡培养24h，得到菌液；将菌液转移至灭菌的50mL离心管中，3000g离心3min，收集沉淀；将沉淀用40mLBMMY培养基充分重悬后，在28℃、200rpm摇床内分别诱导培养0h、3h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，得到发酵液1～9；将发酵液1～98000g离心3min，收集菌体1～9；将菌体1～9重悬于裂解液后，加入等体积玻璃珠，通过震荡器震荡破碎，得到细胞破碎上清液1～9；将细胞破碎上清液1～9进行Western Blot实验(检测结果见图8)；分别取细胞破碎上清液1～9(含粗蛋白1.5mg，蛋白浓度使用BCA浓度测定试剂盒检测)，在细胞破碎上清液1～9中加入15μL游离亚油酸和15μL内标C15:0后，用磷酸钠缓冲液冲至终体积为1mL，得到反应体系；将反应体系于37℃、200rpm震荡反应3h，得到反应液；检测反应液中共轭亚油酸的含量以及游离亚油酸和共轭亚油酸的总含量(检测结果见图9)。

由图8-9可知，最佳诱导时间为24h。

检测诱导时间为24h时发酵获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶酶活，检测结果如下：

诱导时间为24h时发酵获得的细胞破碎上清液中亚油酸异构酶的比酶活为19.5U/mg。

2、诱导剂浓度对亚油酸异构酶产量的影响

挑取实施例4获得的毕赤酵母工程菌Pichiapastoris/pPink-HC-obbi-His的单菌落接种至10mL灭菌的BMGY培养基中，在28℃、200rpm摇床内振荡培养24h，得到种子液；将种子液分别按1％(v/v)的接种量接种至200mL BMGY培养基中，在28℃、200rpm摇床内振荡培养24h，得到菌液；将菌液转移至灭菌的50mL离心管中，3000g离心3min，收集沉淀；将沉淀分别用40mL、含有0mL/L甲醇的BMMY培养基，40mL、含有3mL/L甲醇的BMMY培养基，40mL、含有5mL/L甲醇的BMMY培养基，40mL、含有10mL/L甲醇的BMMY培养基，40mL、含有15mL/L甲醇的BMMY培养基，40mL、含有20mL/L甲醇的BMMY培养基，40mL、含有30mL/L甲醇的BMMY培养基充分重悬后，在28℃、200rpm摇床内分别诱导培养24h，得到发酵液10～16；将发酵液10～168000g离心3min，收集菌体10～16；将菌体10～16重悬于裂解液后，加入等体积玻璃珠，通过震荡器震荡破碎，得到细胞破碎上清液10～16；将细胞破碎上清液10～16进行WesternBlot实验(检测结果见图10)；分别取细胞破碎上清液10～16(含粗蛋白1.5mg，蛋白浓度使用BCA浓度测定试剂盒检测)，在细胞破碎上清液10～16中加入15μg游离亚油酸和15μg内标C15:0后，用磷酸钠缓冲液冲至终体积为1mL，得到反应体系；将反应体系于37℃、200rpm震荡反应3h，得到反应液；检测反应液中共轭亚油酸的含量以及游离亚油酸和共轭亚油酸的总含量(检测结果见图11)。

由图10-11可知，最佳诱导剂浓度为20mL/L。

检测诱导剂浓度为20mL/L时发酵获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶酶活和比酶活，检测结果如下：

诱导剂浓度为20mL/L时发酵获得的细胞破碎上清液中亚油酸异构酶的比酶活为19.5U/mg。

实施例6：共轭亚油酸的制备(酶法)

取实施例5获得的细胞破碎上清液15(含粗蛋白1.5mg，蛋白浓度使用BCA浓度测定试剂盒检测)，在细胞破碎上清液15中加入30μL游离亚油酸母液和15μL内标C15:0后，用磷酸钠缓冲液冲至终体积为1mL，得到反应体系；将反应体系于37℃、200rpm震荡反应3h，获得反应液。

检测反应液中共轭亚油酸的产量以及转化率，检测结果如下：

反应液中共轭亚油酸的产量高达0.855g/L、转化率高达95％，并且，反应中的共轭亚油酸全部为cis9,trans11-CLA，无其他共轭亚油酸异构体。

实施例7：共轭亚油酸的制备(全细胞转化法)

取50mg实施例5获得的毕赤酵母工程菌菌体15，在50mg毕赤酵母工程菌菌体15中加入50μL游离亚油酸母液和15μL内标C15:0后，用磷酸钠缓冲液冲至终体积为1mL，得到反应体系；将反应体系于37℃、200rpm震荡反应1h，获得反应液。

反应液中共轭亚油酸的产量高达1.41g/L、转化率高达94％，并且，反应中的共轭亚油酸全部为cis9,trans11-CLA，无其他共轭亚油酸异构体。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种可产共轭亚油酸的毕赤酵母工程菌及其应用

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）

<400> 1

Met Leu Phe Gln Val Tyr Gly Asp Asn Ala Ile Tyr Gln Trp Ile Gly

1 5 10 15

Trp Ile Leu Val Phe Cys Cys Leu Ile Gly Ala Asn Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Arg Thr Lys Thr Gly Gly Ile Val Ala Phe Leu Val Val Pro Ala Val

35 40 45

Leu Thr Val Tyr Phe Ile Thr Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Met Gly Ala

50 55 60

Asp Trp Ala Leu Asn Asn Pro Thr Tyr Val His Met Thr Ser Trp Phe

65 70 75 80

His Tyr Ala Lys Leu Tyr Ala Ala Thr Ile Gly Cys Ile Gly Phe Met

85 90 95

Ala Leu Lys Tyr Lys Trp Gly Ser Ile Gly Lys Ser His Trp Phe Lys

100 105 110

Cys Phe Pro Phe Val Ile Val Ala Ile Asn Ile Leu Ile Ala Val Val

115 120 125

Ser Asp Phe Glu Ser Ala Ile Arg Gly Trp Gly Thr Thr Trp Ile Ser

130 135 140

Thr Glu Gly Val Thr Leu Tyr Gly Gly Trp His Asn Val Phe Asn Gly

145 150 155 160

Leu Ala Gly Ile Leu Asn Ile Phe Cys Met Thr Gly Trp Phe Gly Ile

165 170 175

Tyr Ala Ser Lys Lys Lys Asp Asp Met Leu Trp Pro Asp Met Thr Trp

180 185 190

Val Phe Ile Val Ala Tyr Asp Leu Trp Asn Phe Cys Tyr Thr Tyr Asn

195 200 205

Cys Leu Pro Thr His Ser Trp Tyr Cys Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala

210 215 220

Pro Thr Val Ala Asn Phe Phe Trp Asn Lys Gly Gly Trp Ile Gln Asn

225 230 235 240

Arg Ala Asn Thr Leu Ala Ile Trp Cys Met Phe Ala Gln Val Phe Pro

245 250 255

Met Phe Gln Asp Tyr Ser Val Phe Ser Thr Gln Ser Val Asn Asn Pro

260 265 270

Asn Val Asn Leu Ala Val Ser Leu Ile Ala Leu Val Ala Asn Val Leu

275 280 285

Ala Leu Gly Tyr Ile Leu Leu Arg Ala Lys Lys Gln Gly Ile Asn Pro

290 295 300

Trp Thr Lys Glu Val Phe Lys Gly Thr Lys Asp Tyr Glu Gln Ala Ile

305 310 315 320

Ala Arg Ala Asp Ala Ser Glu Leu Val Ala

325 330

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）

<400> 2

atgctgtttc aggtctacgg cgacaacgcc atctaccaat ggattggctg gatactcgtc 60

ttctgctgcc ttatcggcgc caatgaactg gctcgtcgca ccaaaaccgg cggcatcgtc 120

gccttcctcg tcgtcccggc tgtgctgacc gtctacttca tcaccatcta caccgccgcc 180

gcaatgggcg ccgactgggc actcaacaac ccgacctacg tgcacatgac cagctggttc 240

cactacgcca agctctacgc ggccaccatc ggctgcatcg gctttatggc cctcaaatac 300

aagtggggct ctatcggcaa atcccactgg ttcaagtgct tcccgttcgt gatcgtggcc 360

atcaacatcc tcatcgccgt ggtctctgac ttcgaatccg ccatccgcgg ctggggcacc 420

acctggatct ccactgaagg cgtgaccctc tacggtggct ggcacaacgt gttcaacggc 480

ttggccggca tcctcaatat cttctgcatg accggctggt tcggcatcta cgcctccaag 540

aagaaggacg acatgctctg gccggacatg acctgggtgt tcatcgtggc ctacgatctg 600

tggaacttct gctacaccta caattgcctg cccacccact cctggtactg cggccttgca 660

ctgctgctgg cgcccaccgt ggccaacttc ttctggaaca agggcggctg gatccagaat 720

cgcgccaata cattggccat ctggtgcatg ttcgcgcagg tattcccgat gttccaggac 780

tactccgtgt tctccaccca gtccgtgaac aacccgaacg tgaaccttgc ggtgtcccta 840

atcgcgctag tggccaacgt gttggcactc ggctacatcc tgctgcgcgc caagaagcag 900

ggcatcaacc cgtggaccaa ggaagtcttc aagggcacca aagactacga gcaggccatc 960

gctcgcgccg atgcatcgga gttggtggcg tag 993

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagcctatgc tgtttcaggt ctacggcga 29

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catatgctac gccaccaact ccgat 25

<210> 5

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggatccatgc tgttccaggt gtacggagac aacgccatct accagtggat tggttggatt 60

ctggtcttct gttgcctgat cggtgctaac gagctggctc gacgaaccaa gaccggcgga 120

attgtggcct tcctggtggt ccccgctgtg ctgaccgtct acttcatcac catctacacc 180

gctgctgcta tgggagctga ctgggctctg aacaacccca cctacgtgca catgacctct 240

tggttccact acgccaagct gtacgctgcc accattggtt gtatcggctt catggctctg 300

aagtacaagt ggggctctat tggcaagtct cactggttca agtgcttccc cttcgtgatc 360

gtcgccatca acattctgat cgctgtggtc tccgacttcg agtctgccat tcgaggctgg 420

ggaaccacct ggatctccac cgagggagtg accctgtacg gtggctggca caacgtcttc 480

aacggcctgg ccggaattct gaacatcttc tgtatgaccg gttggttcgg catctacgct 540

tctaagaaga aggacgacat gctgtggccc gacatgacct gggtgttcat tgtcgcctac 600

gacctgtgga acttctgtta cacctacaac tgcctgccca cccactcctg gtactgtggt 660

ctggctctgc tgctggctcc taccgtggct aacttcttct ggaacaaggg aggttggatt 720

cagaaccgag ccaacaccct ggctatctgg tgcatgttcg cccaggtctt ccccatgttc 780

caggactact ctgtgttctc cacccagtct gtcaacaacc ccaacgtgaa cctggctgtc 840

tctctgattg ctctggtggc taacgtcctg gctctgggct acattctgct gcgagctaag 900

aagcagggaa tcaacccctg gaccaaggaa gtgttcaagg gcaccaagga ctacgagcag 960

gctattgctc gagctgacgc ttctgagctg gtggcttagg gtacc 1005

<210> 6

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ttggaggttt tgtttcaagg tccaaacggt gctccttctg ctgttgataa caagtttaac 60

aaggaacaac aaaatgcttt ctacgagatt ttgcacttgc caaacttgaa tgaagagcaa 120

agaaacgctt tcattcaatc tttgaaggat gatccttctc aatctgctaa cttgttggct 180

gaagctaaga aattgaatga tgctcaagct cctaaggtcg acaacaagtt taacaaggag 240

caacaaaacg ctttctatga gattttgcat ttgcctaact tgaatgagga gcaaagaaac 300

gcttttattc agtcccttaa agacgaccca tcccagtccg ctaacttgtt ggctgaggct 360

aagaaactta acgatgctca agctccaaaa gttgatgcta atcaccaagg tagaggttct 420

catcaccacc atcatcacca tcaccatcac agagatttgt acgatgatga tgataaggtt 480

<210> 7

<211> 85

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcgaaa cgatgtttaa atacaggccc 60

cttttccttt gtcgatatca tgtaa 85

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gacaacttga gaagatcaaa aaacaactaa ttattcga 38

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tttaaataca ggcccctttt cctttgtcga tatcatgtaa 40

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

catgccatgg aatgctgttc caggtgtacg g 31

<210> 11

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

aaaaggccta gccaccagct cagaagcg 28

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gactggttcc aattgacaag c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ggagggcgtg aatgtaagcg t 21

Claims

1.一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述方法为先将毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；将菌体破碎，收集含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液；将含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液添加至含亚油酸的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到共轭亚油酸；

或者，所述方法为先将毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；将菌体破碎，收集含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液；将含亚油酸异构酶的细胞破碎上清液进行分离，得到亚油酸异构酶；将亚油酸异构酶添加至含亚油酸的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到共轭亚油酸；

或者，所述方法为先将毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；用缓冲液重悬菌体，得到反应体系；将亚油酸添加至反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到共轭亚油酸；

或者，所述方法为先将毕赤酵母工程菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；将发酵液离心，收集菌体；将菌体添加至含亚油酸的反应体系中进行反应，得到反应液；将反应液进行分离，得到共轭亚油酸；

所述毕赤酵母工程菌以毕赤酵母PichiaPink^TM Strain 2为宿主表达氨基酸序列如SEQID No.1所示的亚油酸异构酶；

所述毕赤酵母工程菌以pPink-HC-3CZHEK质粒为表达载体；所述pPink-HC-3CZHEK质粒是通过将去除α-factor后的pPinkα-HC质粒与核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的3CZHEK基因相连获得的。

2.如权利要求1所述的一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述发酵的温度为25~35℃、转速为150~250 rpm。

3.如权利要求1或2所述的一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述反应的温度为30~45℃、转速为150~250 rpm。

4.权利要求1~3任一所述的方法在生产共轭亚油酸方面的应用。