CN111378588A

CN111378588A - 一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用

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Publication number: CN111378588A
Application number: CN201811641793.XA
Authority: CN
Inventors: 咸漠; 刘丽娟; 张海波; 齐畅; 曹小贺
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2020-07-07

Abstract

本发明涉及一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用，属于基因工程及微生物发酵技术领域。本发明提供的基因工程菌出发菌株为酵母菌，所述酵母菌整合了法尼烯合成酶基因AaFS，磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，磷酸转酮酶基因LmPK，乙醛脱氢酶基因DzeutE，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR。发酵生产法尼烯产量达到170mg/L。

Description

一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用，属于基因工程及微生物发酵技术领域。

背景技术

法尼烯(C15H24)是一种倍半萜烯，最早从苹果树中分离得到，在植物防御方面起到重要作用。同时，在能源、医药、食品等领域中，都具有重要的应用前景。在能源方面，法尼烯具有能量密度高、闪点高等特点，可以作为高密度燃料的前体。在医药生产中，法尼烯可以作为生产维生素E侧链(异植物醇)的一个中间体，用于合成维生素E。法尼烯存在于许多植物的精油中，具有青香味，可以用于生产食用香精及香料。此外，β-法尼烯是主要的蚜虫报警外激素，可以用于新型农药的创制。

法尼烯的合成可以通过由橙花叔醇(nerolidol)、月桧烯(myrcene)、香叶基溴(geranyl bromide)、丁烯醇等中间体，经催化剂催化合成。但该方法存在中间体及催化剂原料缺乏且成本高、操作麻烦、难以放大规模等缺点。而近年来，法尼烯的合成研究主要聚焦于利用微生物以可再生的糖为原料合成法尼烯。

目前,以大肠杆菌(Escherichia coli)为工程菌发酵合成法尼烯的摇瓶产量达到3g/L，7L发酵罐产量达到8g/L(You S,Yin Q,Zhang J,Zhang C,Qi W,Gao L,Tao Z,Su R,He Z.2017.Utilization ofbiodiesel by-product as substrate for high-productionofβ-farnesene via relatively balanced mevalonate pathway in Escherichiacoli.Bioresource Technology 243:228-236.)，其发酵培养基主要含蛋白胨、酵母膏、甘油，并需要添加氨苄青霉素、氯霉素、卡纳霉素以及L-阿拉伯糖、IPTG等昂贵的试剂。以酿酒酵母为工程菌发酵生产法尼烯摇瓶产量可达到1g/L，进而通过扩大发酵在200,000L的工业发酵罐产量达到100g/L，为报道的最大产量(MeadowsAL,Hawkins KM,Tsegaye Y,AntipovE,KimY,Raetz L,Dahl RH,TaiA,Mahatdejkul-Meadows T,Xu L,et al.2016.Rewritingyeast central carbon metabolism for industrial isoprenoidproduction.Nature537:694.)，该方法使用以葡萄糖、蔗糖、酵母粉、氨基酸、各种维生素及微量元素等成分构成的培养基为发酵原料生产法尼烯。这些方法往往需要添加昂贵的抗生素、诱导剂及其他试剂，使发酵原料成本过高。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用，采用的技术方案如下：

第一，本发明的目的在于提供一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌整合了法尼烯合成酶基因AaFS，磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，磷酸转酮酶基因LmPK，乙醛脱氢酶基因DzeutE，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR。

所述法尼烯合成酶基因AaFS，GenBank:AY835398.1；磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，GenBank:CP018335.1；磷酸转酮酶基因LmPK，GenBank:AY804190.1；乙醛脱氢酶基因DzeutE，GenBank:CP006929.1；羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR,NCBIReferenceSequence:NC_006569.1。

所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，基因型为：CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2)。

第二，本发明还提供上述转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌在合成法尼烯中的应用，所述基因工程菌可以转化纤维素水解液发酵产法尼烯，方法为：将所述的基因工程菌在固体活化培养基上活化后接种到一级种子培养基，活化培养后获得一级种子，将所得一级种子接种到二级种子培养基中进行种子培养得到二级种子，将二级种子接种到纤维素水解液发酵培养基中，发酵得到法尼烯。

所述固体活化培养基为YPD固体培养基，含有20g/L的葡萄糖、10g/L的酵母粉和20g/L的蛋白胨，以及琼脂；所述活化，为30℃温度下静置2d。所述一级种子培养基和二级种子培养基均为YPD液体培养基，含有20g/L的葡萄糖、10g/L的酵母粉和20g/L的蛋白胨；所述活化培养，培养温度为30℃，培养方式为摇瓶，转速180rpm，培养时间为24h；所述种子培养，培养温度为30℃，培养方式为摇瓶培养，转速180rpm，培养时间为24h；所述一级种子接种到二级种子培养基中，一级种子占二级种子培养基的5vol％。

所述发酵，发酵温度为30℃，发酵方式为摇瓶发酵，转速160rpm-180rpm，发酵时间为72-120h。所述二级种子接种到纤维素水解液发酵培养基中，二级种子占纤维素水解液发酵培养基的10vol％；发酵瓶的装液量不超过瓶总体积的1/10-1/5。

所述纤维素水解液发酵培养基的制备方法为：生物质纤维素原料粉碎后加入蒸馏水配制成悬浮液，第一次调节pH为酸性，进行第一次高温处理；冷却到室温后，第二次调节pH为碱性，进行第二次高温处理；第三次调节pH为酸性，加入混合酶A，摇床中进行水解；冷却至室温后离心取上清得到纤维素水解液发酵培养基。

所述生物质纤维素原料玉米秸秆、稻草、野草、柳枝稷中的一种或二种以上。上述原料为干燥的原料。

所述粉碎，粉碎后60目筛。

所述粉碎后的原料占加入的蒸馏水的5％(g/mL)。

所述第一次调节pH为酸性，使用6M的H₂SO₄调节pH为3。所述第一次高温处理，处理温度为105℃，处理时间为10min。

所述第二次调节pH为碱性，使用6M的NaOH调节pH为10。所述第二次高温处理，处理温度为105℃，处理时间为10min。

所述第三次调节pH为酸性，使用6M的H₂SO₄调节pH为5。所述混合酶A，包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和漆酶，纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和漆酶在混合酶A中的质量比为3:1:1:3。所述混合酶A的质量占粉碎的生物质纤维素原料质量的16％。所述第一次水解，水解温度为50℃，水解时间为3d。

所述离心，转速10000rpm/min，离心时间20min。

法尼烯产物检测：发酵结束后，通过气相色谱GC或气相色谱-质谱联用仪GC-MS对发酵产物法尼烯进行分析测定。GC检测系统为安捷伦7890A型气相色谱仪，毛细管色谱柱Agilent-DB-5MS，规格为30m×0.25mm×0.25μm。升温程序为：初始柱温为60℃，维持0.75min；以40℃/min升温速度升至300℃，维持6min；检测器温度320℃，气化室温度为250℃。

本发明有益效果：

1.本发明的基因工程菌能够利用纤维素水解液作为培养基，不需要额外添加碳源、氮源以及其他营养物质，节约了发酵成本且能够专一、高效地生产高密度燃料法尼烯。利用本发明基因工程菌发酵生产法尼烯高达到170mg/L，弥补了纤维素水解液合成法尼烯的空缺。

2.本发明利用的纤维素水解液发酵培养基，用农林生产中产生的大量废弃物，通过对原料进行简单的预处理，形成良好的纤维素水解液发酵培养基，生产成本低，经济、绿色。

3.本发明合成法尼烯的方法生产工艺不涉及高温、高压操作，经济、绿色，生产成本低。

附图说明

图1工程菌利用玉米秸秆水解液发酵合成法尼烯气相检测图。

图2工程菌利用稻草水解液发酵合成法尼烯气相检测图。

图3工程菌利用玉米秸秆及稻草水解液发酵合成法尼烯的产量图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

实施例1

一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌的构建：

目标基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌整合了法尼烯合成酶基因AaFS，磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，磷酸转酮酶基因LmPK，乙醛脱氢酶基因DzeutE，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR。

本工程菌株以酵母菌株CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2)为出发菌株，构建简单过程如下：

(1)所述的各基因通过PCR方法获得，其中，法尼烯合成酶基因AaFS来源于青蒿(Artemisia annua L.)序列登记号为GenBank:AY835398.1；磷酸乙酰转移酶基因CkPTA来源于克氏梭菌(Clostridium kluyveri)，序列登记号为GenBank:CP018335.1；磷酸转酮酶基因LmPK来源于明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，序列登记号为GenBank:AY804190.1；乙醛脱氢酶基因DzeutE来源于水稻基腐菌(Dickeyazeae)，序列登记号为GenBank:CP006929.1；羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR来源于Ruegeriapomeroyi,序列登记号为NCBIReference Sequence:NC_006569.1。

(2)构建整合片段：P_GAL1-AaFS-T_CYC1、P_GAL1-LmPK-T_CYC1_P_GAL10-CkPTA-T_ADH1_HIS、

P_GAL1-AaFS-T_CYC1_P_GAL10-DzeutE-T_ADH1_URA3、P_GAL1-AaFS-T_CYC1_P_GAL10-RpHMGR-T_ADH1_LEU2

P(OC)_GAL4-GAL4_P_GAL1-tHMG1_KanMX。将上述片段分别整合到GAL80、ALD4、ALD6、ADH5、RHR2位点。P_GAL1、_P_GAL10分别为GAL1和GAL10启动子。T_CYC1、T_ADH1为终止子。

(3)将获得的整合载体转化出发菌株，获得目标转基因工程菌株。

本工程菌株以酵母菌株CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2)为出发菌株，构建过程如下：

含法尼烯合成酶基因AaFS的酵母工程菌株构建具体过程：

(1)法尼烯合成酶基因AaFS插入酵母基因组的GAL80位点。所述的法尼烯合成酶基因来源于青蒿(Artemisia annua L.)序列登记号为GenBank:AY835398.1，该基因AaFS经过密码子优化，序列如SEQ1所示。通过BamH I和Sal I将AaFS从合成的质粒上酶切下来，连入pESC-HIS质粒，得到重组质粒pESC-HIS-AaFS。通过PCR获得P_GAL1-AaFS-T_CYC1片段，P_GAL1为GAL1启动子、T_CYC1为CYC1终止子，利用限制性内切酶NdeI和PstI将其连接到pUC19质粒中。再通过NdeI和PstI将GAL80的上游(GAL80US)511bp(其序列如SEQ2所示)、GAL80的下游(GAL80DS)501bp(其序列如SEQ3所示)、依次连入P_GAL1-AaFS-T_CYC1的两端，得到重组质粒pUC19-GAL80US-P_GAL1-AaFS-T_CYC1-GAL80DS。通过NdeI和PstI酶切获得供体片段：GAL80US-P_GAL1-AaFS-T_CYC1-GAL80DS，所用的引物见表1。

(2)以序列TAAGGCTGCTGCTGAACGT为靶标序列，构建gRNA的表达片段。通过设计引物时引入19bp的靶标序列，以线性化的pML104为模板，PCR扩增其两端的各500bpDNA序列，两个上下游片段均含有19bp的GAL80的靶标序列，再通过重叠PCR将两个片段融合到一起获得完整的gRNA表达片段，其19bp的靶序列位于gRNA表达片段的中心。所用的引物见表1。以限制性内切酶SwaI和BclI对质粒pML104进行双酶切，获得线性化质粒；将上述供体DNA片段、线性化的pML104质粒、gRNA表达片段通过化学转化法同时转入酵母感受态细胞CEN.PK2-1C，得到酵母基因工程菌FS1。

含磷酸转酮酶基因LmPK和磷酸乙酰转移酶基因CkPTA的酵母工程菌株构建。

(1)在FS1菌株基础上，通过同源重组的方式进行基因整合。磷酸乙酰转移酶基因CkPTA和磷酸转酮酶基因LmPK插入酵母基因组的ALD6位点。所述的磷酸乙酰转移酶基因CkPTA来源于克氏梭菌(Clostridium kluyveri)，序列登记号为GenBank:CP018335.1；磷酸转酮酶基因LmPK来源于明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)，序列登记号为GenBank:AY804190.1。CkPTA基因通过EcoRI和SacI连入pESC-URA质粒，得到重组质粒pESC-URA-CkPTA。LmPK基因通过BamHI和SalI连入pESC-URA-CkPTA质粒，得到重组质粒pESC-URA-LmPK-CkPTA。通过PCR获得P_GAL1-LmPK-T_CYC1_P_GAL10-CkPTA-T_ADH1片段,所用引物见表2。

(2)通过PCR获得ALD6基因的上下游片段ALD6US(539bp，其序列如SEQ4所示)及ALD6DS(557bp，其序列如SEQ5所示)，所用引物见表2。以pESC-HIS质粒为模板，通过PCR获得HIS表达片段(其序列如SEQ6所示)，所用引物见表2。通过限制性内切酶Sma I和Pst I将pUC19质粒线性化，然后通过多片段一步法快速克隆试剂盒(Hieff

Plus Multi OneStep Cloning Kit，10912ES10)将P_GAL1-LmPK-T_CYC1_P_GAL10-CkPTA-T_ADH1、ALD6US、ALD6DS、HIS连入pUC19质粒,获得重组质粒pUC19-ALD6US-P_GAL1-LmPK-T_CYC1_P_GAL10-CkPTA-T_ADH1-HIS-ALD6DS。通过SmaI和SphI酶切重组质粒获得供体片段：ALD6US-P_GAL1-LmPK-T_CYC1_P_GAL10-CkPTA-T_ADH1-HIS-ALD6DS。将供体片段转入通过化学转化法酵母菌株FS1，得到酵母菌株FS2。

含乙醛脱氢酶基因DzeutE的酵母工程菌株构建。

(1)在FS2菌株基础上，通过同源重组的方式进行基因整合。乙醛脱氢酶基因DzeutE和法尼烯合成酶基因AaFS插入酵母基因组的ALD4位点。乙醛脱氢酶基因DzeutE来源于水稻基腐菌(Dickeya zeae)，序列登记号为GenBank:CP006929.1。

DzeutE基因通过Not I和Pac I连入pESC-HIS-AaFS质粒，得到重组质粒pESC-HIS-AaFS-DzeutE。通过PCR获得P_GAL1-AaFS-T_CYC1_P_GAL10-DzeutE-T_ADH1片段,所用引物见表3。

(2)通过PCR获得ALD4基因的上下游片段ALD4US(569bp，其序列如SEQ7所示)及ALD4DS(865bp，其序列如SEQ8所示)，所用引物见表3。以pESC-URA质粒为模板，通过PCR获得URA表达片段(其序列如SEQ9所示)，所用引物见表3。将P_GAL1-AaFS-T_CYC1_P_GAL10-DzeutE-T_ADH1、ALD4US、ALD4DS、URA4个片段通过化学转化法转入酵母菌株FS2，得到酵母菌株FS3。

含羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR的酵母工程菌构建。

(1)在FS3菌株基础上，通过同源重组的方式进行基因整合。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR和法尼烯合成酶基因AaFS插入酵母基因组的ADH5位点。羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR来源于Ruegeriapomeroyi,序列登记号为NCBIReferenceSequence:NC_006569.1。本发明所述的RpHMGR为经过优化的序列，其序列如SEQ10所示

通过PCR获得RpHMGR基因，通过SpeI和Sac I连入pESC-HIS-AaFS质粒，得到重组质粒pESC-HIS-AaFS-RpHMGR。通过PCR获得P_GAL1-AaFS-T_CYC1_P_GAL10-RpHMGR-T_ADH1片段,所用引物见表4。

(2)通过PCR获得ADH5基因的上下游片段ADH5US(493bp，其序列如SEQ11所示)及ADH5DS(543bp，其序列如SEQ12所示)，所用引物见表4。以pESC-LEU质粒为模板，通过PCR获得LEU表达片段(其序列如SEQ13所示)，所用引物见表4。将P_GAL1-AaFS-T_CYC1_P_GAL10-RpHMGR-T_ADH1、ADH5US、ADH5DS、LEU 4个片段通过化学转化法转入酵母菌株FS3，得到酵母菌株FS4。

过表达酵母GAL4基因和tHMG1基因的酵母工程菌构建。

(1)在FS4菌株基础上，通过同源重组的方式进行基因整合。GAL4基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，序列登记号为NCBI Reference Sequence:NC_001148.4。所述GAL4基因含有终止密码子后面251bp的下游序列。所述GAL4基因的启动子为经过优化的GAL4启动子，其序列如SEQ14所示。tHMG1基因来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，序列登记号为NCBI Reference Sequence:NC_001145.3。其所述的tHMG1基因为缺失N端529个氨基酸的截断体，并含有终止密码子后面的225bp序列，其序列如SEQ15所示，启动子为P_GAL1启动子，其序列如SEQ16所示。GAL4基因和tHMG1插入酵母基因组的RHR2位点。

(2)将GAL4表达片段(包括启动子，编码基因及终止子序列)分为A、B、C三个片段，分别通过PCR扩增得到，所用引物见表5。tHMG1表达片段(包括启动子，编码基因及终止子序列)分为D、E两个片段，分别通过PCR扩增得到，所用引物见表5。带有loxP位点的筛选标记基因KanMX序列如SEQ17所示，以质粒pUC6为模板通过PCR获得。RHR2基因的上下有片段RHR2US(580bp，其序列如SEQ18所示)、RHR2DS(587bp，其序列如SEQ19所示)通过PCR获得，所用引物见表5。

(3)通过Overlap extension PCR将片段RHR2US和A、C和D、E和KanMX、KanMX和RHR2-DS分别融合成一个片段，再将融合好的RHR2US+A与B融合为一个片段，将这四个片段通过化学转化法同时转入酵母菌株FS4，得到酵母菌株FS5。

下调表达酵母ERG9基因的酵母工程菌构建。

(1)在FS5菌株基础上，通过同源重组的方式进行基因整合。ERG9基因来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，序列登记号为NCBI Reference Sequence:NC_001140.6。所述下调ERG9基因表达片段(包括启动子，编码基因及下游537bp序列)的启动子为MET3启动子，序列如SEQ20所示。

(2)以酵母基因组为模板，通过PCR获得ERG9基因的上下游片段ERG9US(540bp，其序列如SEQ21所示)及ERG9+ERG9DS(其序列如SEQ22所示)，所用引物见表6。以以酵母基因组为模板，通过PCR获得MET3启动子P_MET3，其序列如SEQ22所示，所用引物见表6。以质粒pESC-TRP为模板，通过PCR获得TRP表达片段，其序列如SEQ23所示，所用引物见表6。

(3)通过Overlap extension PCR将片段ERG9US和TRP融合为一个片段，将ERG9US+TRP、P_MET3及ERG9三个片段通过化学转化法同时转入酵母菌株FS5，得到酵母菌株FS6，即为本发明提供的转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌。

表1引物

表2引物

表3引物

表4引物

表5引物

表6引物

制备例1

纤维素水解液发酵培养基的制备：用粉碎机将生物质纤维素原料磨成粉末，过60目筛，收集匀质粉末；将匀质粉末添加适量蒸馏水，配制成5％(g/mL)的溶液；用6M的H₂SO₄调节pH为3，然后在105℃条件下处理10min，冷却至室温后，再利用6M的NaOH调节pH为10，再在105℃条件下处理10min；根据酶的水解pH和温度，利用6M H₂SO₄调节pH为5，分别将纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和漆酶加入上述原料粉末溶液中(即加入混合酶A)，再放置于50℃的摇床中水解3d备用；将冷却至室温的水解液在10000rpm/min离心20min，上清液用作发酵培养基备用。

纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和漆酶在混合酶A中的质量比为3:1:1:3。所述混合酶A的质量占粉碎的生物质纤维素原料质量的16％。

所述生物质纤维素原料玉米秸秆。

制备例2

纤维素水解液发酵培养基的制备：用粉碎机将生物质纤维素原料磨成粉末，过60目筛，收集匀质粉末；将匀质粉末添加适量蒸馏水，配制成5％(g/mL)的溶液；用6M的H₂SO₄调节pH为3，然后在105℃条件下处理10min，冷却至室温后，再利用6M的NaOH调节pH为10，再在105℃条件下处理10min；根据酶的水解pH和温度，利用6MH₂SO₄调节pH为5，分别将纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和漆酶加入上述原料粉末溶液中(即加入混合酶A)，再放置于50℃的摇床中水解3d备用；将冷却至室温的水解液在10000rpm/min离心20min，上清液用作发酵培养基备用。

所述生物质纤维素原料稻草。

实施例3转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌在合成法尼烯中的应用

菌种活化：取-80℃保存的实施例1构建的转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌，在YPD平板上划线，在30℃培养箱静置培养2天，挑取单菌落接种于液体培养基YPD中30℃、180rpm摇床培养24h，活化菌种，获得一级种子。

菌体发酵：将活化好的一级种子液转以2.5vol％接到含有50ml的YPD液体培养基的三角瓶中，180rpm，30℃培养24h，获得二级种子，按培养基体积5％的菌液接种量，将二级种子接种到含有50ml制备例1制备的纤维素水解液发酵培养基的三角瓶内。将发酵瓶转入30℃、160rpm～180rpm的摇床中振荡培养，12h后加入正十二烷作为萃取剂，培养72h h，利用气相色谱GC或气相色谱-质谱联用仪GC-MS对产物法尼烯进行定性定量检测。

正十二烷的加入量为发酵培养基的20vol％。

菌体发酵：将活化好的一级种子液以2.5vol％转接到含有50ml的YPD液体培养基的三角瓶中，180rpm，30℃培养24h，获得二级种子，按培养基体积5％的菌液接种量，将二级种子接种到含有50ml制备例2制备的纤维素水解液发酵培养基的三角瓶内。将发酵瓶转入30℃、160rpm～180rpm的摇床中振荡培养，12h后加入正十二烷作为萃取剂，培养120h，利用气相色谱GC或气相色谱-质谱联用仪GC-MS对产物法尼烯进行定性定量检测。

正十二烷的加入量为发酵培养基的20vol％。

法尼烯产物检测

法尼烯产物检测：通过气相色谱GC或气相色谱-质谱联用仪GC-MS对发酵产物法尼烯进行分析测定。GC检测系统为安捷伦7890A型气相色谱仪，毛细管色谱柱Agilent-DB-5MS，规格为30m×0.25mm×0.25μm。升温程序为：初始柱温为60℃，维持0.75min；以40℃/min升温速度升至300℃，维持6min；检测器温度320℃，气化室温度为250℃。

经检测，本发明提供的基因工程菌能够转化纤维素水解液合成法尼烯，并且结合本发明提供的纤维素水解液发酵培养基、及培养条件，最终发酵合成法尼烯产量达到170mg/L。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

<120> 一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用

<130>

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1725

<212> DNA

<213> AaFS优化序列

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1725)

<400> 1

atgtctactt tgccaatctc ttctgtttct ttctcttctt ctacttctcc attggttgtt 60

gacgacaagg tttctactaa gccagacgtt atcagacaca ctatgaactt caacgcttct 120

atctggggtg accaattctt gacttacgac gaaccagaag acttggttat gaagaagcaa 180

ttggttgaag aattgaagga agaagttaag aaggaattga tcactatcaa gggttctaac 240

gaaccaatgc aacacgttaa gttgatcgaa ttgatcgacg ctgttcaaag attgggtatc 300

gcttaccact tcgaagaaga aatcgaagaa gctttgcaac acatccacgt tacttacggt 360

gaacaatggg ttgacaagga aaacttgcaa tctatctctt tgtggttcag attgttgaga 420

caacaaggtt tcaacgtttc ttctggtgtt ttcaaggact tcatggacga aaagggtaag 480

ttcaaggaat ctttgtgtaa cgacgctcaa ggtatcttgg ctttgtacga agctgctttc 540

atgagagttg aagacgaaac tatcttggac aacgctttgg aattcactaa ggttcacttg 600

gacatcatcg ctaaggaccc atcttgtgac tcttctttga gaactcaaat ccaccaagct 660

ttgaagcaac cattgagaag aagattggct agaatcgaag ctttgcacta catgccaatc 720

taccaacaag aaacttctca cgacgaagtt ttgttgaagt tggctaagtt ggacttctct 780

gttttgcaat ctatgcacaa gaaggaattg tctcacatct gtaagtggtg gaaggacttg 840

gacttgcaaa acaagttgcc atacgttaga gacagagttg ttgaaggtta cttctggatc 900

ttgtctatct actacgaacc acaacacgct agaactagaa tgttcttgat gaagacttgt 960

atgtggttgg ttgttttgga cgacactttc gacaactacg gtacttacga agaattggaa 1020

atcttcactc aagctgttga aagatggtct atctcttgtt tggacatgtt gccagaatac 1080

atgaagttga tctaccaaga attggttaac ttgcacgttg aaatggaaga atctttggaa 1140

aaggaaggta agacttacca aatccactac gttaaggaaa tggctaagga attggttaga 1200

aactacttgg ttgaagctag atggttgaag gaaggttaca tgccaacttt ggaagaatac 1260

atgtctgttt ctatggttac tggtacttac ggtttgatga tcgctagatc ttacgttggt 1320

agaggtgaca tcgttactga agacactttc aagtgggttt cttcttaccc accaatcatc 1380

aaggcttctt gtgttatcgt tagattgatg gacgacatcg tttctcacaa ggaagaacaa 1440

gaaagaggtc acgttgcttc ttctatcgaa tgttactcta aggaatctgg tgcttctgaa 1500

gaagaagctt gtgaatacat ctctagaaag gttgaagacg cttggaaggt tatcaacaga 1560

gaatctttga gaccaactgc tgttccattc ccattgttga tgccagctat caacttggct 1620

agaatgtgtg aagttttgta ctctgttaac gacggtttca ctcacgctga aggtgacatg 1680

aagtcttaca tgaagtcttt cttcgttcac ccaatggttg tttaa 1725

<210> 2

<211> 511

<212> DNA

<213> GAL80US

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(511)

<400> 2

gaacctcctc cagatggaat cccttccata gagagaagga gcaagcaact gacccaatat 60

tgactgccac tggacctgaa gacatgcaac aaagtgcaag catagtgggg ccttcttcca 120

atgctaatcc ggtcactgcc actgctgcta cggaaaacca acctaaaggt attaacttct 180

tcactataag aaaatcacac gagcgcccgg acgatgtctc tgtttaaatg gcgcaagttt 240

tccgctttgt aatatatatt tatacccctt tcttctctcc cctgcaatat aatagtttaa 300

ttctaatatt aataatatcc tatattttct tcatttaccg gcgcactctc gcccgaacga 360

cctcaaaatg tctgctacat tcataataac caaaagctca taactttttt ttttgaacct 420

gaatatatat acatcacata tcactgctgg tccttgccga ccagcgtata caatctcgat 480

agttggtttc ccgttctttc cactcccgtc a 511

<210> 3

<211> 501

<212> DNA

<213> GAL80DS

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(501)

<400> 3

aaagcatctt gccctgtgct tggcccccag tgcagcgaac gttataaaaa cgaatactga 60

gtatatatct atgtaaaaca accatatcat ttcttgttct gaactttgtt tacctaacta 120

gttttaaatt tccctttttc gtgcatgcgg gtgttcttat ttattagcat actacatttg 180

aaatatcaaa tttccttagt agaaaagtga gagaaggtgc actgacacaa aaaataaaat 240

gctacgtata actgtcaaaa ctttgcagca gcgggcatcc ttccatcata gcttcaaaca 300

tattagcgtt cctgatcttc atacccgtgc tcaaaatgat caaacaaact gttattgcca 360

agaaataaac gcaaggctgc cttcaaaaac tgatccatta gatcctcata tcaagcttcc 420

tcatagaacg cccaattaca ataagcatgt tttgctgtta tcaccgggtg ataggtttgc 480

tcaaccatgg aaggtagcat g 501

<210> 4

<211> 520

<212> DNA

<213> ALD6US

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(520)

<400> 4

cgtatccaag ccgaaacggc gctcgcctca tccccacggg aataaggcag ccgacaaaag 60

aaaaacgacc gaaaaggaac cagaaagaaa aaagagggtg ggcgcgccgc ggacgtgtaa 120

aaagatatgc atccagcttc tatatcgctt taactttacc gttttgggca tcgggaacgt 180

atgtaacatt gatctcctct tgggaacggt gagtgcaacg aatgcgatat agcaccgacc 240

atgtgggcaa attcgtaata aattcggggt gagggggatt caagacaagc aaccttgtta 300

gtcagctcaa acagcgattt aacggttgag taacacatca aaacaccgtt cgaggtcaag 360

cctggcgtgt ttaacaagtt cttgatatca tatataaatg taataagaag tttggtaata 420

ttcaattcga agtgttcagt cttttacttc tcttgtttta tagaagaaaa aacatcaaga 480

aacatcttta acatacacaa acacatacta tcagaataca 520

<210> 5

<211> 540

<212> DNA

<213> ALD6DS

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(540)

<400> 5

ctttccgtca tatacacaaa atactttcat ataaacttac ttggtcttac gtcataaata 60

aatatgtata catataaatt aaaaaatttg gttttatatt tttacaaaaa gaatcgttta 120

cttcatttct cccttttaag cgatacaatc catgaaaaaa gagaaaaaga gagaacaggc 180

ttgtgccttc tttaaaacat cccacacaaa atcatattga attgaatttt acatcttaag 240

ctagtgtaca acaactgcta tatccaaaga aaactaacgt ggaccgcttt tagagttgag 300

aaaaaggttt gaaaaaaata gcaatacaaa gacttgtttc atatataaaa tacagggagc 360

acattgagct aatataacat aaacactgcg aaccaattcc aatcaaaagg tacacatgag 420

agcattcccc cgagtactgc catttcgcca tcagagatca tataataaca tccttcttcg 480

aacagtaagg ctttttggtt catcactttc ttcttttgat ttctctaggc aaatgcctaa 540

<210> 6

<211> 1106

<212> DNA

<213> HIS

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1106)

<400> 6

ctagtacact ctatattttt ttatgcctcg gtaatgattt tcattttttt ttttccccta 60

gcggatgact cttttttttt cttagcgatt ggcattatca cataatgaat tatacattat 120

ataaagtaat gtgatttctt cgaagaatat actaaaaaat gagcaggcaa gataaacgaa 180

ggcaaagatg acagagcaga aagccctagt aaagcgtatt acaaatgaaa ccaagattca 240

gattgcgatc tctttaaagg gtggtcccct agcgatagag cactcgatct tcccagaaaa 300

agaggcagaa gcagtagcag aacaggccac acaatcgcaa gtgattaacg tccacacagg 360

tatagggttt ctggaccata tgatacatgc tctggccaag cattccggct ggtcgctaat 420

cgttgagtgc attggtgact tacacataga cgaccatcac accactgaag actgcgggat 480

tgctctcggt caagctttta aagaggccct actggcgcgt ggagtaaaaa ggtttggatc 540

aggatttgcg cctttggatg aggcactttc cagagcggtg gtagatcttt cgaacaggcc 600

gtacgcagtt gtcgaacttg gtttgcaaag ggagaaagta ggagatctct cttgcgagat 660

gatcccgcat tttcttgaaa gctttgcaga ggctagcaga attaccctcc acgttgattg 720

tctgcgaggc aagaatgatc atcaccgtag tgagagtgcg ttcaaggctc ttgcggttgc 780

cataagagaa gccacctcgc ccaatggtac caacgatgtt ccctccacca aaggtgttct 840

tatgtagtga caccgattat ttaaagctgc agcatacgat atatatacat gtgtatatat 900

gtatacctat gaatgtcagt aagtatgtat acgaacagta tgatactgaa gatgacaagg 960

taatgcatca ttctatacgt gtcattctga acgaggcgcg ctttcctttt ttctttttgc 1020

tttttctttt tttttctctt gaactcgacg gatctatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 1080

gcgtaaggag aaaataccgc atcagg 1106

<210> 7

<211> 569

<212> DNA

<213> ALD4US

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(569)

<400> 7

ctacgaaata acccaatcac gacaccacgc cacgatcgcg ccagcacgag cttgcattac 60

cggcagttgc tccagcttgc tggcctctgc cagcagcaat gtcccgccct ggcgaccctc 120

tggttagatg acactcctgc cccaactgcc acgaatctgt aaccccataa ctatacccgt 180

acgcagtact aaaaatgtat gtaattagta aatgtatgta acaatttcac cgttttgtgt 240

aacaattcat tcattcattc ttttgatcct ttagtaccgt ccgcacatga tgtcatttcc 300

ccctcatttt tgtttgctgg tatgattccc cgcccgggcg acggtacggc tgttatccag 360

cgatgcggga cttccgtcca caggtatctt tttctccaac tccaacagag atggaaaatg 420

aggggcgggt gtaggtaagc agaatgagga gaaatttgta atgaaaatgg aagttcggcg 480

gttatataaa tggggggggt ttgtcggtga caattgactt cactctcctt tcctcaaaaa 540

ttcttgggtg ttaggattag aagtatctg 569

<210> 8

<211> 865

<212> DNA

<213> ALD4DS

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(865)

<400> 8

aaatattctg tctctgttat atttccacat gtcatcattt caaatatatg tactttaaag 60

aaaataaaat aaaaaataaa atttttttct cccgataatc aattttctta attaattaat 120

tgcgttacga ttccgttttt ttacttcttt tatctcatta tctatctaag ttatttaaaa 180

aaaagaaaga actttttatg aactttcctc ttttctttct tttagactat ttaaaataca 240

tcaccttggt caaacatagc atcagagacc ttgatgaaac ttgcgatatt agcacctttg 300

accaaagatg gcaagacctt accgtcctta gtgtacttct tggcatagtc gatacattca 360

ttgaaacagt tgatcataat tctcttcaac tcttggtcaa ctctttcgct agtccatgtg 420

attctttgag agttttgtgc catttctaaa ccagaaacag caacaccacc caagttagca 480

gcctttggtg gaccgtacca aacagcttcg cttggtccag tggcggtgga acgagcagtt 540

tcaaagacgg caatagcttc tggagtggaa cccatgttgg aaccttcggc aataaacttg 600

acaccttgag caaccaaggc cttggcttct tcaccgctga cttcattttg ggtggcacat 660

ggcaaagcaa tgtcgacctt ttggacgtgg gtccatggac gagcaccagc aatgtattgc 720

actttgtttt cggagaaagt agagtattcg ttgacgattt gttccaagga cttgaagttg 780

accttagcac tggaaatatc agcgacttgt tcggaggtga taccagtttc agagatgata 840

caacccttgg agtcagatag ggaaa 865

<210> 9

<211> 1150

<212> DNA

<213> URA

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1150)

<400> 9

ttcaattcat catttttttt ttattctttt ttttgatttc ggtttctttg aaattttttt 60

gattcggtaa tctccgaaca gaaggaagaa cgaaggaagg agcacagact tagattggta 120

tatatacgca tatgtagtgt tgaagaaaca tgaaattgcc cagtattctt aacccaactg 180

cacagaacaa aaacctgcag gaaacgaaga taaatcatgt cgaaagctac atataaggaa 240

cgtgctgcta ctcatcctag tcctgttgct gccaagctat ttaatatcat gcacgaaaag 300

caaacaaact tgtgtgcttc attggatgtt cgtaccacca aggaattact ggagttagtt 360

gaagcattag gtcccaaaat ttgtttacta aaaacacatg tggatatctt gactgatttt 420

tccatggagg gcacagttaa gccgctaaag gcattatccg ccaagtacaa ttttttactc 480

ttcgaagaca gaaaatttgc tgacattggt aatacagtca aattgcagta ctctgcgggt 540

gtatacagaa tagcagaatg ggcagacatt acgaatgcac acggtgtggt gggcccaggt 600

attgttagcg gtttgaagca ggcggcagaa gaagtaacaa aggaacctag aggccttttg 660

atgttagcag aattgtcatg caagggctcc ctatctactg gagaatatac taagggtact 720

gttgacattg cgaagagcga caaagatttt gttatcggct ttattgctca aagagacatg 780

ggtggaagag atgaaggtta cgattggttg attatgacac ccggtgtggg tttagatgac 840

aagggagacg cattgggtca acagtataga accgtggatg atgtggtctc tacaggatct 900

gacattatta ttgttggaag aggactattt gcaaagggaa gggatgctaa ggtagagggt 960

gaacgttaca gaaaagcagg ctgggaagca tatttgagaa gatgcggcca gcaaaactaa 1020

aaaactgtat tataagtaaa tgcatgtata ctaaactcac aaattagagc ttcaatttaa 1080

ttatatcagt tattacccta tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata 1140

ccgcatcagg 1150

<210> 10

<211> 1302

<212> DNA

<213> RpHMGR

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1302)

<400> 10

atgactggta agaccggtca tattgatggt ttgaactcca gaatcgaaaa gatgagagat 60

ttggatccag ctcaaagatt ggttagagtt gctgaagctg ctggtttgga accagaagct 120

atttctgctt tggctggtaa tggtgctttg ccattgtctt tggctaatgg tatgatcgaa 180

aacgtcatcg gtaagttcga attgccattg ggtgttgcta ctaatttcac tgttaacggt 240

agagactact tgattccaat ggctgttgaa gaaccatctg ttgttgctgc tgcttcttat 300

atggctagaa ttgctagaga aaacggtggt tttactgctc atggtactgc tccattgatg 360

agagcacaaa ttcaagttgt tggtttgggt gatccagaag gtgctagaca aagattattg 420

gctcataagg ctgcttttat ggaagctgca gatgctgttg atccagtttt ggttggttta 480

ggtggtggtt gtagagatat cgaagttcac gtttttagag atactccagt tggtgccatg 540

gttgtcttgc atttgatagt tgatgttaga gatgctatgg gtgctaacac tgttaatacc 600

atggctgaaa gattggctcc agaagttgaa agaattgctg gtggtactgt tagattgagg 660

atcttgtcta atttggccga tttgagatta gttagagcca gagttgaatt ggctcctgaa 720

actttgacta ctcaaggtta tgatggtgct gatgttgcta gaggtatggt tgaagcttgt 780

gctttagcta tcgttgatcc atatagagct gctactcata acaagggtat tatgaacggt 840

atcgatccag ttgttgttgc cactggtaat gattggagag ctattgaagc tggtgcacat 900

gcttatgctg ctagaactgg tcattatact tcattgacca gatgggaatt agccaacgat 960

ggtagattgg ttggtactat tgaattgcct ttggccttgg gtttagtagg tggtgctaca 1020

aaaactcatc caactgctag agctgcattg gctttgatgc aagttgaaac tgctactgaa 1080

ttggcacaag ttactgctgc tgtaggtttg gctcaaaaca tggctgctat tagagctttg 1140

gctactgaag gtattcaaag gggtcacatg actttacatg ctagaaacat tgctattatg 1200

gctggtgcta ctggtgcaga tattgataga gttactagag ttattgtcga agccggtgat 1260

gtttctgttg caagagctaa acaagttttg gagaacacct ga 1302

<210> 11

<211> 493

<212> DNA

<213> ADH5US

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(493)

<400> 11

acaagtagtg tcttcatgac ggattcatag tctatccaag cgtttgccca aaattttgca 60

gtaaatttaa tgttttctgt ataggataat ggtgcgccat tcaagtcccg cgaaaaatga 120

ctgatgtcta caggacaggg gcgcaatata tgttctctga cattgcacct tttgaatata 180

tcatgtgttt gttctgctat ctgcttgtag aagggtacgc taacagagcc ggcggcattg 240

taaaaagttc tcctttcgcg gaaggatgag tcaaaaagca tgtgacaatg aaataatcaa 300

attgtgacat ctgctgacgc gggatcgttc cttcgtattg tctagattgt aatctatata 360

acatactacg aatataaaag agggactaca agatatttct agcgcaaact actgctttac 420

tgtctcacaa tgtctctgat tggaagatac ctaagaaaat tatttaacta catatctaca 480

aaatcaaagc atc 493

<210> 12

<211> 543

<212> DNA

<213> ADH5DS

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(543)

<400> 12

tcttttgtaa cgaatttgat gaatatattt ttacttttta tataagctat tttgtagata 60

ttgacttttt acgatttatt tgtaacaatg agaattactc catttctgaa cttcagtaaa 120

tagcgagtga ttctgtactt tgcgagaacc ggtggacatt tggtattttg ccttacaaga 180

acaacctata caaacgtttc aatatctaat tctttgtaat ccattgtttt acgagacata 240

taatgtgata tatagatgaa ctttacgtat aaaatgatat atttaaaact agcaactgcg 300

tgcgtaagac aaactgaaat aggccattta cggaaaagaa atttaataat gtcgactgga 360

aactgaaacc aggaggagta gaaattggtt aaattgatta gctaaaattt actcgttgtg 420

gacagagttt gagccaagcg gaatgttttc aaggctttct ttgtttcgaa gggcagctct 480

ggctcctgcc cctatgagaa tgtcttttag gactatttat caaaaaaccg aggatgaatt 540

gcc 543

<210> 13

<211> 1928

<212> DNA

<213> LEU

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1928)

<400> 13

aactgtggga atactcaggt atcgtaagat gcaagagttc gaatctctta gcaaccatta 60

tttttttcct caacataacg agaacacaca ggggcgctat cgcacagaat caaattcgat 120

gactggaaat tttttgttaa tttcagaggt cgcctgacgc atataccttt ttcaactgaa 180

aaattgggag aaaaaggaaa ggtgagaggc cggaaccggc ttttcatata gaatagagaa 240

gcgttcatga ctaaatgctt gcatcacaat acttgaagtt gacaatatta tttaaggacc 300

tattgttttt tccaataggt ggttagcaat cgtcttactt tctaactttt cttacctttt 360

acatttcagc aatatatata tatatttcaa ggatatacca ttctaatgtc tgcccctatg 420

tctgccccta agaagatcgt cgttttgcca ggtgaccacg ttggtcaaga aatcacagcc 480

gaagccatta aggttcttaa agctatttct gatgttcgtt ccaatgtcaa gttcgatttc 540

gaaaatcatt taattggtgg tgctgctatc gatgctacag gtgtcccact tccagatgag 600

gcgctggaag cctccaagaa ggttgatgcc gttttgttag gtgctgtggc tggtcctaaa 660

tggggtaccg gtagtgttag acctgaacaa ggtttactaa aaatccgtaa agaacttcaa 720

ttgtacgcca acttaagacc atgtaacttt gcatccgact ctcttttaga cttatctcca 780

atcaagccac aatttgctaa aggtactgac ttcgttgttg tcagagaatt agtgggaggt 840

atttactttg gtaagagaaa ggaagacgat ggtgatggtg tcgcttggga tagtgaacaa 900

tacaccgttc cagaagtgca aagaatcaca agaatggccg ctttcatggc cctacaacat 960

gagccaccat tgcctatttg gtccttggat aaagctaatc ttttggcctc ttcaagatta 1020

tggagaaaaa ctgtggagga aaccatcaag aacgaattcc ctacattgaa ggttcaacat 1080

caattgattg attctgccgc catgatccta gttaagaacc caacccacct aaatggtatt 1140

ataatcacca gcaacatgtt tggtgatatc atctccgatg aagcctccgt tatcccaggt 1200

tccttgggtt tgttgccatc tgcgtccttg gcctctttgc cagacaagaa caccgcattt 1260

ggtttgtacg aaccatgcca cggttctgct ccagatttgc caaagaataa ggttgaccct 1320

atcgccacta tcttgtctgc tgcaatgatg ttgaaattgt cattgaactt gcctgaagaa 1380

ggtaaggcca ttgaagatgc agttaaaaag gttttggatg caggtatcag aactggtgat 1440

ttaggtggtt ccaacagtac caccgaagtc ggtgatgctg tcgccgaaga agttaagaaa 1500

atccttgctt aaaaagattc tcttttttta tgatatttgt acataaactt tataaatgaa 1560

attcataata gaaacgacac gaaattacaa aatggaatat gttcataggg tagacgaaac 1620

tatatacgca atctacatac atttatcaag aaggagaaaa aggaggatag taaaggaata 1680

caggtaagca aattgatact aatggctcaa cgtgataagg aaaaagaatt gcactttaac 1740

attaatattg acaaggagga gggcaccaca caaaaagtta ggtgtaacag aaaatcatga 1800

aactacgatt cctaatttga tattggagga ttttctctaa aaaaaaaaaa atacaacaaa 1860

taaaaaacac tcaatgacct gaccatttga tggagtttaa gtcaatacct tcttgaagca 1920

tttcccat 1928

<210> 14

<211> 549

<212> DNA

<213> PGAL4

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(549)

<400> 14

acgctgcagg tagcaaatcc cccagtattc atggaacttc cttggaggac cctgacggcg 60

acacagagat gacagacggt ggcgcaggat ccggtttaaa cgaggatccc ttaagtttaa 120

acaacaacag caagcaggtg tgcaagacac tagagactcc taacatgatg tatgccaata 180

aaacacaaga gataaacaac attgcatgga ggccccagag gggcgattgg tttgggtgcg 240

tgagcggcaa gaagtttcaa aacgtccgcg tcctttgaga cagcattcgc ccagtatttt 300

ttttattcta caaaccttct ataatttcaa agtatttaca taattctgtt cagtttaatc 360

accataatat cgttttcttt gtttagtgca attaattttt cctattgtta cttcgggcct 420

ttttctgttt tatgagctat tttttccgtc atccttccgg atccagattt tcagcttcat 480

ctccagattg tgtctacgta atgcacgcca tcattttaag agaggacaga gaagcaagcc 540

tcctgaaag 549

<210> 15

<211> 1581

<212> DNA

<213> tHMG1

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1581)

<400> 15

atggcagacc aattggtgaa aactgaagtc accaagaagt cttttactgc tcctgtacaa 60

aaggcttcta caccagtttt aaccaataaa acagtcattt ctggatcgaa agtcaaaagt 120

ttatcatctg cgcaatcgag ctcatcagga ccttcatcat ctagtgagga agatgattcc 180

cgcgatattg aaagcttgga taagaaaata cgtcctttag aagaattaga agcattatta 240

agtagtggaa atacaaaaca attgaagaac aaagaggtcg ctgccttggt tattcacggt 300

aagttacctt tgtacgcttt ggagaaaaaa ttaggtgata ctacgagagc ggttgcggta 360

cgtaggaagg ctctttcaat tttggcagaa gctcctgtat tagcatctga tcgtttacca 420

tataaaaatt atgactacga ccgcgtattt ggcgcttgtt gtgaaaatgt tataggttac 480

atgcctttgc ccgttggtgt tataggcccc ttggttatcg atggtacatc ttatcatata 540

ccaatggcaa ctacagaggg ttgtttggta gcttctgcca tgcgtggctg taaggcaatc 600

aatgctggcg gtggtgcaac aactgtttta actaaggatg gtatgacaag aggcccagta 660

gtccgtttcc caactttgaa aagatctggt gcctgtaaga tatggttaga ctcagaagag 720

ggacaaaacg caattaaaaa agcttttaac tctacatcaa gatttgcacg tctgcaacat 780

attcaaactt gtctagcagg agatttactc ttcatgagat ttagaacaac tactggtgac 840

gcaatgggta tgaatatgat ttctaaaggt gtcgaatact cattaaagca aatggtagaa 900

gagtatggct gggaagatat ggaggttgtc tccgtttctg gtaactactg taccgacaaa 960

aaaccagctg ccatcaactg gatcgaaggt cgtggtaaga gtgtcgtcgc agaagctact 1020

attcctggtg atgttgtcag aaaagtgtta aaaagtgatg tttccgcatt ggttgagttg 1080

aacattgcta agaatttggt tggatctgca atggctgggt ctgttggtgg atttaacgca 1140

catgcagcta atttagtgac agctgttttc ttggcattag gacaagatcc tgcacaaaat 1200

gttgaaagtt ccaactgtat aacattgatg aaagaagtgg acggtgattt gagaatttcc 1260

gtatccatgc catccatcga agtaggtacc atcggtggtg gtactgttct agaaccacaa 1320

ggtgccatgt tggacttatt aggtgtaaga ggcccgcatg ctaccgctcc tggtaccaac 1380

gcacgtcaat tagcaagaat agttgcctgt gccgtcttgg caggtgaatt atccttatgt 1440

gctgccctag cagccggcca tttggttcaa agtcatatga cccacaacag gaaacctgct 1500

gaaccaacaa aacctaacaa tttggacgcc actgatataa atcgtttgaa agatgggtcc 1560

gtcacctgca ttaaatccta a 1581

<210> 16

<211> 665

<212> DNA

<213> PGAL1

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(665)

<400> 16

tttcaaaaat tcttactttt tttttggatg gacgcaaaga agtttaataa tcatattaca 60

tggcattacc accatataca tatccatata catatccata tctaatctta cttatatgtt 120

gtggaaatgt aaagagcccc attatcttag cctaaaaaaa ccttctcttt ggaactttca 180

gtaatacgct taactgctca ttgctatatt gaagtacgga ttagaagccg ccgagcgggt 240

gacagccctc cgaaggaaga ctctcctccg tgcgtcctcg tcttcaccgg tcgcgttcct 300

gaaacgcaga tgtgcctcgc gccgcactgc tccgaacaat aaagattcta caatactagc 360

ttttatggtt atgaagagga aaaattggca gtaacctggc cccacaaacc ttcaaatgaa 420

cgaatcaaat taacaaccat aggatgataa tgcgattagt tttttagcct tatttctggg 480

gtaattaatc agcgaagcga tgatttttga tctattaaca gatatataaa tgcaaaaact 540

gcataaccac tttaactaat actttcaaca ttttcggttt gtattacttc ttattcaaat 600

gtaataaaag tatcaacaaa aaattgttaa tatacctcta tactttaacg tcaaggagaa 660

aaaac 665

<210> 17

<211> 1613

<212> DNA

<213> KanMX

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1613)

<400> 17

cagctgaagc ttcgtacgct gcaggtcgac aacccttaat ataacttcgt ataatgtatg 60

ctatacgaag ttattaggtc tagagatctg tttagcttgc ctcgtccccg ccgggtcacc 120

cggccagcga catggaggcc cagaataccc tccttgacag tcttgacgtg cgcagctcag 180

gggcatgatg tgactgtcgc ccgtacattt agcccataca tccccatgta taatcatttg 240

catccataca ttttgatggc cgcacggcgc gaagcaaaaa ttacggctcc tcgctgcaga 300

cctgcgagca gggaaacgct cccctcacag acgcgttgaa ttgtccccac gccgcgcccc 360

tgtagagaaa tataaaaggt taggatttgc cactgaggtt cttctttcat atacttcctt 420

ttaaaatctt gctaggatac agttctcaca tcacatccga acataaacaa ccatgggtaa 480

ggaaaagact cacgtttcga ggccgcgatt aaattccaac atggatgctg atttatatgg 540

gtataaatgg gctcgcgata atgtcgggca atcaggtgcg acaatctatc gattgtatgg 600

gaagcccgat gcgccagagt tgtttctgaa acatggcaaa ggtagcgttg ccaatgatgt 660

tacagatgag atggtcagac taaactggct gacggaattt atgcctcttc cgaccatcaa 720

gcattttatc cgtactcctg atgatgcatg gttactcacc actgcgatcc ccggcaaaac 780

agcattccag gtattagaag aatatcctga ttcaggtgaa aatattgttg atgcgctggc 840

agtgttcctg cgccggttgc attcgattcc tgtttgtaat tgtcctttta acagcgatcg 900

cgtatttcgt ctcgctcagg cgcaatcacg aatgaataac ggtttggttg atgcgagtga 960

ttttgatgac gagcgtaatg gctggcctgt tgaacaagtc tggaaagaaa tgcataagct 1020

tttgccattc tcaccggatt cagtcgtcac tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat 1080

ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat tgatgttgga cgagtcggaa tcgcagaccg 1140

ataccaggat cttgccatcc tatggaactg cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa 1200

acggcttttt caaaaatatg gtattgataa tcctgatatg aataaattgc agtttcattt 1260

gatgctcgat gagtttttct aatcagtact gacaataaaa agattcttgt tttcaagaac 1320

ttgtcatttg tatagttttt ttatattgta gttgttctat tttaatcaaa tgttagcgtg 1380

atttatattt tttttcgcct cgacatcatc tgcccagatg cgaagttaag tgcgcagaaa 1440

gtaatatcat gcgtcaatcg tatgtgaatg ctggtcgcta tactgctgtc gattcgatac 1500

taacgccgcc atccagtgtc gaaaacgagc tctcgagaac ccttaatata acttcgtata 1560

atgtatgcta tacgaagtta ttaggtgata tcagatccac tagtggccta tgc 1613

<210> 18

<211> 580

<212> DNA

<213> RHR2US

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(580)

<400> 18

gacatggcat ggccccgaag gctttttttg tctgtcttcc ttgggtctta ccccgccacg 60

cgttaatagt gagacaagca ggaaatccgt atcattttct cgcatacacg aacccgcgtg 120

cgcctggtaa attgcaggat tctcattgtc cggttttctt tatgggaata atcatcatca 180

ccattatcac tgttactctt gcgatcatca tcattaacat aattttttta acgctgtttg 240

atgatggtat gtgcttttat tgttccttac tcaccttttc ctttgtgtct tttaattttg 300

accattttga ccattttgac ctttgatgat gtgtgagttc ctcttttctt tttttctttt 360

cttttttcct ttttttttct tttcttactc tgttaatcac tttctttcct ttttgttcat 420

attgtcgtct tgttcatttt cgttcaattg ataatgtata taaatctttc gtaagtatct 480

cttgattgcc atttttttct ttccaagttt ccttgttatg aaacgtttca atgttttaaa 540

atatatcaga acaacaaaag caaatataca aaccatcgca 580

<210> 19

<211> 587

<212> DNA

<213> RHR2DS

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(587)

<400> 19

ttttctttta tttttttgat aaaactacta cgctaaaaat aaaataaaaa tgtatgattt 60

ccctccattt ccgaccaatt gtataatttt atatctgcat gacttaataa tataatataa 120

tacttataaa atacgaatag aaaaatttaa accgatgtaa tgcatccttt tctttgtcgt 180

cttcggatga tctgccgtga caggtggttc gcgcaaatca agctggttta gagaatttaa 240

cacagaaata aaaaaggaag attcaatctt cgtttttgtt ttatatctta ctataaaagt 300

gttttttttt agtacgacga gaagttagag taattataaa aggaatgctt atttaaattt 360

atttcttaga cttcttttca gacttcttag cagcctcagt ttgttcctta acgaccttct 420

taacaatctt ttgttcttca atcaagaaag ctctgacgat tctttccttg acacagttgg 480

cacatctgga accaccgtaa gctctggaaa cagtcttgtg ggtcttggag acagtagcgt 540

attgtcttgg tctcaaagtg gaaatacctt gtagagcact accacag 587

<210> 20

<211> 534

<212> DNA

<213> PMET3

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(534)

<400> 20

tggtataagg tgagggggtc cacagatata acatcgttta atttagtact aacagagact 60

tttgtcacaa ctacatataa gtgtacaaat atagtacaga tatgacacac ttgtagcgcc 120

aacgcgcatc ctacggattg ctgacagaaa aaaaggtcac gtgaccagaa aagtcacgtg 180

taattttgta actcaccgca ttctagcggt ccctgtcgtg cacactgcac tcaacaccat 240

aaaccttagc aacctccaaa ggaaatcacc gtataacaaa gccacagttt tacaacttag 300

tctcttatga agttacttac caatgagaaa tagaggctct ttctcgagaa atatgaatat 360

ggatatatat atatatatat atatatatat atatatatat gtaaacttgg ttctttttta 420

gcttgtgatc tctagcttgg gtctctctct gtcgtaacag ttgtgatatc gtttcttaac 480

aattgaaaag gaactaagaa agtataataa taacaagaat aaagtataat taac 534

<210> 21

<211> 520

<212> DNA

<213> ERG9US

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(520)

<400> 21

gagttaagtg tggcgtgtgg aaaagtgcag ctcagagccc ccagcaccag tattagaggt 60

cataatgggc tgcgaagcct gctaaaatgc agtggaggcc gtgtaccctt tgccaaattg 120

gctattggaa tcggcagaga acctgggtcc cgttctagag accctgcgag cgtgtcccgg 180

tgggttctgg gagctctaac tccgcaggaa ctacaaacct tgcttacaca gagtgaacct 240

gctgcctggc gtgctctgac tcagtacatt tcatagccca tcttcaacaa caataccgac 300

ttaccatcct atttgctttg ccctttttct tttccactgc actttgcatc ggaaggcgtt 360

atcggttttg ggtttagtgc ctaaacgagc agcgagaaca cgaccacggg ctatataaat 420

ggaaagttag gacaggggca aagaataaga gcacagaaga agagaaaaga cgaagagcag 480

aagcggaaaa cgtatacacg tcacatatca cacacacaca 520

<210> 22

<211> 1847

<212> DNA

<213> ERG9+ERG9DS

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1847)

<400> 22

atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60

aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120

cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180

catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240

atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300

gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360

gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420

caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480

gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540

tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600

aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660

accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720

gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780

ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840

ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900

gttatggcca ttgcaacctt ggctttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960

gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020

tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080

ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140

taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200

aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtacaag 1260

ttcaatatgg ttttatctat catcttgtcc gttcttcttg ggttttatta tatatacact 1320

ttacacagag cgtgaccaaa taacataaac aaacaactcc gaacaataac taagtactta 1380

cataataggt agaggcctat ccttaaagat aaccttatat ttcattacat caactaattc 1440

gaccttatta tctttcgaat tgaaatgcat tatacccatc ggtacgtcta gctttgtcac 1500

cttccccagt aaacgctgtt tcttgccgac aaacaatgtg gccctctctc cgtcaatctg 1560

taacgaccca aatcgtatta aagtttcgcc gtcctgttca ctgaaccttc cctcatttgg 1620

agaatctctc ctcgccagcg acgcaaagtc cttaggcaac tctagttcac cttgaatctc 1680

cagcatcatc atcccaagcg gtgttatcac cgtggtctgc ttttctcttg actgtgtcaa 1740

cttctgccat tgactagcat ctatatctac actaggcatt cttttcagct gtttattggg 1800

ctgaatgata gtgataattc ttttttctat cactcctttg gctatat 1847

<210> 23

<211> 1185

<212> DNA

<213> TRP

<220>

<221> DNA

<222> (1)..(1185)

<400> 23

aacgacatta ctatatatat aatataggaa gcatttaata gacagcatcg taatatatgt 60

gtactttgca gttatgacgc cagatggcag tagtggaaga tattctttat tgaaaaatag 120

cttgtcacct tacgtacaat cttgatccgg agcttttctt tttttgccga ttaagaatta 180

attcggtcga aaaaagaaaa ggagagggcc aagagggagg gcattggtga ctattgagca 240

cgtgagtata cgtgattaag cacacaaagg cagcttggag tatgtctgtt attaatttca 300

caggtagttc tggtccattg gtgaaagttt gcggcttgca gagcacagag gccgcagaat 360

gtgctctaga ttccgatgct gacttgctgg gtattatatg tgtgcccaat agaaagagaa 420

caattgaccc ggttattgca aggaaaattt caagtcttgt aaaagcatat aaaaatagtt 480

caggcactcc gaaatacttg gttggcgtgt ttcgtaatca acctaaggag gatgttttgg 540

ctctggtcaa tgattacggc attgatatcg tccaactgca tggagatgag tcgtggcaag 600

aataccaaga gttcctcggt ttgccagtta ttaaaagact cgtatttcca aaagactgca 660

acatactact cagtgcagct tcacagaaac ctcattcgtt tattcccttg tttgattcag 720

aagcaggtgg gacaggtgaa cttttggatt ggaactcgat ttctgactgg gttggaaggc 780

aagagagccc cgaaagctta cattttatgt tagctggtgg actgacgcca gaaaatgttg 840

gtgatgcgct tagattaaat ggcgttattg gtgttgatgt aagcggaggt gtggagacaa 900

atggtgtaaa agactctaac aaaatagcaa atttcgtcaa aaatgctaag aaataggtta 960

ttactgagta gtatttattt aagtattgtt tgtgcacttg cctgcaggcc ttttgaaaag 1020

caagcataaa agatctaaac ataaaatctg taaaataaca agatgtaaag ataatgctaa 1080

atcatttggc tttttgattg attgtacagg aaaatataca tcgcaggggg ttgactttta 1140

ccatttcacc gcaatggaat caaacttgtt gaagagaatg ttcac 1185

Claims

1.一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌，其特征在于，该基因工程菌的出发菌株为酵母菌，所述酵母菌整合了法尼烯合成酶基因AaFS，磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，磷酸转酮酶基因LmPK，乙醛脱氢酶基因DzeutE，羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR。

2.根据权利要求1所述的转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述法尼烯合成酶基因AaFS，GenBank:AY835398.1；磷酸乙酰转移酶基因CkPTA，GenBank:CP018335.1；磷酸转酮酶基因LmPK，GenBank:AY804190.1；乙醛脱氢酶基因DzeutE，GenBank:CP006929.1；羟甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因RpHMGR,NCBI ReferenceSequence:NC_006569.1。

3.根据权利要1或2所述的转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌，其特征在于，所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，基因型为：CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3_112；his3Δ1；MAL2-8c；SUC2)。

4.一种权利要求1-3任意一项所述的转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌在合成法尼烯中的应用，其特征在于，将所述的基因工程菌在固体活化培养基上活化后接种到一级种子培养基，活化培养后获得一级种子，将所得一级种子接种到二级种子培养基中进行种子培养得到二级种子，将二级种子接种到纤维素水解液发酵培养基中，发酵得到法尼烯。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述一级种子培养基和二级种子培养基均为YPD液体培养基，含有20g/L的葡萄糖、10g/L的酵母粉和20g/L的蛋白胨；所述活化培养，培养温度为30℃，培养方式为摇瓶，转速180rpm，培养时间为24h；所述种子培养，培养温度为30℃，培养方式为摇瓶培养，转速180rpm，培养时间为24h；所述一级种子接种到二级种子培养基中，一级种子占二级种子培养基的5vol％。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵，发酵温度为30℃，发酵方式为摇瓶发酵，转速160rpm-180rpm，发酵时间为72h-120h；所述二级种子接种到纤维素水解液发酵培养基中，二级种子占纤维素水解液发酵培养基的10vol％；发酵瓶的装液量不超过瓶总体积的1/10-1/5。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述纤维素水解液发酵培养基的制备方法为：生物质纤维素原料粉碎后加入蒸馏水配制成悬浮液，第一次调节pH为酸性，进行第一次高温处理；冷却到室温后，第二次调节pH为碱性，进行第二次高温处理；第三次调节pH为酸性，加入混合酶A，摇床中进行水解；冷却至室温后离心取上清得到纤维素水解液发酵培养基。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述生物质纤维素原料玉米秸秆、稻草、野草、柳枝稷中的一种或二种以上；所述粉碎后的原料占加入的蒸馏水的5％(g/mL)。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述第一次调节pH为酸性，使用6M的H₂SO₄调节pH为3。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述第一次高温处理，处理温度为105℃，处理时间为10min；所述第二次调节pH为碱性，使用6M的NaOH调节pH为11；所述第二次高温处理，处理温度为105℃，处理时间为10min；所述第三次调节pH为酸性，使用6M的H₂SO₄调节pH为5；所述混合酶A，包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和漆酶，纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶和漆酶在混合酶A中的质量比为3:1:1:3；所述混合酶A的质量占粉碎的生物质纤维素原料质量的16％；所述水解温度为50℃，水解时间为3d；所述离心，转速10000rpm/min，离心时间20min。