CN117736960B - 一种小白链霉菌基因工程菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术，具体的说是一种小白链霉菌基因工程菌及其在血清素和N‑乙酰血清素生产中的应用。工程菌以小白链霉菌为出发菌株整合内源的N‑乙酰基转移酶（SNAT）基因、内源的色氨酸脱羧酶（TDC）基因、异源的色氨酸转运蛋白（Mtr）基因和异源的色氨酸羟化酶（Luz15）基因中的一种或几种基因。本发明构建的小白链霉菌均不依赖于诱导剂和抗生素，同时该菌株不属于条件致病菌，转化成本低，产物得率高，可以安全用于大规模生产，N‑乙酰血清素产量也有着明显的优势。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小白链霉菌基因工程菌及其在血清素和N-乙酰血清素生产中的应用。
背景技术
由色氨酸合成褪黑素（Melatonin）的生物合成途径的中间代谢产物有血清素（Serotonin）和N-乙酰血清素（N-Acetylserotonin）。其中，血清素（Serotonin），又名5-羟基色胺，最早从血清中发现，广泛存在于哺乳动物组织中，特别是在脑组织中的浓度较高，是调节神经活动的一种重要物质。血清素具有收缩血管、调节情绪、防止脑老化等作用，是一类抗抑郁药。而N-乙酰血清素（N-Acetylserotonin）是自然界存在的一种小分子化合物，是从血清素到褪黑素的内源性合成反应的中间体。和褪黑素相同，N-乙酰血清素也是褪黑素受体MT1、MT2和MT3的激动剂，被认为是一种神经递质，对研究MT的受体亲和力和拮抗性作用有直接意义。N-乙酰血清素还具有抗氧化、抗炎和神经保护作用，已被用于治疗神经元细胞，是一种新型临床药物。
目前，血清素的生产工艺主要为化学合成，合成工艺流程长，使用的原料种类较多，且存在反应条件苛刻和废弃物多等缺点。N-乙酰基血清素的生产方法主要为化学法，以血清素为反应起始物，采用醋酸酐作为乙酰化试剂，经两步反应合成，会同时生成杂质N,O-双乙酰基血清素，造成后处理复杂，收率低，产品品质较差。生物法合成血清素和N-乙酰血清素对环境友好，应用前景广阔。
中国发明专利申请CN202111391114.X公开了一种以5-羟基色氨酸为底物微生物合成血清素的工程菌株、构建及其应用，该方法以大肠杆菌为底盘微生物，利用质粒表达系统分别异源表达五种不同来源的5-羟色氨酸脱羧酶，在IPTG诱导后加入底物5-羟基色氨酸、辅酶磷酸吡哆醛和细胞通透剂进行生物转化，血清素的最终产量为31.9克/升。中国发明专利申请CN202110800209.6公开了一种褪黑素中间体N-乙酰基血清素的合成工艺，该方法以血清素为底物，利用二氯甲烷、三乙胺、乙酰氯等化学试剂进行合成，对环境不友好。
现有血清素和N-乙酰基血清素的化学生产方法使用大量有机试剂，对环境不友好。现有血清素和N-乙酰血清素的生物合成技术均利用条件致病菌大肠杆菌进行生产，存在安全隐患；均利用质粒系统异源表达相关基因，稳定性难以保障；在生物转化时需要添加诱导剂和抗生素，造成生产成本增加，且最终N-乙酰血清素的产量较低。
本发明目的在于提供一种小白链霉菌基因工程菌及其在血清素和N-乙酰血清素生产中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种小白链霉菌基因工程菌，以小白链霉菌为出发菌株整合内源的N-乙酰基转移酶（SNAT）基因、内源的色氨酸脱羧酶（TDC）基因、异源的色氨酸转运蛋白（Mtr）基因和异源的色氨酸羟化酶（Luz15）基因中的一种或几种基因。
所述出发菌株为小白链霉菌（Streptomyces albulus） CICC 11022；N-乙酰基转移酶（SNAT）基因和色氨酸脱羧酶（TDC）基因源于出发菌株；异源的色氨酸转运蛋白（Mtr）基因来自Escherichia coli MG1655；色氨酸羟化酶（Luz15）基因来自Actinomaduraluzonensis DSM43766。
所述小白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶（TDC）基因；
所述小白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶（TDC）基因和N-乙酰基转移酶（SNAT）基因；
所述小白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶（TDC）基因、异源的色氨酸转运蛋白（Mtr）基因和异源的色氨酸羟化酶（Luz15）基因；
或，所述白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶（TDC）基因和N-乙酰基转移酶（SNAT）基因、异源的色氨酸转运蛋白（Mtr）基因和异源的色氨酸羟化酶（Luz15）基因。
一种所述的小白链霉菌基因工程菌的构建方法，利用PCR技术、酶切方法对含有组成型强启动子Sp43和核糖体结合位点序列SR40的载体进行线性化处理，回收产物为线性化载体片段；利用无缝克隆方法将所述含有内源的N-乙酰基转移酶（SNAT）基因、内源的色氨酸脱羧酶（TDC）基因、异源的色氨酸转运蛋白（Mtr）基因和异源的色氨酸羟化酶（Luz15）基因中的一种或几种基因片段与上述线性化载体片段进行连接、转化，得到重组表达载体；将所述重组表达载体先转入大肠杆菌ET12567/pUZ8002，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌CICC 11022染色体上，即获得工程菌株。
所述工程菌株为使用EcoR I和NdeI酶切含有组成型强启动子Sp43和核糖体结合位点序列SR40的载体pSET152-Sp43-SR40-pls，获得线性化载体片段，通过Infusion无缝克隆技术与内源的色氨酸脱羧酶（TDC）基因进行连接，获得重组表达质粒pSET152-TDC；将所得重组表达质粒pSET152-TDC转移到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌CICC 11022，使pSET152-TDC整合到该菌株的染色体上，获得TDC表达工程菌株（小白链霉菌Q-TDC）。
所述工程菌株为使用EcoR I酶切载体pSET152-TDC获得线性化片段，通过Infusion无缝克隆技术与内源的N-乙酰基转移酶（SNAT）基因进行连接，获得重组表达质粒pSET152-TDC-SNAT；将表达质粒pSET152-TDC-SNAT转移到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌CICC 11022，使pSET152-TDC-SNAT整合到该菌株的染色体上，获得TDC和SNAT共表达工程菌株（小白链霉菌Q-TDC-SNAT）。
所述工程菌株为将异源的色氨酸转运蛋白（Mtr）基因和异源的色氨酸羟化酶（Luz15）基因连接至线性化质粒p3SV-ths上，得到重组表达质粒p3SV-ths-Mtr-Luz15，利用接合转移将p3SV-ths-Mtr-Luz15转入所述小白链霉菌Q-TDC，使p3SV-ths-Mtr-Luz15整合到该菌株的染色体上，得到TDC、Mtr和Luz15共同高表达的基因工程菌（小白链霉菌Q-TDC-Mtr-Luz15）。
所述工程菌株为利用接合转移将p3SV-ths-Mtr-Luz15转入上述小白链霉菌Q-TDC-SNAT，使p3SV-ths-Mtr-Luz15整合到该菌株的染色体上，得到TDC、SNAT、Mtr和Luz15共同高表达的基因工程菌（小白链霉菌Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15）。
一种所述的小白链霉菌基因工程菌的应用，所述工程菌在血清素或N-乙酰血清素生产中的应用。
所述工程菌在以5-羟基色氨酸或色氨酸为底物生产血清素中的应用；或，所述工程菌在以5-羟基色氨酸、色氨酸或血清素为底物生产N-乙酰血清素中的应用。
进一步的说，所述各工程菌首先在MS固体平板上培养6-8天，收集孢子转接到M3G培养基培养24小时，然后以10%的接种量转接到新鲜M3G培养基继续培养36小时，待菌株OD600处于8-12时去除上清收集菌体。
而后将上述获得各菌液利用M9Y转化培养基培养至菌液OD值调整到20-100，再加入不同的底物进行转化进而获得对应的相应产物。
本发明所具有的优点：
本发明首次以链霉菌为底盘构建了能够高效合成血清素或N-乙酰血清素的菌株，其中，合成N-乙酰血清素的菌株在小白链霉菌基因组上同时整合该菌株内源的N-乙酰基转移酶（SNAT）基因和色氨酸脱羧酶（TDC）基因，以及异源的色氨酸转运蛋白（Mtr）基因和色氨酸羟化酶（Luz15）基因，并实现了四个基因的组成型高表达，所构建的小白链霉菌基因工程菌株Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15能够以血清素、5-羟基色氨酸或色氨酸为底物高效合成N-乙酰血清素。
合成血清素的菌株在小白链霉菌基因组上整合该菌株内源的色氨酸脱羧酶（TDC）基因以及异源的色氨酸转运蛋白（Mtr）基因和色氨酸羟化酶（Luz15）基因，并实现了三个基因的组成型高表达，所构建的小白链霉菌基因工程菌株Q-TDC-Mtr-Luz15能够以5-羟基色氨酸或色氨酸为底物合成血清素。
本发明构建的小白链霉菌基因工程菌均不依赖于诱导剂和抗生素，同时菌株不属于条件致病菌，转化成本低，产物得率高，可以安全用于大规模生产，N-乙酰血清素产量也有明显优势。
附图说明
图1为本发明实施例构建的pSET152-Sp43-SR40-pls质粒示意图。
图2为本发明实施例提供的基因工程菌株小白链霉菌Q-TDC与出发菌株CICC11022中TDC基因的表达水平效果图。
图3为本发明实施例构建的基因组整合型质粒示意图，其中，A，pSET152-TDC；B，pSET152-SNAT；C，pSET152-TDC-SNAT；D，p3SV-ths-Mtr-Luz15。
图4为本发明实施例提供的基因工程菌株小白链霉菌Q-TDC-SNAT与出发菌株CICC11022中SNAT基因的表达水效果图。
图5为本发明实施例提供的表达质粒p3SV-ths示意图。
图6为本发明实施例提供的基因工程菌株小白链霉菌Q-TDC-Mtr-Luz15与对照菌株中Mtr基因和Luz15基因的表达效果图。
图7为本发明实施例提供的基因工程菌株小白链霉菌Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15与对照菌株中Mtr基因和Luz15基因的表达效果图。
图8为本发明构建的小白链霉菌基因工程菌其底物和产物对应图。
图9为本发明实施例利用小白链霉菌Q-TDC以5-羟基色氨酸为底物生产血清素效果图。
图10为本发明实施例利用小白链霉菌Q-TDC-SNAT以血清素为底物生产N-乙酰血清素效果图。
图11为本发明实施例利用小白链霉菌Q-TDC-SNAT以5-羟基色氨酸为底物生产N-乙酰血清素效果图。
图12为本发明实施例利用小白链霉菌Q-TDC-Mtr-Luz15以色氨酸为底物生产血清素效果图。
图13为本发明实施例利用小白链霉菌Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15以色氨酸为底物生产N-乙酰血清素效果图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明构建的小白链霉菌（Streptomyces albulus）Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15，能够以色氨酸或5-羟基色氨酸为底物合成N-乙酰血清素，产量可达9.2克/升，转化率可达90%以上。构建的小白链霉菌（Streptomyces albulus）Q-TDC-Mtr-Luz15，能够以色氨酸或5-羟基色氨酸为底物合成血清素，产量可达9.6克/升，转化率可达95%以上。
下述实施例中没有特殊表明的实验原料均可市购获得，实施例中出发菌株为小白链霉菌野生菌CICC 11022，其购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
实施例1 TDC高表达小白链霉菌基因工程菌的构建
以小白链霉菌（Streptomyces albulus）CICC11022基因组为模板，使用引物TDC-F和TDC-R扩增TDC基因片段。
引物序列如下：
TDC-F：TCAAAGGAGTGTCCATATGAAGCCCGCTGACGCGAAACCGCC
TDC-R：TATGACATGATTACGAATTCCTACTCGGGCAGCGCATCAGCCG
PCR条件如下：95℃ 15 s，55℃ 15 s和72℃ 2 min，重复30个循环。TDC基因大小为1470 bp（见序列表）。
使用EcoR I和NdeI酶切含有组成型强启动子Sp43和核糖体结合位点序列SR40的载体pSET152-Sp43-SR40-pls（该载体由已知市购载体pSET152经XbaI和EcoRI双酶切后与化学合成的Sp43-SR40序列、PCR扩增得到的聚赖氨酸合成酶基因pls连接得到（参见图1）），所得载体框架大小约为5.8 kb。通过Infusion无缝克隆技术与PCR产物（TDC）进行连接，并转化到大肠杆菌DH5α中，通过测序筛选并验证正确连接的转化子，重组表达质粒命名为pSET152-TDC，质粒图谱如图3中A所示。
而后，将上述获得的质粒pSET152-TDC转移到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌CICC 11022，使pSET152-TDC整合到该菌株染色体的attB位点上，获得的TDC表达菌株命名为小白链霉菌Q-TDC。
接合转移的具体步骤如下：挑取含有pSET152-TDC的供体菌大肠杆菌（Escherichia coli）ET12567/pUZ8002单菌落于含50微克/毫升卡那霉素、50微克/毫升氯霉素和50微克/毫升安普霉素的LB培养基中，37℃培养至OD600为0.6时收集菌体，用新鲜LB培养基洗涤菌体3次，最后用200微升LB重悬后备用。将小白链霉菌CICC11022孢子悬浮于400微升2×YT培养基（胰蛋白胨16克/升，酵母粉10克/升，氯化钠5克/升），50℃水浴热激10分钟，冷却至室温后与已准备好的供体菌混合，30℃振荡（100转/分钟）培养1小时，离心，弃部分上清后涂布于MS固体培养基（甘露醇20克/升、黄豆粉20克/升、琼脂粉20克/升）上，14小时后，用含80微克/毫升安普霉素和25微克/毫升萘啶酮酸的1毫升无菌水覆盖，置于30℃培养2天后可看到抗性接合孢子，培养该孢子得到基因工程菌株小白链霉菌（Streptomycesalbulus）Q-TDC。
利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法比较小白链霉菌Q-TDC和出发菌株CICC11022中TDC基因的表达水平。将上述两株菌分别在M3G培养基中（葡萄糖50克/升，酵母粉5克/升，硫酸铵10克/升，磷酸氢二钾0.8克/升，磷酸二氢钾1.36克/升，七水硫酸锌0.04克/升，七水硫酸镁0.5克/升，七水硫酸亚铁0.03克/升,pH 6.5）发酵48小时后采集样品，提取总RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR。PCR实验条件如下：95℃10 s，60℃30 s，40个重复循环。选择RNA聚合酶sigma因子（hrdB）作为参考基因。用于qRT-PCR的引物如下：
RT-TDC-F：AGCAGATGCTGGACTGGTTC
RT-TDC-R：TGAGCAATGCCACCAGGAG
RT-hrdB-F：CTGACCAGATTCCGCCAACCC
RT-hrdB-R：GCCTCTGCGGCACTGACCAT
所有qRT-PCR运行均使用三个生物和三个技术重复进行，通过2-ΔΔCt方法分析相关基因表达数据，结果基因工程菌株小白链霉菌Q-TDC中TDC基因的表达水平是出发菌株CICC11022中的9000倍左右（参见图2）。该结果表明，成功构建了TDC高表达的小白链霉菌基因工程菌株Q-TDC。
实施例2 TDC和SNAT共同高表达小白链霉菌基因工程菌Q-TDC-SNAT的构建
以质粒pSET152-Sp43-SR40-pls为模板，使用引物Sp43-SR40-F和Sp43-SR40-R扩增组成型强启动子Sp43和核糖体结合位点序列SR40。以小白链霉菌（Streptomycesalbulus）CICC11022基因组为模板，使用引物SNAT-F和SNAT-R扩增SNAT基因片段。
引物序列如下：
Sp43-SR40-F：gcgctgcccgagtaggaattcTGTTCACATTCGAACCGTCTCTG
Sp43-SR40-R：ggtgttcatATGGACACTCCTTTGACAAGTCTAGT
SNAT-F：ggagtgtccatATGAACACCTTCCGGACCG
SNAT-R：ctatgacatgattacgaattcTCAGTCGCAGTGGTCATGGA
PCR条件如下：95℃ 15 s，55℃ 15 s和72℃ 1 min，重复30个循环。Sp43-SR40序列大小为96 bp，SNAT基因大小为549 bp（见序列表）。使用EcoR I酶切载体pSET152-TDC，所得载体框架大小约为7.2 kb。通过Infusion无缝克隆技术将载体框架与PCR产物（SNAT）进行连接，并转化到大肠杆菌DH5α中，通过测序筛选并验证正确连接的转化子，重组表达质粒命名为pSET152-TDC-SNAT，图谱如图3中C所示。首先将表达质粒pSET152-TDC-SNAT转移到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌CICC11022，使pSET152-TDC-SNAT整合到该菌株染色体的attB位点上，获得的TDC和SNAT共表达菌株命名为小白链霉菌Q-TDC-SNAT。
利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法比较小白链霉菌Q-TDC-SNAT和对照菌株CICC11022中SNAT基因的表达水平。按照实施例1记载的发酵条件发酵48小时后采集样品，提取总RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR。PCR实验条件如下：95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个重复循环。选择RNA聚合酶sigma因子（hrdB）作为参考基因。用于qRT-PCR的引物如下：
RT-SNAT-F：GCACTCCGCACTACTACCTC
RT-SNAT-R：GATGAGGTCGGAGAGCATCC
RT-hrdB-F：CTGACCAGATTCCGCCAACCC
RT-hrdB-R：GCCTCTGCGGCACTGACCAT
所有qRT-PCR运行均使用三个生物和三个技术重复进行。通过2-ΔΔCt方法分析相关基因表达数据，结果基因工程菌株小白链霉菌Q-TDC-SNAT中SNAT基因的表达水平均是对照菌CICC11022中的50000倍以上（参见图4）。该结果表明，成功构建了TDC和SNAT共同高表达的小白链霉菌基因工程菌株Q-TDC-SNAT。
实施例3 TDC、Mtr和Luz15共同高表达小白链霉菌基因工程菌Q-TDC-Mtr-Luz15的构建
化学合成组成型强启动子SP43、核糖体结合位点序列SR40和密码子优化后的来自Escherichia coli MG1655的色氨酸转运蛋白（Mtr）基因，同时化学合成组成型强启动子SP43、核糖体结合位点序列SR40和密码子优化后的来自Actinomadura luzonensisDSM43766的色氨酸羟化酶（Luz15）基因。
将上述合成的两段表达框连接到表达质粒p3SV-ths（该质粒载体由中国科学院微生物研究所娄春波赠送（参见图5））上，得到表达质粒p3SV-ths-Mtr-Luz15（见图3中D）。利用接合转移将p3SV-ths-Mtr-Luz15转入前面构建的小白链霉菌基因工程菌Q-TDC，得到TDC、Mtr和Luz15三个基因在小白链霉菌基因组上共同高表达的基因工程菌Q-TDC-Mtr-Luz15。
利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法比较小白链霉菌Q-TDC-SNAT和对照菌株Q-TDC中Mtr和Luz15基因的表达水平。发酵48小时后采集样品，提取总RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR。PCR实验条件如下：95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个重复循环。选择RNA聚合酶sigma因子（hrdB）作为参考基因。用于qRT-PCR的基因和引物如下：
RT-Mtr-F：TGGTTCTTCTGGAGCATGGC
RT-Mtr-R：CCGATGCGGTAGTTCAGGTT
RT-Luz15-F：CGTCTCTGCTTTGACACGGA
RT-Luz15-R：GCGCATGACACTCCTTTGAC
所有qRT-PCR运行均使用三个生物和三个技术重复进行。通过2-ΔΔCt方法分析相关基因表达数据，结果基因工程菌株小白链霉菌Q-TDC-Mtr-Luz15中Mtr基因的表达水平均是对照菌中的5000倍以上，Luz15基因的表达水平均是对照菌中的10000倍以上（参见图6）。该结果表明，成功构建了TDC、Mtr和Luz15共同高表达的小白链霉菌基因工程菌株Q-TDC-Mtr-Luz15。
实施例4 TDC、SNAT、Mtr和Luz15共同高表达小白链霉菌基因工程菌Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15的构建
将上述实施例获得的质粒p3SV-ths-Mtr-Luz15利用接合转移将其转入构建的小白链霉菌基因工程菌Q-TDC-SNAT，得到TDC、SNAT、Mtr和Luz15四个基因在小白链霉菌基因组上共同高表达的基因工程菌Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15。
利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法比较小白链霉菌Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15和对照菌株Q-TDC-SNAT中Mtr和Luz15基因的表达水平，方法和引物序列和实施例3中描述的一致。结果基因工程菌株小白链霉菌Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15中Mtr基因的表达水平均是对照菌中的6000倍以上，Luz15基因的表达水平均是对照菌中的12000倍以上（参见图7）。该结果表明，成功构建了TDC、SNAT、Mtr和Luz15共同高表达的小白链霉菌基因工程菌株Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15。
实施例5 利用小白链霉菌Q-TDC以5-羟基色氨酸为底物生产血清素
将-80℃超低温冰箱保藏的小白链霉菌Q-TDC划线到MS固体培养基（甘露醇20克/升、黄豆粉20克/升、琼脂粉20克/升），30℃培养5-6天，待培养基表面长满黑色孢子后从平板上收集孢子，分别接种到装有50毫升M3G培养基（葡萄糖50克/升，酵母粉5克/升，硫酸铵10克/升，磷酸氢二钾0.8克/升，磷酸二氢钾1.36克/升，七水硫酸锌0.04克/升，七水硫酸镁0.5克/升，七水硫酸亚铁0.03克/升,pH 6.5）的锥形瓶中，30℃ 220转/分钟摇床振荡培养24小时得到种子液；分别将培养好的种子培养液按照10%（体积比）的接种量，接种至装有新鲜M3G培养基的锥形瓶，在30℃ 220转/分钟摇床振荡培养36小时后分别收集菌体。利用M9Y转化培养基（葡萄糖10克/升，酵母粉2克/升，磷酸氢二钠6克/升，氯化钠0.5克/升，氯化铵1克/升，磷酸二氢钾3.5克/升，硫酸镁0.2465克/升，氯化钙14.7毫克/升，硫酸亚铁27.8毫克/升，柠檬酸钠2克/升）分别将菌液OD值调整到20、30、50和100，对应分别加入2、3、5和10克/升5-羟基色氨酸进行转化（即，菌液OD值调整到20加入2克/升血清素，OD值调整到30加入3克/升血清素，以此类推），其中10克/升5-羟基色氨酸需分两次加入，同时加入溶菌酶10-50毫克/升和磷酸吡哆醛0.1-1.5毫摩尔，转化时间24-120小时（不同量底物时，2克/升5-羟基色氨酸转化时加入溶菌酶10毫克/升和磷酸吡哆醛0.1毫摩尔，转化时间24小时；3克/升5-羟基色氨酸转化时加入溶菌酶15毫克/升和磷酸吡哆醛0.2毫摩尔，转化时间36小时；5克/升5-羟基色氨酸转化时加入溶菌酶25毫克/升和磷酸吡哆醛0.5毫摩尔，转化时间72小时；10克/升5-羟基色氨酸转化时加入溶菌酶50毫克/升和磷酸吡哆醛1.5毫摩尔，转化时间120小时）。利用高效液相色谱法进行检测分析，采用二极管阵列检测器，检测波长276纳米，采用反相Kromasil 100-5-C18柱（4.6×250 mm，5μm）进行定量，以甲醇/10 mM磷酸钾缓冲液为流动相，流速1 mL/min。如图9所示，血清素的产量为1.9-9.6克/升，转化率均为95%以上。
上述转化率=产物浓度÷底物消耗浓度×100%
实施例6 利用小白链霉菌Q-TDC-SNAT以血清素为底物生产N-乙酰血清素
将超低温冰箱保藏的小白链霉菌Q-TDC-SNAT划线到MS固体培养基，30℃培养5-6天，待培养基表面长满黑色孢子后从平板上收集孢子，分别接种到装有50毫升M3G培养基的锥形瓶中，30℃ 220转/分钟摇床振荡培养24小时得到种子液；分别将培养好的种子培养液按照10%（体积比）的接种量，接种至装有新鲜M3G培养基的锥形瓶，在30℃ 220转/分钟摇床振荡培养36小时后分别收集菌体。利用M9Y转化培养基分别将各菌株的菌液OD值调整到20、30、50和100，对应分别加入2、3、5和10克/升血清素进行转化（即，菌液OD值调整到20加入2克/升血清素，OD值调整到30加入3克/升血清素，以此类推），同时加入甘油10-50克/升，转化时间24-120小时（不同量底物时，2克/升血清素转化时加入甘油10克/升，转化时间24小时；3克/升血清素转化时加入甘油15克/升，转化时间48小时；5克/升血清素转化时加入甘油25克/升，转化时间72小时；10克/升血清素转化时加入甘油50克/升，转化时间120小时），利用实施例5所述高效液相色谱法进行检测分析，如图10所示，N-乙酰血清素的产量为1.8-9.2克/升，转化率均为90%以上。
实施例7 利用小白链霉菌Q-TDC-SNAT以5-羟基色氨酸为底物生产N-乙酰血清素
将超低温冰箱保藏的小白链霉菌Q-TDC-SNAT划线到MS固体培养基，30℃培养5-6天，待培养基表面长满黑色孢子后从平板上收集孢子，分别接种到装有50毫升M3G培养基的锥形瓶中，30℃ 220转/分钟摇床振荡培养24小时得到种子液；分别将培养好的种子培养液按照10%（体积比）的接种量，接种至装有新鲜M3G培养基的锥形瓶，在30℃ 220转/分钟摇床振荡培养36小时后分别收集菌体。利用M9Y转化培养基分别将各菌株的菌液OD值调整到20、30、50和100，分别加入2、3、5和10克/升5-羟基色氨酸进行转化（即，菌液OD值调整到20加入2克/升血清素，OD值调整到30加入3克/升血清素，以此类推），其中10克/升5-羟基色氨酸需分两次加入，同时加入溶菌酶10-50毫克/升、磷酸吡哆醛0.1-1.5毫摩尔和甘油10-50克/升，转化时间24-120小时（不同量底物时，2克/升5-羟基色氨酸转化时加入溶菌酶10毫克/升和磷酸吡哆醛0.1毫摩尔，甘油10克/升，转化时间24小时；3克/升5-羟基色氨酸转化时加入溶菌酶15毫克/升和磷酸吡哆醛0.2毫摩尔，甘油15克/升，转化时间36小时；5克/升5-羟基色氨酸转化时加入溶菌酶25毫克/升和磷酸吡哆醛0.5毫摩尔，甘油25克/升，转化时间72小时；10克/升5-羟基色氨酸转化时加入溶菌酶50毫克/升和磷酸吡哆醛1.5毫摩尔，转化时间120小时），利用实施例5所述高效液相色谱法进行检测分析，如图11所示，N-乙酰血清素的产量为1.6-8.1克/升，转化率均为80%以上。
实施例8 利用小白链霉菌Q-TDC-Mtr-Luz15以色氨酸为底物生产血清素
将超低温冰箱保藏的小白链霉菌Q-TDC-Mtr-Luz15划线到MS固体培养基，30℃培养5-6天，待培养基表面长满黑色孢子后从平板上收集孢子，分别接种到装有50毫升M3G培养基的锥形瓶中，30℃ 220转/分钟摇床振荡培养24小时得到种子液；分别将培养好的种子培养液按照10%（体积比）的接种量，接种至装有新鲜M3G培养基的锥形瓶，在30℃ 220转/分钟摇床振荡培养36小时后分别收集菌体。利用M9Y转化培养基分别将菌液OD值调整到20、30、50和100，分别加入2、3、5和10克/升色氨酸进行转化（即，菌液OD值调整到20加入2克/升血清素，OD值调整到30加入3克/升血清素，以此类推），其中10克/升色氨酸需分两次加入，同时加入溶菌酶10-50毫克/升和磷酸吡哆醛0.1-1.5毫摩尔，转化时间24-120小时（不同量底物时，2克/升色氨酸转化时加入溶菌酶10毫克/升和磷酸吡哆醛0.1毫摩尔，转化时间24小时；3克/升色氨酸转化时加入溶菌酶15毫克/升和磷酸吡哆醛0.2毫摩尔，转化时间36小时；5克/升色氨酸转化时加入溶菌酶25毫克/升和磷酸吡哆醛0.5毫摩尔，转化时间72小时；10克/升色氨酸转化时加入溶菌酶50毫克/升和磷酸吡哆醛1.5毫摩尔，转化时间120小时），利用实施例5所述高效液相色谱法进行检测分析，如图12所示，血清素的产量1.3-6.4克/升，转化率60%以上。
实施例9 利用小白链霉菌Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15以色氨酸为底物生产N-乙酰血清素
将超低温冰箱保藏的小白链霉菌Q-TDC-SNAT-Mtr-Luz15划线到MS固体培养基，30℃培养5-6天，待培养基表面长满黑色孢子后从平板上收集孢子，分别接种到装有50毫升M3G培养基的锥形瓶中，30℃ 220转/分钟摇床振荡培养24小时得到种子液；分别将培养好的种子培养液按照10%（体积比）的接种量，接种至装有新鲜M3G培养基的锥形瓶，在30℃220转/分钟摇床振荡培养36小时后分别收集菌体。利用M9Y转化培养基分别将菌液OD值调整到20、30、50和100，分别加入2、3、5和10克/升色氨酸进行转化（即，菌液OD值调整到20加入2克/升血清素，OD值调整到30加入3克/升血清素，以此类推），其中10克/升色氨酸需分两次加入，同时加入溶菌酶10-50毫克/升、磷酸吡哆醛0.1-1.5毫摩尔和甘油10-50克/升，转化时间24-120小时（不同量底物时，2克/升色氨酸转化时加入溶菌酶10毫克/升和磷酸吡哆醛0.1毫摩尔，甘油10克/升，转化时间24小时；3克/升色氨酸转化时加入溶菌酶15毫克/升和磷酸吡哆醛0.2毫摩尔，甘油15克/升，转化时间36小时；5克/升色氨酸转化时加入溶菌酶25毫克/升和磷酸吡哆醛0.5毫摩尔，甘油25克/升，转化时间72小时；10克/升色氨酸转化时加入溶菌酶50毫克/升和磷酸吡哆醛1.5毫摩尔，转化时间120小时），利用实施例5所述高效液相色谱法进行检测分析，如图13所示，N-乙酰血清素的产量1.1-5.2克/升，转化率50%以上。
TDC基因序列
ATGAAGCCCGCTGACGCGAAACCGCCCCACATGGACCACGACACCTTCCGCTCCCTGGGCCATCAGGCCATCGACTGGATCGCCGACTACTGGCAGCGTTTGGCGGAGCGACCCGTCGCTCCCCCCGTCGAACCCGGCAGCATCCGCGCCCAGTTACCGACGGCCCCACCCGAGTGCGGCGAGGACTTTCCCGTGCTGCTGTCCGACCTCGAACGGATCGTGCTGCCGGGCCTGCTGCACTGGCAGCACCCCCGTTTCTTCGGTTACTTCCCCGCGAACGCTTCCGGCCCCGCCGTCCTGGCCGAGCTGTTGTCCGCGGGCCTGGGCATCCAGGGGATGAACTGGAACACCAGCCCGGCCTGCACCGAGATCGAACAGCAGATGCTGGACTGGTTCGTGCACCTGCTCGGCCTACCCGAGCACCTCCGCGGTGGGGGAGTCATCCAGGACACCGCCTCCAGCGCCCTCCTGGTGGCATTGCTCACCGCCCTGCACCAGGCCAGCGCGGGCCGCACCCGCGACCACGGCACCGGCGAGTGCGACTACCGGGTGTACCTGACCGCCGAGACGCACTCGGCGGCCCGAAAGGCCGCCGTCATCACCGGACTGGGCCTGCGGGCCATGTGCGAGGTGGCCACCGACGCCGACGGCGCCATGGACGCAGTCGATCTGGAAAGACACCTCCGGGCCGACCGGGCCGCAGGTCTGACCCCGCTGATGGTCGTGGCCACCCGAGGCACCACCTCCCATCTCTCCTTCGACCCCCTGGAGGACATCGGCCCCGTGTGTCGTCGGCACGGCGTGTGGCTCCACGTCGACGCCGCATACGCCGGAGTGGCCGCGGTCTGCGACGAACTGCGCTGGGTCAACGACGGCGTGCGCTACGCGGACTCCTACTGCACCAACCCGCACAAGTGGCTGCTGACCAACTTCGACTGCGACCTGCTGTGGGTGGCCCACCCCGAAGTCCTCGTCAGCGCCCTGAGCGTGCTCCCCGAATACCTGCGCAACTCGGCCTCCGAATCGGGCCGGGTGACCGACTACCGGCACTGGCAGGTCCCACTGGGCCGGCGCTTCCGAGCACTGAAACTGTGGTCCGTCCTCCACTGGTACGGCGCCGAGGGGCTGCGCGCCCACATCCGCAACGGCGTTCGGCATGCCCAGCTCTTCGCGGACCTGGTCGGCGCCGACGACCGCTTCACCCTGGTCACCCCTCCAGCCCTCGGCCTGGTGACGTTCCGTCAGACCGGAACGGACGAGGAGAACCGGAACCTCCTGCAAGCCATCAACACCGAGGGAACCACCTTCCTCACCCACTCCGAGAAGAACGGCACCTTCTTCCTGCGCTTCGCCGCTGGCGGCACCCTCACCGAGGACCACCACGTACGCGAAGCATGGCGCGCTGTCCAGAACGCGATCCCTCGCGCACAACACCTCGCCGGCGGCTCGGCTGATGCGCTGCCCGAGTAG
SNAT基因序列
ATGAACACCTTCCGGACCGCGACGGCACGCGATCTCCCCGATGTCGCCGCCACCTTGACCGAGGCGTTCGCCGCCGACCCGCCGACCCAATGGGTCTTCCCGGACGGTGCCGCTGCGGTCTCCCGTTTCTTCTTCGGTGTCGCCGACCGTGCCCGCGAGGCCGGCGGGATCGTCGAACTACTCCCCGGCACCGCCGCGATGATCGCCCTACCCCCGCACGTACGACTACCCGACGCCCCAGCCTGCGGCCGACAGGCCGAGATGCAGCGCAGGCTGGGCGAACGCCGCCCCCGCACTCCGCACTACTACCTCCTCTTCTACGGCGTGCGCACCGCCCATCAGAGCTCCGGCCTGGGGGGACGGATGCTCTCCGACCTCATCTCCCTGGCCGACCGCGACCGCGTGGGCACCTACACCGAGGCCAGCACCTGGCGCGGCGCCCGCCTGATGTTGCGTCACGGCTTCCACACCGCACAGCCGCTGCGGCTTCCCCACGGGCCACCCATGTTCCCCCTCTGGAGAGACCCGATCCATGACCACTGCGACTGA
Mtr基因序列
ATGGCCACCCTGACCACCACCCAGACCAGCCCGAGCCTGCTGGGCGGCGTCGTCATCATCGGCGGCACCATCATCGGCGCCGGCATGTTCAGCCTGCCGGTCGTCATGTCCGGCGCCTGGTTCTTCTGGAGCATGGCCGCCCTGATCTTCACCTGGTTCTGCATGCTGCACTCCGGCCTGATGATCCTGGAGGCCAACCTGAACTACCGCATCGGCAGCTCCTTCGACACCATCACCAAGGACCTGCTGGGCAAGGGCTGGAACGTCGTCAACGGCATCAGCATCGCCTTCGTGCTGTACATCCTCACCTACGCCTACATCAGCGCCAGCGGCAGCATCCTGCACCACACCTTCGCCGAGATGAGCCTGAACGTCCCGGCCCGCGCCGCCGGCTTCGGCTTCGCCCTGCTGGTCGCCTTCGTCGTCTGGCTGAGCACCAAGGCCGTCAGCCGCATGACCGCCATCGTCCTGGGCGCCAAGGTCATCACCTTCTTCCTCACCTTCGGCTCGCTGCTGGGCCACGTCCAGCCGGCCACCCTGTTCAACGTCGCCGAGAGCAACGCCTCCTACGCCCCGTACCTGCTGATGACCCTGCCGTTCTGCCTGGCCAGCTTCGGCTACCACGGCAACGTCCCGAGCCTGATGAAGTACTACGGCAAGGACCCGAAGACCATCGTCAAGTGCCTGGTCTACGGCACCCTGATGGCCCTGGCCCTGTACACCATCTGGCTGCTGGCCACCATGGGCAACATCCCGCGCCCGGAGTTCATCGGCATCGCCGAGAAGGGCGGCAACATCGACGTCCTGGTCCAGGCCCTGAGCGGCGTCCTGAACAGCCGCAGCCTGGACCTGCTGCTGGTCGTCTTCAGCAACTTCGCCGTGGCGAGCAGCTTCCTGGGCGTCACCCTGGGCCTGTTCGACTACCTGGCCGACCTGTTCGGCTTCGACGACAGCGCCGTCGGCCGCCTGAAGACCGCCCTGCTGACCTTCGCCCCGCCGGTCGTCGGCGGCCTGCTGTTCCCGAACGGCTTCCTGTACGCCATCGGCTACGCCGGCCTGGCCGCCACCATCTGGGCCGCCATCGTCCCGGCCCTGCTGGCCCGCGCCAGCCGCAAGCGCTTCGGCAGCCCGAAGTTCCGCGTCTGGGGCGGCAAGCCGATGATCGCCCTGATCCTGGTCTTCGGCGTCGGCAACGCCCTGGTCCACATCCTGAGCAGCTTCAACCTGCTCCCGGTCTACCAGTGATAA
Luz15基因序列
ATGCGCGCCACCACCAACGTCGGCGTCGGCGGCCTGAGCCCGCGCGCCCTGGACGAGACCGCCCGCTGCCCGAGCAGCGCCCTGAACAGCCTCGCCGAGTGGCAGGAGACCGCCGGCCCGGCCGCCTTCCCGTTCCGCCCGATCGTCCGCCACTACCAGGCCGTGGGCCGCGGCCGCGCCGACGCCGAGCTGGTCAAGGCCCTGCGCGTCCTGGCCGAGCAGGGCTGCCGCCGCCACGGCGGGGGCGGCCGCCCGGCCCACGGCACCATCCTCAGCAGCTGGCTCCCCTGCACCTTCGACCAGGAGGACGGCGACTACGACAGCTACGGCGCCATGCCGCTGCTGCACCAGGTGGCCGGCACCGCCGCCGGCGGCCCGGACACCGGCCTGGACCTGCAGCAGGTGGCGCTGCTGGGCGACCTGCTGGCCTTCGAGGCCGCCGCCGGCCGCGTCTGCGGCAGCGCCCCGCAGCAGGTCCGCGTCCGCGCCTGCCTGCGCGCCCTGGCCCGCGCCGGCGAGCTGGCCCCGGGCGCCGCCGGCGTCACCGCCCGCTTCCCGGGCGCCCCGGCCGCCGACCGCGCGGGCGAGCTGGCCCTGCTGGCCCTGGAGGCCGTCCCGCCGGCCGTCCGCCTGGCCGCCGAGATCACCCTGCTGCCGATGACCCCGCTGCACGACGAGGTCATGTTCATCCGCAGCATCCAGGTCTTCGAGCTGGTCTACCGCCAGGTCGCCCGCTGCCTGGAGCGCGCCGTCACCGCCCTGGCGGGCGGCGACCCGGCCGCGGCCGCCGCCGAGGTCCGCGGCGCCACCGCCCGGGTCGCCGCCACCGGCAGCCTGTACCGCGTCCTGACCACCATGCCGAAGGAGAGCTTCGCCGTCATCCGCAGCAGCACCGACGGCCGCAGCGCCATCCAGAGCCGCGCCTACCGCGAGGTCGAGCGCCTGAGCGCCCCGCTGCCGACCGAGCGCCTGCCGATGGAGCTGCTGCGCCTGGACGAGCGCCCGCGCCCGGGCCGCAGCCTGCAGGAGGAGTACCTGGCCGCCGGCGGCGGCCCGCGCCTGGACGACCTGGCCGCCGCCATGACCGGCCTGGACCAGGCCTGGCACGCCATGAAGCGCACCCACTGGGGCATCACCCTGAAGATCATCGGCCGCGTCCCGGGCACCGGCGGCAGCAGCGGCGCCGACTACCTGCGCGAGGCCGCCGAGCGCCCGCTGTTCCCGGCCCTGAGCCCGGGCGGCCCGCACGCCTGA。
Claims (4)
1.一种小白链霉菌基因工程菌，其特征在于：
所述小白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶TDC基因和N-乙酰基转移酶SNAT基因；
或，所述白链霉菌基因工程菌为于出发菌株的染色体上插入内源的色氨酸脱羧酶TDC基因和N-乙酰基转移酶SNAT基因、异源的色氨酸转运蛋白Mtr基因和异源的色氨酸羟化酶Luz15基因；
所述出发菌株为小白链霉菌Streptomyces albulus CICC 11022；
色氨酸脱羧酶TDC基因序列如序列1所示；
N-乙酰基转移酶SNAT基因序列如序列2所示；
色氨酸转运蛋白Mtr基因序列如序列3所示；
色氨酸羟化酶Luz15基因序列如序列4所示。
2.一种权利要求1所述的小白链霉菌基因工程菌的构建方法，其特征在于：
所述工程菌株为使用EcoR I酶切载体pSET152-TDC获得线性化片段，通过Infusion无缝克隆技术与内源的N-乙酰基转移酶SNAT基因进行连接，获得重组表达质粒pSET152-TDC-SNAT；将表达质粒pSET152-TDC-SNAT先转移到大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，然后利用接合转移方法将其转入小白链霉菌野生菌CICC 11022，使pSET152-TDC-SNAT整合到该菌株的染色体上，获得TDC和SNAT共表达工程菌株—小白链霉菌Q-TDC-SNAT。
3.一种权利要求1所述的小白链霉菌基因工程菌的应用，其特征在于：所述工程菌在N-乙酰血清素生产中的应用。
4.根据权利要求3所述的小白链霉菌基因工程菌的应用，其特征在于：所述工程菌在以5-羟基色氨酸、色氨酸或血清素为底物生产N-乙酰血清素中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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