CN112080440A - 一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌及其应用，属于合成生物学技术领域。本发明筛选获得了在酿酒酵母中转化效率较高的法尼烯合成酶Fsso；构建不同拷贝数HMG1和甲羟戊酸途径全部基因强化法尼烯合成菌株，确认单拷贝和双拷贝HMG1最有利于法尼烯的持续合成积累；用GAL启动子同时控制HMG1和Fsso的表达可进一步提高法尼烯的积累量。本发明构建的法尼烯合成菌株基因操作简单，摇瓶发酵最高能够积累1.11g/L法尼烯。
Description
技术领域
本发明涉及一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌及其应用，属于合成生物学领域。
背景技术
自然界中，法尼烯(farnesene)存在α-法尼烯和β-法尼烯两种倍型。农业上，法尼烯可以抵御害虫对庄稼的攻击；工业上，法尼烯因其高度疏水性和高密度储能性可以作为石油的替代品；医药业上，法尼烯可以用作合成维生素E的前体。法尼烯在植物中的含量很低，通过植物萃取需要消耗大量的人力和物力；通过化学合成难以获得单一倍型产物；微生物因其生长迅速、合成特异性强、底物成本低等优点成为法尼烯合成研究重点。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最简单的真核模式微生物，成熟快速的基因操作技术和内源性甲羟戊酸途径的存在使酿酒酵母成为了萜类化合物合成研究的热点。
为了提高甲羟戊酸途径提供萜类化合物合成前体的效率，有研究利用过表达HMG-CoA还原酶编码基因(HMG1)或者HMG-CoA还原酶活性区域编码基因(tHMG1)提高甲羟戊酸代谢途径限速步骤HMG-CoA还原酶的量。同时，也有研究利用过表达甲羟戊酸途径所有基因可以提高甲羟戊酸途径的代谢流，但到目前为止，没有出现阐述不同甲羟戊酸途径强化方式和法尼烯合成酶的表达对法尼烯合成影响的相关报道。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明提供了一种生产法尼烯的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌。该酿酒酵母工程菌的构建为酿酒酵母倍半萜化合物平台菌株的构建提供了有效的策略。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌，所述酿酒酵母工程菌染色体整合表达强化甲羟戊酸途径基因，同时整合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso；所述的甲羟戊酸途径基因为HMG1、ERG20、IDI1、ERG10、ERG12、ERG13、ERG8和MVD1中的一种或多种；所述甲羟戊酸途径基因为单拷贝或双拷贝，所述整合表达使用GAL启动子(GAL10-GAL1)。
进一步地，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为宿主。
进一步地，所述酿酒酵母工程菌以pMD-19T simple为整合表达载体。
进一步地，所述Fsso的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述酿酒酵母工程菌在生产法尼烯中的应用。
进一步地，将上述酿酒酵母工程菌先在YPD固体平板划线，30℃培养箱培养2-3d活化；接种活化后得到的单菌落到YPD培养基中培养18-24h进行种子培养；取种子培养液接种到YPD培养基中进行发酵，生产法尼烯。
进一步地，所述种子液的接种体积比为1-5％；所述发酵的条件为28-32℃，200-220rpm，发酵50-100h。
有益效果：本发明筛选获得了在酿酒酵母中转化效率较高的法尼烯合成酶Fsso；构建不同拷贝数HMG1和甲羟戊酸途径全部基因强化法尼烯合成菌株，确认单拷贝和双拷贝HMG1最有利于法尼烯的持续合成积累；用GAL启动子同时控制HMG1和Fsso的表达可进一步提高法尼烯的积累量。本发明构建的法尼烯合成菌株基因操作简单，摇瓶发酵最高能够积累1.11g/L法尼烯。本发明系统比较了不同强化方式对法尼烯合成的影响，构建了一株法尼烯高效合成菌株，具有工业化应用前景。
附图说明
图1是本发明流程示意图。
图2是质粒Ts-80XTPap示意图。
图3是质粒Ts-80XTPso示意图。
图4是质粒Ts-80XTPaa示意图。
图5是质粒Ts-80XTPcj示意图。
图6是不同法尼烯合成酶编码基因效果比较。
图7是质粒Ts-HIS3-HPE示意图。
图8是质粒Ts-TRP1-HPI示意图。
图9是质粒Ts-LYS2-HP10示意图。
图10是质粒Ts-LEU2-8P19示意图。
图11是质粒Ts-URA3-12P13示意图。
图12是不同基因操作对工程菌合成法尼烯的影响比较。
图13是质粒Ts-HIS3-HP示意图。
图14是质粒Ts-TRP1-HP示意图。
图15是质粒Ts-LYS2-HP示意图。
图16是质粒Ts-80XTP101so示意图。
具体实施方式
发酵及种子培养基：YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖)，发酵时加入10％十二烷(V/V)，使用前115℃灭菌20min。
测定发酵液中法尼烯浓度的方法：仪器：Thermo Fisher U3000高效液相系统；色谱柱：Waters C18柱(250×4.6mm,5μm)；流动相：甲醇、乙腈和水混合物(90:5:5)；检测条件：紫外232nm，流速0.8mL/min，柱温40℃。标准品：β-法尼烯(SIGAMA)。
醋酸锂转化的方法：收集4mL菌液，离心收集菌体，用无菌水和0.1M醋酸锂溶液分别洗涤，然后依次加入240μL 50％PEG3350溶液、36μL 1M醋酸锂溶液、50μL鲑鱼精溶液和50μL线性化转化产物，混匀，30℃培养环境静置30min。42℃热激25min，30℃，200rpm后培养1h。
通过从酿酒酵母基因组DNA扩增了相关基因、启动子和终止子构建了过表达的甲羟戊酸途径；经密码子优化和基因合成构建了法尼烯合成工程菌株。法尼烯合成工程菌株构建流程见图1。
本发明中涉及到的酿酒酵母YPH499、酿酒酵母CICC 31906均可通过购买获得。
下述实施例中所用到的菌株如表1所示。
表1菌株
下述实施例中所用到的引物如表2所示。
表2引物
实施例1：酿酒酵母法尼烯合成菌株构建
1.1植物来源法尼烯合成酶编码基因密码子优化和整合表达质粒构建
通过NCBI和SoyBase获得苹果(Fsap，GenBank:AY787633.1)、大豆(Fsso，Glyma.13G321100)、黄花蒿(Fsaa，GenBank:AF374462.1)和香橙(Fscj，GenBank:AY835398.1)来源法尼烯合成酶编码基因序列，序列发送至苏州金唯智生物科技有限公司进行密码子优化和基因合成。将密码子优化后的Fsap(SEQ ID NO.1)、Fsso(SEQ ID NO.2)、Fsaa(SEQ ID NO.3)和Fscj(SEQ ID NO.4)分别连接至pUC57载体，得到质粒pUC57-Fsap、pUC57-Fsso、pUC57-Fsaa、pUC57-Fscj，保存宿主为大肠杆菌JM109。将质粒pUC57-Fsso、pUC57-Fsaa和pUC57-Fscj用SalI和NheI消化，胶回收得到获得片段Fsso、Fsaa和Fscj，pUC57-Fsap用BamHI和SalI消化，胶回收得到获得片段Fsap。
以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P54和P55、P52和P53分别扩增获得PTDH3和TTPI1；以PMGKR质粒为模板，用引物P50和P51扩增获得loxp-KANMX-loxp(SEQ ID NO.5)，用引物P50和P55进行融合PCR获得loxp-KANMX-loxp-TTPI1-PTDH3；连接到pMD-19T simple载体上，获得质粒Ts-XTP。以质粒Ts-XTP为模板，用引物P56和P57、P58和P59分别进行反向PCR，分别用SalI和NheI、BamHI和SalI进行消化后与片段Fsap、Fsso、Fsaa和Fscj连接获得整合表达质粒Ts-XTPap，Ts-XTPso，Ts-XTPaa和Ts-XTPcj。Ts-XTPap和Ts-XTPso用XbaI消化，胶回收分别获得XTPap和XTPso；Ts-XTPaa和Ts-XTPcj用AflII消化，胶回收得到获得XTPaa和XTPcj。
以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P60和P61扩增获得GAL80，连接到pMD-19T simple载体上获得Ts-GAL80，用引物P62和P93、P64和P65进行反向PCR，分别用XbaI和AflII消化后与载体XTPap、XTPso、XTPaa、XTPcj分别连接获得Ts-80XTPap(图2)，Ts-80XTPso(图3)，Ts-80XTPaa(图4)和Ts-80XTPcj(图5)。
1.2整合表达质粒线性化转化酿酒酵母
将整合表达质粒Ts-80XTPap，Ts-80XTPso，Ts-80XTPaa和Ts-80XTPcj用SacII线性化，醋酸锂转化酿酒酵母YPH499，涂布含500μg/mL G418的YPD平板，随机挑取转化子进行菌落PCR初筛，然后提取基因组进行特定条带PCR确认，分别得到菌株WHF3，WHF4，WHF5和WHF6。
YPD固体平板划线，30℃培养箱培养2-3d活化菌株YPH499，WHF3，WHF4。单菌落接种到20mL YPD液体培养基活化培养18-24h作为种子液，按照2％的接种量(V/V)转接到30mL发酵培养基中，30℃，200rpm培养72h，测定法尼烯的积累。结果如图6所示，YPH499发酵萃取剂中未检测到法尼烯的存在，Fsap，Fsso，Fsaa和Fscj在酿酒酵母中均成功显现法尼烯合成酶活性，WHF3，WHF4，WHF5和WHF6发酵液中法尼烯的浓度分别为3.20±0.45，69.66±0.65，22.25±0.23和17.46±1.97mg/L。因此，Fsso编码的法尼烯合成酶在酿酒酵母中转化能力明显强于Fsap，Fsaa和Fscj。
实施例2：强化甲羟戊酸代谢途径提高工程菌法尼烯合成能力
2.1甲羟戊酸途径基因强化整合表达质粒构建
以酿酒酵母YPH499基因组为模板，引物P5和P6、P7和P8和P9和P10分别扩增HMG1，PGAL10-PGAL1和ERG20；利用引物P5和P10通过融合PCR扩增获得HP20，将其连接到pMD-19Tsimple载体上；测序正确后用SmaI消化，胶回收得到HP20。以酿酒酵母CICC 31906基因组为模板，引物P1和P2、P3和P4分别扩增后进行融合，连接到pMD-19T simple载体上，获得质粒Ts-HIS3(R)，SmaI消化后与HP20连接，获得整合表达质粒Ts-HIS3-HPE(图7)。
以酿酒酵母YPH499基因组为模板，引物P15和P6、P7和P16、P17和P18分别扩增HMG1，PGAL10-PGAL1和IDI1，通过融合PCR扩增获得HPI，连接到pMD-19T simple载体上，测序正确后用BamHI和AflII消化，胶回收得到HPI。以酿酒酵母CICC 31906基因组为模板，引物P11和P14扩增TRP1基因编码区和编码区前800bp左右区域，连接到pMD-19T simple载体上，引物P12和P13反向PCR产物用BamHI和AflII消化后与HPI连接，获得整合表达质粒Ts-TRP1-HPI(图8)。
以酿酒酵母YPH499基因组为模板，引物P23和P6、P7和P24、P25和P26分别扩增HMG1，PGAL10-PGAL1和ERG10，通过融合PCR扩增获得HP10，连接到pMD-19T simple载体上，测序正确后用BamHI和SalI消化，胶回收得到HP10。以酿酒酵母CICC 31906基因组为模板，引物P19和P20扩增LYS2基因编码区和编码区前800bp左右区域，连接到pMD-19T simple载体上，引物P21和P22反向PCR产物用BamHI和SalI消化后与HP10连接，获得整合表达质粒Ts-LYS2-HP10(图9)。
以酿酒酵母YPH499基因组为模板，引物P41和P42、P43和P44和P45和P46分别扩增ERG8，PGAL10-PGAL1和ERG19，通过融合PCR扩增获得8P19，连接到pMD-19T simple载体上，测序正确后用BamHI和SalI消化，胶回收得到8P19。以酿酒酵母CICC 31906基因组为模板，引物P37和P38扩增LEU2基因编码区和编码区前800bp左右区域，连接到pMD-19T simple载体上，引物39和P40反向PCR产物用BamHI和SalI消化后与8P19连接，获得整合表达质粒Ts-LEU2-8P19(图10)。
以酿酒酵母YPH499基因组为模板，引物P31和P32、P33和P34和P35和P36分别扩增ERG12，PGAL10-PGAL1和ERG13，通过融合PCR扩增获得12P13，连接到pMD-19T simple载体上，测序正确后用AflII和SalI消化，胶回收得到12P13。以酿酒酵母CICC 31906基因组为模板，引物P27-28扩增URA3基因编码区和编码区前800bp左右区域，连接到pMD-19T simple载体上，引物P29-30反向PCR产物用AflII和SalI消化后与12P13连接，获得整合表达质粒Ts-URA3-12P13(图11)。
2.2整合表达质粒线性化转化酿酒酵母
SacII线性化整合表达质粒Ts-HIS3-HPE，Ts-TRP1-HPI，Ts-LEU2-8P19和Ts-URA3-12P13，SmaI线性化整合表达质粒Ts-LYS2-HP10，整合表达质粒Ts-80XTPso用SacII线性化，线性化产物依次醋酸锂转化酿酒酵母WHF4，涂布含500μg/mL G418的YPD平板，正确转化菌株命名为WHF8。
YPD固体平板划线，30℃培养箱培养2-3d活化菌株WHF8。单菌落接种到20mL YPD液体培养基活化培养18-24h作为种子液，按照2％的接种量转接到30mL发酵培养基中，30℃，200rpm培养72h，测定法尼烯的积累。如图12所示，WHF8发酵液中法尼烯的浓度为187.19±7.31mg/L。强化甲羟戊酸途径所有基因及ERG20使法尼烯的积累提高了1.69倍。
实施例3：染色体整合不同拷贝数HMG1对法尼烯合成的影响
3.1染色体整合HMG1表达质粒构建
以酿酒酵母YPH499基因组为模板，引物P5和P6、P7和P48分别扩增HMG1和PGAL10-PGAL1，通过融合PCR扩增获得HP，连接到pMD-19T simple载体上，测序正确后用SmaI和SalI消化，胶回收得到HP，补齐粘性末端为平末端。以Ts-HIS3(R)为模板，用引物P2和P3进行反向PCR扩增，SmaI和SalI消化获得载体。片段与载体连接，获得整合表达质粒Ts-HIS3-HP(图13)。
以酿酒酵母YPH499基因组为模板，引物P47和P6、P7和P49分别扩增HMG1，PGAL10-PGAL1，通过融合PCR扩增获得HP，连接测序正确后用BamHI和AflII消化，胶回收得到HP。以酿酒酵母CICC 31906基因组为模板，引物P11和P14扩增TRP1基因编码区和编码区前800bp左右区域，连接到pMD-19T simple载体上，引物P12和P13反向PCR产物用BamHI和AflII消化后与HP连接，获得整合表达质粒Ts-TRP1-HP(图14)。
以酿酒酵母YPH499基因组为模板，引物P23和P6、P7和P49分别扩增HMG1，PGAL10-PGAL1，通过融合PCR扩增获得HP，连接到pMD-19T simple载体上，测序正确后用BamHI和SalI消化，胶回收得到HP。以酿酒酵母CICC 31906基因组为模板，引物P19-20扩增LYS2基因编码区和编码区前800bp左右区域，连接到pMD-19T simple载体上，引物P21-22反向PCR产物用BamHI和SalI消化后与HP连接，获得整合表达质粒Ts-LYS2-HP(图15)。
3.2整合表达质粒线性化转化酿酒酵母
SmaI线性化整合表达质粒Ts-LYS2-HP，SacII线性化整合表达质粒Ts-TRP1-HP和Ts-HIS3-HP，依次醋酸锂转化酿酒酵母WHF4，涂布含500μg/mL G418的YPD平板，正确转化菌株分别命名为WH10、WH11和WHF18。
YPD固体平板划线，30℃培养箱培养2-3d活化菌株WH10，WH11和WHF18。单菌落接种到20mL YPD液体培养基活化培养18-24h作为种子液，按照2％的接种量转接到30mL发酵培养基中，30℃，200rpm培养120h，测定法尼烯的积累。如图12所示，菌株WH10和WH11法尼烯的积累量高于WHF18，WH10，WH11和WHF18分别为250.94±18.28，417.76±16.30和176.29±4.30mg/L。通过调整染色体上HMG1的拷贝数，菌株的生长负担减小，法尼烯的合成能力得到增强。
实施例4：考察GAL启动子替换TDH3启动子控制Fsso对生物量和法尼烯合成的影响
4.1 PGAL1-Fsso-TTPI1整合表达质粒的构建
以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P67和P68与P52和P66扩增获得PGAL10-PGAL1和TTPI1，以PMGKR质粒为模板，用引物P50和P51扩增获得loxp-KANMX-loxp(SEQ IDNO.5)，用引物进行融合PCR获得loxp-KANMX-loxp-TTPI1-PGAL10-PGAL1，连接到pMD-19Tsimple载体上获得Ts-XTP101。用引物P69-70进行反向PCR扩增，EcoRI和BamHI消化获得载体。以pUC57-Fsso为模板，用引物P71-72扩增获得Fsso，连接到pMD-19T simple载体上获得Ts-Fsso，测序正确后用EcoRI和BamHI消化，胶回收得到获得Fsso。片段与载体连接获得Ts-XTP101so。XbaI和AflII消化，胶回收得到loxp-KANMX-loxp-TTPI1-Fsso-PGAL10-PGAL1。以酿酒酵母YPH499基因组为模板，用引物P62和P65进行反向PCR扩增，XbaI和AflII消化后与loxp-KANMX-loxp-TTPI1-PGAL10-PGAL1连接获得Ts-80XTP101so(图16)。
4.2整合表达质粒线性化转化酿酒酵母
将整合表达质粒Ts-80XTP101so用SacII线性化，SacII线性化整合表达质粒Ts-HIS3-HPE，Ts-TRP1-HPI，Ts-LEU2-8P19和Ts-URA3-12P13，SmaI线性化整合表达质粒Ts-LYS2-HP10，SmaI线性化整合表达质粒Ts-LYS2-HP，SacII线性化整合表达质粒Ts-TRP1-HP和Ts-HIS3-HP，线性化产物醋酸锂转化酿酒酵母YPH499，涂布含500μg/mL G418的YPD平板，随机挑取转化子进行菌落PCR初筛，然后提取基因组进行特定条带PCR确认正确转化菌株命名为WH32、WH34、WH18和WH19。
YPD固体平板划线，30℃培养箱培养2-3d活化菌株WH32、WH34、WH18和WH19。单菌落接种到20mL YPD液体培养基活化培养18-24h作为种子液，按照2％的接种量转接到30mL发酵培养基中，30℃，200rpm培养168h，测定不同菌株的生物量和法尼烯积累量。如图12所示，WH18和WH19可以合成法尼烯的浓度达到1087.66±27.80和1113.17±91.45mg/L。与WH10和WH11相比，通过GAL启动子同时控制HMG1和Fsso的表达，WH18和WH19合成法尼烯的能力得到了大幅度提升。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种生产法尼烯的酿酒酵母工程菌及其应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggaattta gagttcattt gcaggctgac aatgaacaaa aaatttttca gaaccaaatg 60
aagccagagc cagaagcatc ttacttgatt aaccaaagaa ggtctgcaaa ttacaagcca 120
aatatttgga aaaatgattt tttagatcag tctttaattt ctaaatatga tggtgatgaa 180
tatagaaaat tgtcagaaaa attaattgag gaagtcaaga tttatatttc tgctgaaaca 240
atggatttgg ttgctaaatt agagttaatt gactctgtta gaaagttagg tttggctaat 300
ttatttgaaa aagaaattaa agaggcttta gattctattg ctgctataga atctgataat 360
ttgggtacta gagacgactt gtatggtaca gcattacatt tcaaaatttt gagacaacat 420
ggatacaagg tctcacaaga tatattcggt agatttatgg atgaaaaagg tactttggag 480
aatcatcatt ttgcacattt gaaaggtatg ttggagttat ttgaagcttc aaatttaggt 540
tttgaaggag aagacatttt agatgaagct aaggcttctt tgactttggc tttgagagat 600
tcaggtcata tatgctaccc agactctaac ttgtctaggg acgtcgtcca ctctttggaa 660
ttaccttcac ataggagggt ccagtggttc gacgttaagt ggcaaataaa tgcttatgaa 720
aaagatattt gtagagttaa tgctactttg ttggaattgg ctaaattaaa ttttaatgtt 780
gttcaagcac agttgcagaa aaatttgaga gaggcttccc gttggtgggc aaacttgggt 840
ttcgctgaca acttgaagtt cgctagagac aggttggtcg agtgcttttc atgcgctgtc 900
ggtgtcgctt tcgaaccaga gcactcttct tttagaattt gcttgacaaa ggttattaac 960
ttagttttga ttattgatga tgtttacgat atatacggtt ctgaagaaga gttgaagcat 1020
ttcactaatg ctgttgatag gtgggactct agggaaactg aacagttacc agaatgcatg 1080
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gaaaatggtt ggaatcaagt cttgcctcaa ttaactaaag tctgggctga cttctgcaag 1200
gcattgttgg ttgaggctga atggtataat aagtctcaca ttcctacttt ggaagaatat 1260
ttaaggaatg gttgtatatc ttcttcagtc tctgttttat tagtccattc attcttttct 1320
ataactcatg aaggtactaa agagatggct gattttttgc ataaaaatga ggacttgtta 1380
tataatatat ctttaattgt tagattgaat aatgatttgg gaacttctgc tgcagagcaa 1440
gaaaggggtg attctccatc ttctattgtt tgctacatga gagaagttaa cgcttctgaa 1500
gagactgcta gaaaaaacat taagggtatg attgataatg cttggaagaa agttaatggt 1560
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<213> 人工序列
<400> 4
atgaaggata tgtctattcc attattggct gctgtctctt cttcaacaga ggagacagtt 60
cgtccaatag ctgacttcca cccaacattg tggggtaacc acttcttgaa gtctgctgct 120
gacgtcgaaa ctatagacgc tgcaacacaa gaacagcacg ctgctttgaa acaagaagtt 180
agaagaatga taactacaac tgctaataaa ttggctcaaa aattgcatat gattgacgca 240
gtccaaagat tgggtgtcgc ttaccatttc gaaaaggaaa ttgaggatga attgggtaag 300
gtctctcacg acttggactc tgacgatttg tacgttgttt ctttgagatt tagattattt 360
agacagcaag gtgttaaaat ttcttgcgac gttttcgaca aatttaagga tgatgaaggt 420
aaatttaaag aatctttaat aaatgacatt agaggtatgt tatctttata tgaagctgct 480
tatttagcta ttagaggtga agatatttta gacgaagcta ttgttttcac aactacacac 540
ttgaagtcag tcatatctat ttcagatcat tctcatgcta attctaattt ggcagaacag 600
attagacact cattgcagat tccattgagg aaggctgctg ctagattgga ggctagatat 660
tttttagata tttattctag agacgattta catgatgaaa ctttgttgaa atttgctaag 720
ttggacttca atattttgca agctgctcat caaaaagaag cttctattat gactagatgg 780
tggaatgatt taggttttcc aaagaaagtc ccatatgcta gagataggat tattgaaaca 840
tatatatgga tgttattggg tgtttcatac gaacctaatt tggcttttgg tagaattttc 900
gcttctaaag tcgtttgtat gattacaact attgacgata cttttgatgc ttacggtact 960
ttcgaagaat taactttgtt cactgaagct gttacaagat gggacatagg tttaattgat 1020
actttgcccg aatacatgaa atttatagtt aaagcattgt tggatattta cagagaggca 1080
gaagaggaat tggctaagga gggtaggtca tacggtattc catatgctaa acaaatgatg 1140
caagaattga ttattttata ctttacagaa gcaaagtggt tatataaggg ttatgttcca 1200
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gcatcatttg ttgatttggg tgattttatt gctactaaag ataatttcga atgtattttg 1320
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ggttacaagt tcgaacagaa gagaggtcac aacccttctg cagttgagtg ttataaaaat 1440
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taa 1683
<210> 5
<211> 1769
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cgatatttct atgttcgggt tcagcgtatt ttaagtttaa taactcgaaa attctgcgtt 60
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ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc 180
ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg 240
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tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat 840
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tataatgtat gctatacgaa gttatgagct catctccaga ggatcgccgg gaaccgagga 1740
cgagttcgta atcatggtca tagctgttt 1769
Claims (7)
1.一种生产法尼烯的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌染色体整合表达强化甲羟戊酸途径基因，同时整合表达法尼烯合成酶编码基因Fsso；所述的甲羟戊酸途径基因为HMG1、ERG20、IDI1、ERG10、ERG12、ERG13、ERG8和MVD1中的一种或多种；所述甲羟戊酸途径基因为单拷贝或双拷贝，所述整合表达使用GAL启动子。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以酿酒酵母YPH499为宿主。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌以pMD-19T simple为整合表达载体。
4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述Fsso的核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
5.权利要求1-4任一所述的酿酒酵母工程菌在生产法尼烯中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将权利要求1-4任一所述的酿酒酵母工程菌先在YPD固体平板划线，30℃培养箱培养2-3d活化；接种活化后得到的单菌落到YPD培养基中培养18-24h进行种子培养；取种子培养液接种到YPD培养基中进行发酵，生产法尼烯。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述种子液的接种体积比为1-5％；所述发酵的条件为28-32℃，200-220rpm，发酵50-100h。
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|---|---|---|---|---|
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| CN112852847A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-05-28 | 江南大学 | 一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070087425A1 (en) * | 2000-12-28 | 2007-04-19 | Chikara Ohto | Methods of producing prenyl alcohols |
| CN111019850A (zh) * | 2019-10-21 | 2020-04-17 | 武汉臻智生物科技有限公司 | 重组微生物及构建方法和获得α-法尼烯的方法 |
| CN111378588A (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-07 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用 |
| CN111690690A (zh) * | 2019-03-11 | 2020-09-22 | 浙江医药股份有限公司 | 用于生产法尼烯的酿酒酵母 |
-
2020
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070087425A1 (en) * | 2000-12-28 | 2007-04-19 | Chikara Ohto | Methods of producing prenyl alcohols |
| CN111378588A (zh) * | 2018-12-29 | 2020-07-07 | 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 | 一种转化纤维素水解液合成法尼烯的基因工程菌及其应用 |
| CN111690690A (zh) * | 2019-03-11 | 2020-09-22 | 浙江医药股份有限公司 | 用于生产法尼烯的酿酒酵母 |
| CN111019850A (zh) * | 2019-10-21 | 2020-04-17 | 武汉臻智生物科技有限公司 | 重组微生物及构建方法和获得α-法尼烯的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| WANG,J.: "GenBank: MT559750.1" * |
| 林庭庭;王冬;戴住波;张学礼;黄璐琦;: "创建酿酒酵母细胞工厂发酵生产羽扇豆醇" * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112501043A (zh) * | 2020-12-18 | 2021-03-16 | 江南大学 | 一种生产香叶基香叶醇酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 |
| CN112501043B (zh) * | 2020-12-18 | 2022-02-01 | 江南大学 | 一种生产香叶基香叶醇酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 |
| CN112852847A (zh) * | 2021-02-23 | 2021-05-28 | 江南大学 | 一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用 |
| CN112852847B (zh) * | 2021-02-23 | 2023-02-28 | 江南大学 | 一种重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用 |
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