CN114507696B

CN114507696B - 一种高粱素的制备方法

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Publication number: CN114507696B
Application number: CN202210250123.5A
Authority: CN
Inventors: 陈小龙; 周家伟; 陆跃乐; 朱林江; 吕旭浩
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2024-03-15
Anticipated expiration: 2042-03-15
Also published as: CN114507696A

Abstract

本发明涉及一种高粱素的制备方法，特别涉及一种利用基因工程改造的酿酒酵母在制备高粱素中的应用。本发明提供的一种高粱素的制备方法，通过对酿酒酵母的代谢途径进行改造以提高合成乙酰辅酶A（Acetyl‑CoA）和丙二酰辅酶A（Malonyl‑CoA）的能力，同时将合成高粱素的相关基因导入酿酒酵母中，获得高产高粱素的重组工程菌，并将工程菌应用于制备高粱素的方法，实现高粱素高效的合成。

Description

一种高粱素的制备方法

技术领域

本发明涉及一种高粱素的制备方法，特别涉及一种利用基因工程改造的酿酒酵母在制备高粱素中的应用。

技术背景

化感作用最开始的定义是指植物通过向环境释放特定的次生物质从而对邻近其它植物生长发育产生的影响。现在，植物化感作用研究事实上已扩展到以植物为中心的一切有机体及环境间通过化学物质为媒介的化学相互作用。1984年Rice在《Allelopathy》第二版中，将化感作用较完整的意义定为：植物或微生物的代谢分泌物对环境中其他植物或微生物有利或不利的作用。这个定义现已被广泛接受。

《利用化感物质开发除草剂的应用前景》（陈业兵等，山东农业大学学报）指出，从植物中提取有效的化感物质直接应用于生产实际是不太现实的，因为化感物质含量少，提取困难，获得的量也非常少，成本太高。研究植物的化感作用，是在提取、分离和鉴定化感物质的基础上，人工模拟合成化感物质作用较强物质或对一些化感物质进行结构修饰，这将有可能开发出新型除草剂。而在从植物中获得具有开发成除草剂潜力的化感物质，在用于除草剂之前，要解决的问题有：（1）、物质的最低有效浓度；（2）、化感物质的分离和鉴定；（3）、化感物质在土壤中的残留和降解；（4）、化感物质对土壤中微生物生理生化特性的影响；（5）、化感物质的作用方式；（6）、化感物质对作物是否有负面影响；（7）、化感物质对人类健康的影响；（8）、产业化生产化感物质是否是经济合理的。

对化感物质进行研究，可以选择出新一代农药开发的母体结构。以活性化感物质作为先导化合物可以更快更经济地发现活性更优的类似物。虽然离最终除草剂的问世还需要相当长的时间和较大的经济投入，但是天然除草剂是环保的，在环境问题备受关注的今天，天然除草剂必将具有广阔的前景。

高粱素（Sorgoleone）是高粱（Sorghum bicolor （L.） Moench）的根中合成并分泌到土壤中的苯醌类化感物质（Allelochemicals），它能通过竞争光合系统II中质体醌的结合位点，从而抑制其它植物的光合作用；同时能阻碍线粒体中的电子转移反应，从而对其它植物产生直接的或间接的有害作用。有研究报道高粱素对包括阔叶、单子叶和双子叶等多种杂草的生长表现出显著的抑制作用。由于高粱素对人和动物安全，且具有除草高效及无环境污染等特点，使其在新型除草剂开发方面具有广阔的前景。

高粱素（Sorgoleone）

虽然高粱素在抑制杂草方面具有很好的效果，但是其在高粱中的含量比较低。同时由于植物的培养周期长，且受限于环境、季节和区域的影响，这些因素进一步限制了高粱素的开发和利用。目前，高粱素的获得主要依赖于从高粱的根中提取，但是由于高粱素在高粱根中的含量较低，且存在多种结构类似物，这种提取分离方法过程较为复杂且效率低。

发明内容

本发明要解决上述问题，从而提供一种高粱素的制备方法。本发明对酿酒酵母的代谢途径进行改造以提高合成乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）和丙二酰辅酶A（Malonyl-CoA）的能力，同时将合成高粱素的相关基因导入酿酒酵母中，获得高产高粱素的重组工程菌，并将工程菌应用于制备高粱素的方法，实现高粱素高效的合成。

本发明的第一个方面，在于提供一种能够用于生产高粱素的酵母工程菌，所述酵母工程菌能大量合成乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。

本发明的另一个方面在于提供利用上述酵母工程菌生产高粱素的方法。

具体的，一种高粱素的制备方法，包括以下步骤：

a、获得改进的高粱素合成基因， DES2、DES3、ARS1、ARS2、OMT3及CYP71AM1；

b、通过同源重组的方式将DES2基因和DES3基因分别构建至真核表达载体pESC-His的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1，将ARS1基因和OMT3基因分别构建至真核表达载体pESC-Ura的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1，将ARS2基因和OMT3基因分别构建至真核表达载体pESC-Ura的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1，将CYP71AM1基因和来源于拟南芥的ATR1基因分别构建至真核表达载体pESC-Leu的pGAL1和pGAL10启动子下游MCS2和MCS1；

c、将pESC-His-DES2-DES3质粒、pESC-Ura-ARS1-OMT3或pESC-Ura-ARS2-OMT3、和pESC-Leu-CYP71AM1-CPR利用酵母转化试剂盒转化入酿酒酵母BY4741，涂布于Sc-His-Leu-Ura筛选平板，28~32℃下培养2~4 d；长出单菌落后，在超净工作台中挑取单菌落于Sc-His-Leu-Ura液体筛选培养基，在摇床中，28~32 ℃，200~250 rpm培养；取培养好的菌液，用引物Gal1-F/R和Gal10-F/R进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物中是否包含所有目的条带；将包含所有目的条带的菌株命名为BY-ZJUT-ZH1，加入甘油，冻存；

d、将菌BY-ZJUT-ZH1在Sc-His-Leu-Ura筛选平板上划线，28~32℃培养2~4 d，挑取平板上的重组酿酒酵母单菌落到培养基中，在摇床中28~32 ℃，180 ~220rpm过夜；将菌体转移到新的培养基中，使其初始OD₆₀₀=0.5，继续在28~32 ℃，180 ~220rpm摇床中培养18~26h；然后用无菌离心管在（2000~4000）g离心2~10 min收集菌体，并转移至YPG培养基中，在28~32℃，180 ~220 rpm摇床中培养40~55h；外加脂肪酸培养时，以0.05~0.2%（v/v）的终浓度加入；

f、收集发酵后的菌体，使用液氮研磨法将菌体粉化；进行产物的提取和检测。

或者，一种高粱素的制备方法，包括以下步骤：

a、获得改进的高粱素合成基因， DES2、DES3、ARS1、ARS2、OMT3、P450、ATR1；

b、将DES2和DES3、A1O（指ARS1或ARS2）和OMT3、P450和ATR1两两分组分别构建到pESC系列载体的多克隆位点1和多克隆位点2处，使用引物T_ADH1和T_CYC1，将包含两端终止子序列的表达盒片段进行扩增、纯化，获得片段1、2、3；从pESC-URA 载体上用引物URA-F和URA-R扩增获得尿嘧啶URA3编码序列的表达盒片段4；合成酿酒酵母基因组的非同源连接片段L1-L4，通过同源重组的方式将连接片段与上述表达盒1、2、3、4进行拼接，获得URA-L1、L1-DES2- DES3-L2、L2- A1O-OMT3-L3、L3- P450-ATR1-L4基因片段；提取酿酒酵母基因组，扩增整合位点YPRC∆15两端同源臂site1和site2，并且通过同源重组方式，拼接获得片段site1-URA-L1和L4- site2；将site1-URA-L1、L1- DES2- DES3-L2、L2- A1O-OMT3-L3、L3-P450-ATR1-L4和L4- site2五个片段分别扩增、纯化，通过电击转化法转化到酿酒酵母CEN.PK2-1C中，使用SD-URA固体缺陷培养基培养2~3天，挑选单克隆，进行基因型验证，将阳性菌株进行保菌，得到BY-ZJUT-ZH2菌株；

c、将保存的甘油菌BY-ZJUT-ZH2菌株在平板上划线，28~32℃培养2~4 d；长出单菌落后，挑取单菌落于液体培养基中，在摇床中，28~32℃，200~250 rpm培养8~15 h；培养好的种子液继续扩大培养至200 mL，接种初始OD₆₀₀为0.03~0.06，在摇床中，28~32 ℃，200~250rpm培养8~16h；

d、将培养好的二级种子液接种至发酵罐进行发酵，培养温度为28~32 ℃，初始搅拌转速为600~1000 rpm，根据发酵过程中溶氧水平搅拌转速最高可调整至1200 rpm，pH通过补加氨水控制在5.6左右；本步骤培养基组成为：4~6 g/L （NH₄）₂SO₄，2~4g/L KH₂PO₄，0.03~0.07 g/L MgSO₄，50~70 mg/L尿嘧啶，50~70mg/L色氨酸，10~30 g/L葡萄糖以及本领域常规使用量的金属元素和维生素溶液；

e、培养4~6 h后，补加培养基13~16 g/L （NH₄）₂SO₄，8~10 g/L KH₂PO₄，1.2~1.8 g/L MgSO₄，160~200 mg/L尿嘧啶，160~200 mg/L色氨酸，50~70g/L葡萄糖，以及步骤C中三倍使用量的金属元素和维生素溶液，继续培养；

f、继续培养4~6 h后，补加培养基23~28 g/L （NH₄）₂SO₄，12~18 g/L KH₂PO₄，2.~3g/L MgSO₄·7H₂O，250 ~350mg/L尿嘧啶，250 ~350 mg/L色氨酸，80~120 g/L半乳糖以及步骤C中五倍使用量的金属元素和维生素溶液，继续培养18~30 h；

g、培养结束后，通过离心收集菌体，进行产物的提取和检测。

本发明上述技术方案中，DES2的序列，为序列表所示的第1序列；

DES3的序列，为序列表所示的第3序列；

ARS1的序列，为序列表所示的第5序列；

ARS2的序列，为序列表所示的第7序列；

OMT3的序列，为序列表所示的第9序列；

CYP71AM1的序列，为序列表所示的第11序列；

ATR1的序列，为序列表所示的第13序列。综上所述，本发明具有以下有益效果：

本发明对酿酒酵母的代谢途径进行改造以提高合成乙酰辅酶A（Acetyl-CoA）和丙二酰辅酶A（Malonyl-CoA）的能力，同时将合成高粱素的相关基因导入酿酒酵母中，获得高产高粱素的重组工程菌，并将工程菌应用于制备高粱素的方法，实现高粱素高效的合成。

附图说明

图1 pESC-His-DES2-DES3载体构建示意图；

图2 pESC-Ura-ARS1-OMT3和pESC-Ura-ARS2-OMT3构建示意图；

图3 pESC-Leu-CYP71AM1-CPR构建示意图；

图4 BY-ZJUT-ZH1发酵产物液相色谱图；

图5 酿酒酵母脂肪酸途径优化示意图；

图6 在酿酒酵母中异源整合高粱素合成途径关键酶基因示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

LB培养基：酵母粉5.0g/L，蛋白胨10g/L、NaCl10g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

YPD培养基组成：酵母粉24 g/L、蛋白胨12 g/L、甘油4 mL、KH₂PO₄ 2.3 g/L、K₂HPO₄12.5 g/L，溶剂为去离子水，pH6.8-7.0。

SC-Dropout培养基组成: 泛基诺 His Leu Ura Minus Media 8 g/L、葡萄糖20g/L。

实施例1 、基因表达载体的构建

从NCBI数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）中下载基因序列，分别是来源于高粱（Sorghum bicolor （L.） Moench）的脂肪酸脱氢酶（Fatty aciddesaturases）基因DES2和DES3、高粱的聚酮合酶（Alkylresorcinol Synthases）基因ARS1和ARS2、甲基转移酶（O-methyltransferase）基因OMT3和细胞色素P450（Cytochrome P450）基因CYP71AM1。针对酿酒酵母密码子偏好性将这些基因序列进行密码子优化后进行全基因合成。示例性的基因改进后的密码子序列如SEQ ID NO：1（DES2）、3（DES3）、5（ARS1）、7（ARS2）、9（OMT3）及11（CYP71AM1）所示。

将获得上述改进的高粱素合成基因，通过同源重组的方式将DES2基因和DES3基因分别构建至真核表达载体pESC-His的pGAL1和pGAL10启动子下游（MCS2和MCS1）（附图1），将ARS1基因和OMT3基因分别构建至真核表达载体pESC-Ura的pGAL1和pGAL10启动子下游（MCS2和MCS1）（附图2），将ARS2基因和OMT3基因分别构建至真核表达载体pESC-Ura的pGAL1和pGAL10启动子下游（MCS2和MCS1）（附图2），将CYP71AM1基因和来源于拟南芥的ATR1基因（基因序列SEQ ID NO：13（ATR1））分别构建至真核表达载体pESC-Leu的pGAL1和pGAL10启动子下游（MCS2和MCS1）（附图3）。具体操作如下：

（1）利用设计的带载体同源臂的引物通过全长PCR将DES3扩增，纯化；

（2）通过设计引物pHIS-F和pHIS-R反向PCR获得线性化载体pESC-HIS，再使用无缝克隆试剂盒，利用同源重组酶将DES3与线性载体连接，反应条件为50 ℃孵育15 min；

（3）将反应产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于LB+Amp平板，37 ℃过夜培养；

（4）超净工作台中挑取单菌落于1 mL的LB+Amp液体培养基，摇床中37 ℃，220 rpm培养1-2 h；

（5）利用通用引物Gal1-F/R通过PCR和凝胶电泳鉴定载体是否构建成功，将有目的大小条带的菌液送测序，通过测序结果进一步确证载体构建成功；

（6）阳性菌液扩大至20 mL培养后，提取构建成功的载体作为载体；

（7）利用设计的带载体同源臂的引物通过全长PCR将DES2扩增，纯化；

（8）利用内切酶Not I和Spe I将步骤（6）中提取的载体线性化，反应条件为37℃2h；

（9）利用同源重组酶将DES2与线性载体连接，反应条件为50 ℃孵育15min；

（10）将反应产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于LB+Amp平板，37 ℃过夜培养；

（11）超净工作台中挑取单菌落于1 mL的LB+Amp液体培养基，摇床中37 ℃，220rpm培养1-2 h；

（12）用通用引物Gal10-F/R通过PCR和凝胶电泳鉴定载体是否构建成功，将有目的大小条带的菌液送测序，通过测序结果进一步确证载体构建成功；

（13）阳性菌液添加20％的甘油，-80 ℃冻存，构建成功的pESC-His-DES2-DES3载体-20 ℃冻存备用；

（14）其它几个载体（pESC-Ura-ARS1-OMT3、pESC-Ura-ARS2-OMT3、pESC-Leu-CYP71AM1-ATR1）构建方法与构建DES2和DES3的载体相同，载体构建引物见引物列表1，构建示意图见附图1，图2，图3。

引物列表1

引物名称	引物序列
		pESC-His-F	5’-GCTAAGATCCGCTCTAACCG-3’
pESC-His-R	5’-GGCCCTATAGTGAGTCGTATTACG-3’
		DES3-F	5’-atacgactcactatagggccATGGCTGCTACTGATCATGAAGTT-3’
DES3-R	5’-cggttagagcggatcttagcTCACTTCTGTTTGTGAGCATCGTC-3’
		DES2-F	5’-ttgtaatccatcgatACTAGTTCAGAACTTGTTGTACCA-3’
DES2-R	5’-accctcactaaaggGCGGCCGCATGGGTGCTGGTGG-3’
		pESC-Ura-F	5’-ATCCGCTCTAACCGAAAAGGA-3’
pESC-Ura-R	5’-CGTTGGTAGATACGTTGTTGACACT-3’
		ARS1-F	5’-caacaacgtatctaccaacgTCATGGGTACAACTCAATAATAGACCT-3’
ARS1-R	5’-ccttttcggttagagcggatTCAGTTACCCTCCAATTCCAAATT-3’
		ARS2-F	5’-caacaacgtatctaccaacgTCATGGGTACAACTCAATAATAGACCT-3’
ARS2-R	5’-ccttttcggttagagcggatTCAATTTCCCTCCAGTTCCGGGTT-3’
		pESC-Leu-F	5’-AGTAAGCTTGGTACCGCGG-3’
pESC-Leu-R	5’-GAGGTCTTCTTCGGAAATCAAC-3’
		P450-F	5’-tgatttccgaagaagacctcGATGGATGAGTACTTCGTTGA-3’
P450-R	5’-ccgcggtaccaagcttactctTTAAGCATCAATAGAAGCAG-3’
		ATR1-F	5’-gaattcaaccctcactaaagggATGTGGAAAAAGACAACAGC-3’
ATR1-R	5’-gtaatccatcgatactagtgcggTTACCAGACGTCCCTCAAGT-3’
		pESC-Leu-R’	5’-CCCTTTAGTGAGGGTTGAATTC-3’
pESC-Leu-F’	5’-CCGCACTAGTATCGATGGATTAC-3’
		Gal1-F	5’-ATTTTCGGTTTGTATTACTTC-3’
Gal1-R	5’-GTTCTTAATACTAACATAACT-3’
		Gal10-F	5’-GGTGGTAATGCCATGTAATATG-3’
Gal10-R	5’-GGCAAGGTAGACAAGCCGACAAC-3’

实施例2、酿酒酵母工程菌BY-ZJUT-ZH1的构建

将pESC-His-DES2-DES3质粒、pESC-Ura-ARS1-OMT3（或pESC-Ura-ARS2-OMT3）和pESC-Leu-CYP71AM1-CPR利用酵母转化试剂盒转化入酿酒酵母BY4741，涂布于Sc-His-Leu-Ura筛选平板，30 ℃下培养2-4 d。长出单菌落后，在超净工作台中挑取单菌落于1 mL的Sc-His-Leu-Ura液体筛选培养基，在摇床中，30 ℃，220 rpm培养过夜。取培养好的菌液，用引物Gal1-F/R和Gal10-F/R进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物中是否包含所有目的条带。将包含所有目的条带的菌株命名为BY-ZJUT-ZH1，加入20 %的甘油，-80 ℃冻存。

重组酵母摇瓶诱导发酵

将甘油菌BY-ZJUT-ZH1在Sc-His-Leu-Ura筛选平板上划线，30℃培养2-4 d，挑取平板上的重组酿酒酵母单菌落到5 mL培养基中，在摇床中30 ℃，200 rpm过夜培养。将菌体转移到新的100 mL培养基中，使其初始OD₆₀₀=0.5，继续在30 ℃，200 rpm摇床中培养24 h。然后用无菌离心管在3000×g离心5 min收集菌体，并转移至100 mL YPG培养基（YPD培养基中的葡萄糖换成半乳糖）中，在30 ℃，200 rpm摇床中培养48 h。外加脂肪酸培养时，以0.1%（v/v）的终浓度加入。

重组酵母产物提取

收集发酵后的菌体，使用液氮研磨法将菌体粉化。首先在250 mL锥形瓶中加入50mL的甲醇/氯仿（1:1, v/v）溶液，再加入粉碎的菌体，轻轻涡旋1 min，然后水浴超声30min。抽提液真空抽滤，收集滤液，滤渣再用10 mL甲醇/氯仿（1:1, v/v）溶液抽提两次。合并三次抽提的滤液，旋蒸，圆底烧瓶中的残留物在氯仿中重新溶解，然后用0.22 μm的有机膜过滤后，转移到液相色谱瓶中，使用岛津液相色谱仪进行HPLC分析。

HPLC检测发酵产物

对照品：1 mg/L高粱素。

色谱条件：色谱柱，Agilent XDB-C18 （250 mm × 4.6 mm）；流动相，乙腈：水（v/v）=7:3；流速，1.8 mL·min^-1；进样量，50 μL；柱温，30℃。产物结果见附图4。从图4可以看出，在检测样品色谱图上16 min处出现了与高粱素标准品相同出峰时间的峰，后经确证该样品峰为高粱素。

实施例3 、酿酒酵母工程菌BY-ZJUT-ZH2的构建

首先对酿酒酵母脂肪酸途径进行优化，以提高高粱素前体的棕榈油酸palmitoleic acid （16:1^△9）产量，主要构建策略和方法参考Yongjin J. Zhou等人的研究（Zhou et al. Nature Communicatons （2016） 7:11709. DOI 10.1038/ncomms11709）。通过以下策略提高酿酒酵母细胞质中脂肪酸合成前体乙酰辅酶A acetyl-CoA的产量，引入小家鼠Mus musculus的柠檬酸裂解酶citrate lyase （MmACL）和圆红冬孢酵母Rhodospuridium toruloides的苹果酸酶malic enzymes（RtME）和柠檬酸合酶 RtCIT1，过表达酿酒酵母内源的线粒体柠檬酸转运蛋白Ctp1和苹果酸盐脱氢酶malatedehydrogenase ‘Mdh3，过表达线粒体丙酮酸载体（Mitochondrial pyruvate carrier）MPC1 和 MPC3；通过引入圆红冬孢酵母的脂肪酸合酶RtFAS1 和 RtFAS2，乙酰辅酶A羧化酶acetyl-CoA carboxylase（ACC1），阻止脂肪酸通过β-氧化降解，敲除POX1基因，提高酿酒酵母脂肪酸的合成（脂肪酸途径优化示意图见图5）。

基于实施例2中将DES2和DES3、A1O（ARS1或ARS2）和OMT3、P450和ATR1两两分组分别构建到pESC系列载体的多克隆位点1和多克隆位点2处，使用引物T_ADH1和T_CYC1，将包含两端终止子序列的表达盒片段进行扩增、纯化，获得片段1、2、3；从pESC-URA 载体上用引物URA-F和URA-R扩增获得尿嘧啶（URA3）编码序列的表达盒片段4；参考Siwei Li等人的研究（Liet al. Biotechnol Biofuels （2016） 9:232. DOI 10.1186/s13068-016-0645-4），合成酿酒酵母基因组的非同源连接片段L1-L4（表2），通过同源重组的方式将连接片段与上述表达盒1、2、3、4进行拼接，获得URA-L1、L1- DES2- DES3-L2、L2- A1O-OMT3-L3、L3- P450-ATR1-L4基因片段；提取酿酒酵母基因组，扩增整合位点YPRC∆15两端同源臂site1和site2，并且通过同源重组方式，拼接获得片段site1-URA-L1和L4- site2；将site1-URA-L1、L1- DES2- DES3-L2、L2- A1O-OMT3-L3、L3- P450-ATR1-L4和L4- site2五个片段分别扩增、纯化，通过电击转化法转化到酿酒酵母CEN.PK2-1C中，使用SD-URA固体缺陷培养基培养2-3天，挑选单克隆，进行基因型验证，将阳性菌株进行保菌（基因整合示意图见图6）。

表2 引物、连接片段序列及整合位点同源序列

实施例4、BY-ZJUT-ZH2的高密度发酵

将构建好的BY-ZJUT-ZH2菌株进行高密度发酵，具体操作如下：

（1）将保存的甘油菌BY-ZJUT-ZH2菌株在平板上划线，30 ℃培养2-4 d。长出单菌落后，挑取单菌落于5 mL的液体培养基中，在摇床中，30 ℃，220 rpm培养12 h。培养好的种子液继续扩大培养至200 mL，接种初始OD₆₀₀为0.05，在摇床中，30 ℃，220 rpm培养12 h；

（2）将培养好的二级种子液接种至5 L发酵罐进行发酵，使用无机盐培养基作为发酵培养基（5 g/L （NH₄）₂SO₄，3 g/L KH₂PO₄，0.5 g/L MgSO₄·7H₂O，60 mg/L尿嘧啶，60 mg/L色氨酸，20 g/L葡萄糖以及微量金属元素和维生素溶液），初始培养体积为2 L，碳源为葡萄糖，培养温度为30 ℃，初始搅拌转速为800 rpm，根据发酵过程中溶氧水平搅拌转速最高可调整至1200 rpm，pH通过补加氨水控制在5.6左右；

（3）培养6 h后，补加培养基（15 g/L （NH₄）₂SO₄，9 g/L KH₂PO₄，1.5 g/L MgSO₄·7H₂O，180 mg/L尿嘧啶，180 mg/L色氨酸以及3x微量金属元素和3x维生素溶液），60 g/L葡萄糖，继续培养；

（4）又培养6 h后，补加培养基（25 g/L （NH₄）₂SO₄，15 g/L KH₂PO₄，2.5 g/LMgSO₄·7H₂O，300 mg/L尿嘧啶，300 mg/L色氨酸以及5x微量金属元素和5x维生素溶液），100g/L半乳糖，继续培养24 h；

（5）培养结束后，通过离心收集菌体，产物的提取和检测同实施例2。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 一种制备高粱素的方法

<210> 1

<211> 1158

<212> DNA

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 1

atgggtgctg gtggtaaaat gactgagcag gagagagaaa aacaggaaca gcaattggct 60

agaggtgctt ctactatgca aagatcccca gttgagaaac caccatttac tgtcggtcag 120

atcaagaaag ctatcccccc acattgtttc caaagatctg tcttgaagtc cttttcttac 180

gtcgttaggg acttggttat tgctgctgcc ttgttgtatt ttgctttggc catcattcca 240

gctttgccat ctccattgca ttatgctgct tggccattgt attggattgc tcaaggctgt 300

gtctgttttg ctatgtgggt cattgctcat gaatgtggtc atcatgcctt ctctgattat 360

cagttgttgg acgatattgt cggtttggtc ttgcattctt ctttgatggt tccatacttc 420

tcctggaaat actctcatag gaggcatcat tctaacactg gctctttgga aagggacgaa 480

gtcttcgttc caaaaactaa gggtgctttg gcttggtatg ctccatacgt ttacaataac 540

ccagttggta ggttggtcca tattgtcgtt cagttgactt tgggttggcc attgtatttg 600

gctactaatg tctctggtag accatatcca agatttgctt gtcactatga cccatacggt 660

cccatttaca acgataggga gagagctcag atttttgttt ctgacgctgg tgttatggct 720

gtttctttcg gcttgtacaa attggctgcc actttgggtt tttggtgggt tgttagggtt 780

tatgctgtcc cattgttgat tgtcaatgtc tggttggttt tggttactta cttgcatcac 840

actcatccag ctttgccaca ttatgattct agggagtggg attggttgag aggtgctttg 900

tctactgttg acagagatta cggtgtcttc aataggttct tccacaacat tactgacact 960

cacgttgttc atcacttgtt ctctactttg ccacactttc atgctactga ggctactaaa 1020

gctattaagc caatcttggg tgagtattac caattcgacc caactccaat tgctaaagct 1080

acttggagag aagctagaga atgcattttc gtcgaaccag aagaaggtag aggtgttttc 1140

tggtacaaca agttctga 1158

<210> 2

<211> 385

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 2

MGAGGKMTEQ EREKQEQQLA RGASTMQRSP VEKPPFTVGQ IKKAIPPHCF QRSVLKSFSY 60

VVRDLVIAAA LLYFALAIIP ALPSPLHYAA WPLYWIAQGC VCFAMWVIAH ECGHHAFSDY 120

QLLDDIVGLV LHSSLMVPYF SWKYSHRRHH SNTGSLERDE VFVPKTKGAL AWYAPYVYNN 180

PVGRLVHIVV QLTLGWPLYL ATNVSGRPYP RFACHYDPYG PIYNDRERAQ IFVSDAGVMA 240

VSFGLYKLAA TLGFWWVVRV YAVPLLIVNV WLVLVTYLHH THPALPHYDS REWDWLRGAL 300

STVDRDYGVF NRFFHNITDT HVVHHLFSTL PHFHATEATK AIKPILGEYY QFDPTPIAKA 360

TWREARECIF VEPEEGRGVF WYNKF 385

<210> 3

<211> 1170

<212> DNA

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 3

atggctgcta ctgatcatga agttgaagag gctgttgcta aagctagaga agacgataag 60

tctaggagac aagttgatgg ttttgatgct ggtaaagctc caccatttag aattggtgat 120

gtcagagctg ctgttccaga acattgttgg agaaaatctc cttggaggtc tttgtggtat 180

gttgttaggg acgtcgctgt tgttgttgct ttgggtgctg ctgctgctgc tatggattct 240

tgggctgttt ggccattgta ttgggctgtt cagggtacta tgttttgggc tttcttcgtt 300

ttgggtcatg attgtggtca tggttctttt tctgacaacg ccactttgaa ctctgtcgtc 360

ggtcatttgt tgcactcttt catcttgatt ccataccacg gttggagaat ttctcatagg 420

actcaccacc aaaatcatgg tcacgtcgat agagatgaat cttggcatcc attgactgaa 480

aggaggtata gaagattgcc acccagagct aaaaagttga gattcactcc accattccca 540

ttgttgttgt tccccttgta tttgttctac aggtccccag gtaaaagagg ttctcacttc 600

ttgccatctt ctccattgtt ctccccaaaa gacaaaggtg acgtcatttt gtctactact 660

tgctggtgta ttatgttggc tttcttgttg gctatgtctt gtgcttttgg tccattgcaa 720

gtcttgaaaa tgtacggtgt cccatatttg gtttctgtca tgtggttgga tttggttact 780

tacttgcacc atcatggtca tcaagaaaga ttgccttggt atagaggtga agagtggtct 840

tatttgagag gtggtttgac tactgttgac agagattacg gttggatcaa ctctattcac 900

cacgacattg gtactcatgt catccatcac ttgttcccac aaattcccca ctatcatttg 960

gttgaggcta ctaaagctgc taaaccagtt ttgggtaggt attataggga gccacataaa 1020

tctggtccat tgccattgca tttgttgggt gtcttgttga gatctttgag ggttgaccac 1080

tttgtttctg accacggtga cgttgtttac tatcagactg accaccattt gaacgacact 1140

actactgacg atgctcacaa acagaagtga 1170

<210> 4

<211> 389

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 4

MAATDHEVEE AVAKAREDDK SRRQVDGFDA GKAPPFRIGD VRAAVPEHCW RKSPWRSLWY 60

VVRDVAVVVA LGAAAAAMDS WAVWPLYWAV QGTMFWAFFV LGHDCGHGSF SDNATLNSVV 120

GHLLHSFILI PYHGWRISHR THHQNHGHVD RDESWHPLTE RRYRRLPPRA KKLRFTPPFP 180

LLLFPLYLFY RSPGKRGSHF LPSSPLFSPK DKGDVILSTT CWCIMLAFLL AMSCAFGPLQ 240

VLKMYGVPYL VSVMWLDLVT YLHHHGHQER LPWYRGEEWS YLRGGLTTVD RDYGWINSIH 300

HDIGTHVIHH LFPQIPHYHL VEATKAAKPV LGRYYREPHK SGPLPLHLLG VLLRSLRVDH 360

FVSDHGDVVY YQTDHHLNDT TTDDAHKQK 389

<210> 5

<211> 1215

<212> DNA

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 5

atgggttctg ctccaccagc tgctactgtt caagaaatga ggagagctca aagagctgat 60

ggtccagctg ctgttttggc tattggtact gctaatcccc catctattat gccacaggac 120

gattatccag attactactt cagggtcact aactctgagc acttgactga tttgaaggcc 180

aagttgtcta gaatttgcaa ccacaacaag tctggtatta gacagaggta cttgcatttg 240

aacgaggagt tgttggctgc taatccaggt tttattgacc caaagaggcc atctttggac 300

gaaagagttg aaatggcttc tgctgctgtt ccagaattgg ctgctaaagc tgctgctaaa 360

gctattgctg aatggggtag accagctact gatatcactc acttgatctt ctctacttac 420

tctggtgcta gagctccatc tggtgataga agattggctt ctttgttggg tttgaggcca 480

actgtctcta ggactatttt gtccttgcat ggttgttatg gtggtggtag agctttgcaa 540

ttggctaaag aattggctga gaataacaga ggtgctagag ttttggttgc ttgttctgag 600

ttgactttga tcgctttcta tggtccagaa ggtggttgtg tcgataacat tattggccag 660

accttgtttg gtgatggtgc tggtgctgtt attgttggtg ctgatccagt tggtgctcca 720

gctgaaagac cattgtttga gatggtcttt gcttctcaga ctactattcc agaaactgag 780

gacgctattt ctatgcagta ctccaaatgt ggtatggagt accatttgtc ttctcgcgtt 840

ccaagagttt tgggttctaa cgtcgaaaga tgtttggtcg acacctttag aactttgggt 900

gtttctgttg cttggaatga tttgttctgg gctattcatc caggtggtag agctattttg 960

gacaacattg aggaagtctt gagattggag gatggtaaat tggctgcttc tagacatgtc 1020

ttgtctgaat tcggtaacat gtctggtact actgtcatct tcgttttgga tgagttgagg 1080

agaagaagag ctgctgctgc taaacaaggt ggtcaagctc cagaatgggg tgttatgatg 1140

gcttttggtc caggtattac tgttgagact atggttttgc atgctccatc caatttggaa 1200

ttggagggta actga 1215

<210> 6

<211> 404

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 6

MGSAPPAATV QEMRRAQRAD GPAAVLAIGT ANPPSIMPQD DYPDYYFRVT NSEHLTDLKA 60

KLSRICNHNK SGIRQRYLHL NEELLAANPG FIDPKRPSLD ERVEMASAAV PELAAKAAAK 120

AIAEWGRPAT DITHLIFSTY SGARAPSGDR RLASLLGLRP TVSRTILSLH GCYGGGRALQ 180

LAKELAENNR GARVLVACSE LTLIAFYGPE GGCVDNIIGQ TLFGDGAGAV IVGADPVGAP 240

AERPLFEMVF ASQTTIPETE DAISMQYSKC GMEYHLSSRV PRVLGSNVER CLVDTFRTLG 300

VSVAWNDLFW AIHPGGRAIL DNIEEVLRLE DGKLAASRHV LSEFGNMSGT TVIFVLDELR 360

RRRAAAAKQG GQAPEWGVMM AFGPGITVET MVLHAPSNLE LEGN 404

<210> 7

<211> 1218

<212> DNA

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 7

atggggtcca tggggaaggc actaccggcc accgtcgacg agatcaggcg tgcgcagcgc 60

gcggaagggc cggccgccgt gctcgccatc ggcacggcga acccgcccac aatcatgccc 120

caggacgact accccgacta ctacttccgc gtcaccaaca gcgagcacct caccgacctc 180

aaggccaagc tcagcaggat ctgcaaccac aacaagtccg gcatcaggca gcgctacctg 240

cacctcaacg aggagcttct cgccgccaac ccgggcttca tcgaccccaa gcggccgtcc 300

ctggacgagc gcgtggagat ggcctccgcc gccgtcccgg agctggccgc gaaagccgcc 360

accaaggcca tcgcggagtg gggccgtccc gccaccgaca tcacccacct catcttcagc 420

acctactccg gcgcgcgtgc cccgagcgga gaccgccgcc tcgcctccct gctgggcctc 480

cgccccaccg tgtcccgcac catcctcaac ctccacggct gctacggcgg ggggcggtcg 540

ctccagctcg ccaaggagat cgccgagaac aaccgcggcg cgcgcgtcct cgtcgcctgc 600

tccgagctca cgctcatcgc cttctacggg cccgagggag gctgcgtcga caacatcatc 660

ggccagacct tgttcggcga cggtgccggc gccgtcgtcg tcggcgccga ccctgacgcc 720

gccgtcgagc gcccgctgtt cgagatggcg ttcgcgacgc agaccacgat accggagagc 780

gaggacgcca tctccatgca gtacagcaaa tgtggcatgg agtaccacct ctccagcaag 840

gtgccacgcc tgatagggtg caacgtggaa cgctcccttg tcgacacgtt ccgcacgctc 900

ggcgtcaccg ccgcatggaa tgacctgttc tgggcggttc accccggagg tcgtgccatc 960

ctggacaaca tcgaggaagt gctcggtctg gaggacgaca aactggcggc gagtcgccat 1020

gtgctcagtg agtttggcaa catgagtggc accacggtga tcttcgtgct cgatgagttg 1080

cgccgacgtc gggcagcggc ggcgaagcag ggaggggaaa cgccggagtg gggagtgctc 1140

atggcttttg gaccgggaat cacaatcgag accatagtgc tccacacccc aagcaacccg 1200

gaactggagg gaaattga 1218

<210> 8

<211> 405

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 8

MGSMGKALPA TVDEIRRAQR AEGPAAVLAI GTANPPTIMP QDDYPDYYFR VTNSEHLTDL 60

KAKLSRICNH NKSGIRQRYL HLNEELLAAN PGFIDPKRPS LDERVEMASA AVPELAAKAA 120

TKAIAEWGRP ATDITHLIFS TYSGARAPSG DRRLASLLGL RPTVSRTILN LHGCYGGGRS 180

LQLAKEIAEN NRGARVLVAC SELTLIAFYG PEGGCVDNII GQTLFGDGAG AVVVGADPDA 240

AVERPLFEMA FATQTTIPES EDAISMQYSK CGMEYHLSSK VPRLIGCNVE RSLVDTFRTL 300

GVTAAWNDLF WAVHPGGRAI LDNIEEVLGL EDDKLAASRH VLSEFGNMSG TTVIFVLDEL 360

RRRRAAAAKQ GGETPEWGVL MAFGPGITIE TIVLHTPSNP ELEGN 405

<210> 9

<211> 1125

<212> DNA

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 9

atggtcttga tctctgagga ttctagggaa ttgttgcaag ctcatgttga gttgtggaac 60

cagacttact ctttcatgaa gtctgtcgct ttggctgttg ctttggattt gcatattgct 120

gacgccattc atagaagagg tggtgctgct actttgtctc aaattttggg cgagattggt 180

gttagaccat gtaaattgcc aggtttgcat aggattatga gggtcttgac tgtttctggc 240

acttttacta ttgtccagcc atctgctgaa actatgtctt ctgagtctga tggtagagaa 300

ccagtctaca aattgactac tgcttcctct ttgttggttt cttctgagtc ttctgctact 360

gcttctttgt ctccaatgtt gaatcacgtc ttgtctccat ttagggattc tccattgtct 420

atgggtttga ctgcttggtt taggcatgat gaagatgaac aagctccagg tatgtgtcca 480

tttactttga tgtacggtac tactttgtgg gaagtttgca gaagggacga tgctattaac 540

gctttgttca acaacgctat ggctgctgat tctaatttct tgatgcagat cttgttgaag 600

gagttctctg aggttttctt gggtattgac tccttggttg atgttgctgg tggtgttggt 660

ggtgctacta tggctattgc tgctgctttt ccatgtttga agtgcactgt cttggatttg 720

ccacacgttg ttgctaaagc tccctcttct tctattggta acgtccaatt tgttggtggt 780

gacatgtttg aatctattcc cccagctaat gtcgttttgt tgaagtggat tttgcacgac 840

tggtctaatg atgagtgcat taagatcttg aagaactgca agcaagctat tccatctaga 900

gatgctggtg gtaagatcat tattatcgac gtcgtcgttg gttctgattc ttctgacacc 960

aagttgttgg aaacccaggt catttacgac ttgcacttga tgaagattgg tggtgtcgag 1020

agagatgaac aggagtggaa gaagattttc ttggaggctg gtttcaaaga ctacaagatc 1080

atgccaatct tgggcttgag gtctattatt gagttgtacc catga 1125

<210> 10

<211> 374

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 10

MVLISEDSRE LLQAHVELWN QTYSFMKSVA LAVALDLHIA DAIHRRGGAA TLSQILGEIG 60

VRPCKLPGLH RIMRVLTVSG TFTIVQPSAE TMSSESDGRE PVYKLTTASS LLVSSESSAT 120

ASLSPMLNHV LSPFRDSPLS MGLTAWFRHD EDEQAPGMCP FTLMYGTTLW EVCRRDDAIN 180

ALFNNAMAAD SNFLMQILLK EFSEVFLGID SLVDVAGGVG GATMAIAAAF PCLKCTVLDL 240

PHVVAKAPSS SIGNVQFVGG DMFESIPPAN VVLLKWILHD WSNDECIKIL KNCKQAIPSR 300

DAGGKIIIID VVVGSDSSDT KLLETQVIYD LHLMKIGGVE RDEQEWKKIF LEAGFKDYKI 360

MPILGLRSII ELYP 374

<210> 11

<211> 1587

<212> DNA

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 11

atggacgaat actttgttga cctgccatac ccaaacttat gcttgtacgg ctcctgcctc 60

gtgcttgcag tcgtcgtcgc ccgtgccatc atcctcagcg gcagcggcaa gaaaccaggt 120

ggcctgcctc cgggcccatg gcagttaccg gtgatcggca gcctccacca cctgctgcgg 180

gggctcccgc accacgccat ccgcgacctg tccctgcgtc acggcccgct gatgctgcta 240

aggatctgcg agcgcacggc catcgtggtg tcctccgctg aggccgtggc ggagatgttg 300

aagcgccacg acgccgcctt ctcggagcgg ccgagcagcc cgggcatcga ggagctgtcg 360

aggcacgggc agggagtcat cttcgcgccc tacggcgacc actggcgcct gctgcggcgg 420

atcctcatga cggagctgct gagcccgcgg cgcgtggagg cgttccggca catccgcgag 480

gacgaggcgg ctcgcctggt ctcgtcgctg tcgtccctgc ctcagcccgt cgacatggac 540

gagcggctgg aggtgttcgt cgccgactcc tccgtgcgcg ccatcttggg cgaccggttg 600

cccgaccgcg ccgcgttcct gaagatggtc aaggcagggc aggacccgtc gtcgctgttc 660

gacctccgcg acctgttccc gtcgtcgtgg ctcgtgcgga tgctgccgcg gagccgcaag 720

gcggagcggc acctccagga gatgttccgg ctcatggacg acatcctcgt gagccacagc 780

caaaggaggg tcgacgatga tagcccagac gggggcggtg gtggcgccgt cgacgaggag 840

catgacatgg tggacgttct gctcaggatc cagaagcaag gcgacatgcg tgtttctctc 900

aaccatggag tcatcagggc ggcgctcata gatgcggttg gtgcagcact tgacacaaca 960

tcgactaccc tccggtgggc tatggccgaa ctaatcgcaa acccaagggt gatgcacaag 1020

gcgcagcttg agattcgacg cgtcatggca gctgggcaac aacgacgagt acatgaggcg 1080

actctaaggg acctacacta cctgaaagca gtgatcaaag agaccttacg actgcaccct 1140

cctgccccgt tcgtcccaag ggtatgcttg gatgatggca tcaagatcca aggctaccat 1200

gtgccgcggg ggacaatagt cgtcgccaac gtttgggcta tttccaggga cccaaagtac 1260

tgggaggacc cagacatgtt tataccagag agatttcatc agggtgaccc cgaccaccac 1320

cgctgtttcg acttcaaggg gttcgatttt gagttcactc ctttcggggc tgggcgcagg 1380

atgtgccccg ggatgaattt cgctcatatg aacgttgaga ttgctctggc tagcctcctg 1440

taccactttg actggaagct gccagatgga gctacaccgg aggagattga catgacagag 1500

ctctggggcg ttactgtcgc taggaaggct aagctacttt tacatcccat tccttgtatt 1560

ccagctgctg catcgattga tgcataa 1587

<210> 12

<211> 528

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor (L.) Moench

<400> 12

MDEYFVDLPY PNLCLYGSCL VLAVVVARAI ILSGSGKKPG GLPPGPWQLP VIGSLHHLLR 60

GLPHHAIRDL SLRHGPLMLL RICERTAIVV SSAEAVAEML KRHDAAFSER PSSPGIEELS 120

RHGQGVIFAP YGDHWRLLRR ILMTELLSPR RVEAFRHIRE DEAARLVSSL SSLPQPVDMD 180

ERLEVFVADS SVRAILGDRL PDRAAFLKMV KAGQDPSSLF DLRDLFPSSW LVRMLPRSRK 240

AERHLQEMFR LMDDILVSHS QRRVDDDSPD GGGGGAVDEE HDMVDVLLRI QKQGDMRVSL 300

NHGVIRAALI DAVGAALDTT STTLRWAMAE LIANPRVMHK AQLEIRRVMA AGQQRRVHEA 360

TLRDLHYLKA VIKETLRLHP PAPFVPRVCL DDGIKIQGYH VPRGTIVVAN VWAISRDPKY 420

WEDPDMFIPE RFHQGDPDHH RCFDFKGFDF EFTPFGAGRR MCPGMNFAHM NVEIALASLL 480

YHFDWKLPDG ATPEEIDMTE LWGVTVARKA KLLLHPIPCI PAAASIDA 528

<210> 13

<211> 1944

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 13

atgtggaaaa agacaacagc tgataggtct ggtgaattaa agccattaat gatacctaaa 60

tctttaatgg ctaaggacga ggacgacgac ttggatttag gatcaggaaa gactagagtc 120

tctatatttt tcggaactca gacaggaaca gctgagggat tcgcaaaggc tttatcagaa 180

gagattaaag caaggtacga gaaggctgct gtcaaagtta tagatttgga tgactacgca 240

gctgatgacg accagtacga ggaaaagttg aaaaaggaaa ctttggcatt tttctgtgtt 300

gcaacatacg gtgacggtga gccaactgac aacgctgcta ggttctacaa atggttcaca 360

gaggaaaatg agagagacat taaattgcag cagttggctt acggtgtctt cgcattggga 420

aacaggcaat atgaacattt caataagatt ggaattgtct tggacgaaga attatgcaaa 480

aaaggagcta agaggttgat agaggtcggt ttgggtgacg atgaccagtc aatagaggac 540

gacttcaatg catggaaaga gtcattgtgg tcagagttag ataagttatt aaaagacgaa 600

gacgacaagt cagtcgcaac accttacaca gcagtcatac ctgagtatag ggtcgtcact 660

cacgacccaa gattcactac tcaaaagtca atggagtcaa atgtcgcaaa cggaaatact 720

actattgaca ttcatcaccc atgcagggtt gacgtcgctg tccagaaaga gttacacact 780

cacgagtctg acaggtcatg cattcacttg gagttcgata tttcaagaac tggtattact 840

tacgaaacag gtgaccacgt tggtgtctac gctgagaacc acgtcgagat tgtcgaggaa 900

gctggaaagt tgttgggaca ttctttagat ttggtcttct caattcatgc tgacaaagag 960

gacggttcac cattggagtc tgctgttcca ccaccattcc ctggaccatg cactttaggt 1020

actggtttgg caaggtacgc agacttattg aacccaccta ggaagtcagc tttagttgca 1080

ttggctgcat atgcaacaga accatctgag gcagagaaat taaagcactt gacttctcct 1140

gacggtaagg acgagtactc acagtggata gtcgcatctc agaggtcatt gttggaggtc 1200

atggcagcat ttccatcagc aaagccacct ttaggtgttt tcttcgcagc tatagcacct 1260

agattgcagc ctaggtatta ttcaatatct tcttcaccta ggttggctcc atctagggtc 1320

cacgtcacat cagctttggt ttacggacct actcctacag gaaggataca taaaggagtc 1380

tgctctactt ggatgaagaa cgctgtccca gcagagaagt ctcatgagtg ctcaggagct 1440

cctattttta ttagggcatc aaatttcaaa ttgccttcaa acccatctac tccaatagtc 1500

atggtcggac caggaacagg tttggctcct ttcaggggat ttttgcagga gaggatggct 1560

ttgaaggagg atggtgagga attgggatca tctttgttgt tctttggttg taggaatagg 1620

caaatggact tcatttatga ggacgaattg aacaactttg ttgatcaagg agtcatatca 1680

gagttaatta tggctttctc aagggagggt gcacaaaagg aatacgtcca acacaagatg 1740

atggaaaagg ctgcacaggt ctgggacttg attaaggagg agggatactt atatgtctgc 1800

ggtgacgcaa agggtatggc aagagacgtc cacaggactt tgcacacaat tgtccaggaa 1860

caggagggtg tttcttcatc tgaagcagag gctattgtta aaaagttgca aactgaaggt 1920

aggtacttga gggacgtctg gtaa 1944

<210> 14

<211> 647

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 14

MWKKTTADRS GELKPLMIPK SLMAKDEDDD LDLGSGKTRV SIFFGTQTGT AEGFAKALSE 60

EIKARYEKAA VKVIDLDDYA ADDDQYEEKL KKETLAFFCV ATYGDGEPTD NAARFYKWFT 120

EENERDIKLQ QLAYGVFALG NRQYEHFNKI GIVLDEELCK KGAKRLIEVG LGDDDQSIED 180

DFNAWKESLW SELDKLLKDE DDKSVATPYT AVIPEYRVVT HDPRFTTQKS MESNVANGNT 240

TIDIHHPCRV DVAVQKELHT HESDRSCIHL EFDISRTGIT YETGDHVGVY AENHVEIVEE 300

AGKLLGHSLD LVFSIHADKE DGSPLESAVP PPFPGPCTLG TGLARYADLL NPPRKSALVA 360

LAAYATEPSE AEKLKHLTSP DGKDEYSQWI VASQRSLLEV MAAFPSAKPP LGVFFAAIAP 420

RLQPRYYSIS SSPRLAPSRV HVTSALVYGP TPTGRIHKGV CSTWMKNAVP AEKSHECSGA 480

PIFIRASNFK LPSNPSTPIV MVGPGTGLAP FRGFLQERMA LKEDGEELGS SLLFFGCRNR 540

QMDFIYEDEL NNFVDQGVIS ELIMAFSREG AQKEYVQHKM MEKAAQVWDL IKEEGYLYVC 600

GDAKGMARDV HRTLHTIVQE QEGVSSSEAE AIVKKLQTEG RYLRDVW 647

Claims

1.一种高粱素的制备方法，包括以下步骤：

a、获得改进的高粱素合成基因，DES2、DES3、ARS1、ARS2、OMT3及CYP71AM1、ATR1；

c、将pESC-His-DES2-DES3质粒、pESC-Ura-ARS1-OMT3或pESC-Ura-ARS2-OMT3、和pESCLeu-CYP71AM1-ATR1利用酵母转化试剂盒转化入酿酒酵母BY4741，涂布于Sc-His-Leu-Ura筛选平板，28~32℃下培养2~4 d；长出单菌落后，在超净工作台中挑取单菌落于Sc-His-Leu-Ura液体筛选培养基，在摇床中，28~32 ℃，200~250 rpm培养；取培养好的菌液，用引物Gal1-F/R和Gal10-F/R进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物中是否包含所有目的条带；将包含所有目的条带的菌株命名为BY-ZJUT-ZH1，加入甘油，冻存；

d、将菌BY-ZJUT-ZH1在Sc-His-Leu-Ura筛选平板上划线，28~32℃培养2~4 d，挑取平板上的重组酿酒酵母单菌落到培养基中，在摇床中28~32 ℃，180~220rpm过夜；将菌体转移到新的培养基中，使其初始OD600=0.5，继续在28~32 ℃，180~220rpm摇床中培养18~26 h；然后用无菌离心管在（2000~4000）g离心2~10 min收集菌体，并转移至YPG培养基中，在28~32℃，180~220 rpm摇床中培养40~55h；外加脂肪酸培养时，以0 .05~0.2%（v/v）的终浓度加入；

e、收集发酵后的菌体，使用液氮研磨法将菌体粉化；进行高粱素的提取；

其中DES2基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

其中DES3基因核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示；

其中ARS1基因核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

其中ARS2基因核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；

其中OMT3基因核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示；

其中CYP71AM1基因核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；

其中ATR1基因核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。