CN117965325A - 一种产黄青霉菌株及其应用 - Google Patents

一种产黄青霉菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种产黄青霉菌株及其应用，通过CRISPR/Cas9技术将扩环酶基因整合到产黄青霉野生菌株的基因组，如替换ku70位置，构建一种用于生产Ad‑7‑ADCA的非天然存在的产黄青霉菌株，并且能够仅利用发酵液中存在的廉价外源碳源自身代谢的方式合成Ad‑7‑ADCA。

Description

一种产黄青霉菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种产黄青霉菌株及其应用，具体涉及一种可以合成 7-ADCA的产黄青霉菌株及其应用，属于合成生物学领域。
背景技术
β-内酰胺类抗生素是一类重要的抗生素，这类抗生素中，突出的有青霉素类和头孢菌素类。
产黄青霉(Penicillium chrysogenum)是青霉属无性丝状真菌，是工业上典型的青霉素生产菌，1943年首次分离出产黄青霉NRRL 1951，青霉素产量150 mg/L，由此产黄青霉成为生产青霉素的主要菌种。NRRL 1951经多代诱变，得到了青霉素产量日益增高、性状越来越优良的产黄青霉菌株，如X-1612、 WisQ-176、WisBL3-D10、Wis48-701、Wis49-133、Wis54-1255、DS04825、 AS-P-78等。目前传统的菌种改造和发酵调控难以使产黄青霉的产青霉素水平有较大提高。而目前工业界偏好的用于制备头孢菌素中间产物7-氨基-脱乙酰氧基头孢烷酸(7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，7-ADCA)的方法涉及复杂的化学步骤，其中必要化学步骤之一涉及将5元青霉素环结构扩展为6元头孢菌素环结构，该化学加工过程既昂贵又对环境有害。因此为高效、环保的提高产量，应用基因工程技术将产黄青霉改良成为适于头孢菌素中间体7-ADCA工业生产成为目前的主要研究任务。
研究表明，扩环酶能将具有特定侧链的青霉素扩环成相应的7-ADCA 衍生物，如在P.chrysogenum中对扩环酶的体内验证时提供乙酰转移酶的底物己二酸，P.chrysogenum可以生成己二酰-6-氨基青霉烷酸 (adipyl-6-aminopenicillanic acid，Ad-6-APA)，然后Ad-6-APA被引入P. chrysogenum菌株的扩环酶转化，以产生己二酰-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(adipyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，Ad-7-ADCA)，最后通过对 Ad-7-ADCA去除侧链，产生了作为最终产物的7-ADCA，因此该方法对体内合成7-ADCA及其衍生物提供思路。
CN101040043A中介绍了一种具有扩环酶活性的突变型扩环酶，其中一个扩环酶突变体H127在菌株中较未突变的野生型扩环酶(EP-A-0341892) 的表达菌株相比，具有提高到六倍的针对Ad-6-APA体外扩环的酶活性。但是此专利仅使用了一个IPNS启动子，并未比较不同启动子对扩环酶突变体效果的影响，也未展示在具体菌株中该扩环酶的具体表达效果。
在产黄青霉表达系统方面，研究人员(任志红,徐平,王富强,苏彩云,丰玫玫,张佳,戴梦,韦春玲,穆岷,贺建功.产黄青霉工业生产菌种基因报告系统的构建及启动子效率的评价[J].菌物学报,2005,24(3))以四种不同物种来源,不同代谢途径功能基因的启动子为材料,分别构建了以产黄青霉异青霉素N合成酶 (IPNS)基因pcbC的启动子Pipns、构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的启动子PgpdA、构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子PtrpC、粗糙脉胞霉氨基酸合成交叉途径控制基因cpc的启动子Pcpc为启动子,腐草霉素(phleomycin)抗性基因为报告基因,构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的终止子TtrpC为终止信号的丝状真菌转基因质粒,建立了产黄青霉工业生产菌种启动子筛选、评价体系, 调查了这四种启动子的强弱。结果表明选择性标记基因受强启动子驱动可以提高产黄青霉工业生产菌种的转基因效率。研究也显示这四种启动子的强弱的顺序为PgpdA、Pcpc、Pipns和PtrpC。但是此种强弱顺序是否对扩环酶有效，需要进一步实验验证。
本发明旨在通过CRISPR/Cas9技术将扩环酶整合到产黄青霉野生株的基因组，实现中间产物Ad-7-ADCA的体内合成，并通过不同启动子的改造以提高扩环酶的表达量，为后期7-ADCA的合成过程进行改造奠定基础。
发明内容
本发明第一个方面提供一种产黄青霉菌株，所述产黄青霉菌株可以合成己二酰-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(adipyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，Ad-7-ADCA)，所述的产黄青霉菌株过表达外源扩环酶(Expandase，简称为AdEx)。
在一些具体实施方案中，所述扩环酶上游连接有启动子，所述启动子选自下列组：Ptef1、PgapA、PtrpC、Pipns，所述启动子的核苷酸序列为SeqNo.8、 SeqNo.9、SeqNo.10、SeqNo.11；所述启动子优选为Ptef1，Ptef1的核苷酸序列为SeqNo.8。
在一些具体实施方案中，所述扩环酶通过基因编辑手段整合到产黄青霉野生株的基因组，优选地通过扩环酶基因替换Ku70基因。
在一些具体实施方案中，所述的产黄青霉菌株为具有改善的β-内酰胺产量的产黄青霉菌株，优选地，如X-1612、WisQ-176、WisBL3-D10、Wis48-701、 Wis49-133、Wis54-1255、DS04825、AS-P-78，更优选地，所述的产黄青霉菌株为为采购于中国普通微生物菌种保藏管理中心的CGMCC3.15712。
在一些具体实施方案中，所述扩环酶是来源自Streptomyces clavuligerus 的扩环酶的突变体。
在一些具体实施方案中，所述扩环酶为序列1-序列7中任一序列所示核苷酸编码的氨基酸。优选地，所述突变型扩环酶核苷酸序列为SeqNo.5编码的突变型扩环酶。
本发明第二个方面提供一种表达盒，所述表达盒包括启动子，编码扩环酶的基因和终止子；所述启动子选自下列组：Ptef1、PgapA、Ptrpc、Pipns。所述启动子的核苷酸序列为SeqNo.8、SeqNo.9、SeqNo.10、SeqNo.11，优选的，所述启动子的核苷酸序列为Seq No.8；所述扩环酶是来源自 Streptomyces clavuligerus的扩环酶的突变体，优选地，所述突变型扩环酶为序列1-序列7中任一序列编码的突变型扩环酶，更优选地，所述突变型扩环酶核苷酸序列为SeqNo.5编码的突变型扩环酶。
本发明第三个方面提供一种重组质粒，所述重组质粒包括如第二方面所述的表达盒；优选所述的重组质粒的骨架质粒为pUC57质粒。
本发明第四方面提供一种质粒组合，其包括Cas9表达质粒、sgRNA质粒，或者Cas9和sgRNA的融合质粒，以及第三方面所述的重组质粒；所述 Cas9表达质粒和sgRNA质粒用于将第二方面所述的表达盒同源重组至产黄青霉野生株的基因组中。
本发明第五个方面还提供第一方面所述的产黄青霉菌株或第二方面所述的表达盒或第三方面所述的重组质粒或第四方面所述的质粒组合在合成己二酰-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(adipyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid， Ad-7-ADCA)或7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，7-ADCA)中的应用。
本发明第六个方面还提供一种合成己二酰-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(adipyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，Ad-7-ADCA)的方法，其特征在于在含有己二酸的培养基中培养第一方面所述的产黄青霉菌株。
在一些具体实施方案中，所述的制备方法为在1号培养基中培养后，转至小米培养基中培养，继而转至发酵培养基中进行发酵；更优选地，所述1 号培养基包括甘油、红糖、酵母粉、氯化钠、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸钙、硫酸铜、琼脂；所述小米培养基包括玉米浆、硝酸钠、氯化钠、磷酸二氢钾、三氯化铁、硫酸镁、硫酸铜；
所述发酵培养基包括玉米浆、硫酸铵、碳酸钙、磷酸二氢钾、硫酸钠、乳糖、酵母粉、己二酸；和/或，所述培养和发酵的温度为21-28℃，例如为 25℃；和/或，所述培养在震荡中进行，所述震荡的转速为220-260rpm，例如为250rpm；和/或，所述培养的时长为5-10天，例如为7天；和/或，
所述发酵的时长为4-15天，例如为12天。
本发明第七个方面还提供构建第一方面所述产黄青霉菌株的方法，其特征在于通过CRISPR-Cas9系统介导的同源重组方式，将扩环酶整合到产黄青霉野生株的基因组，优选地通过扩环酶基因替换Ku70基因。
在一些具体实施方案中，CRISPR-Cas9系统中引导Ku70基因敲除的sgRNA为两条，包括：sgRNA1：Cccaggaagtcaagcaactg；sgRNA2 gcagaaaagcatgttggcca。
在在一些具体实施方案中，引导同源重组的系统包含左同源臂和右同源臂，扩增左同源臂的左侧引物为： gagagtgcaccatatgATAAAGAAGTATCGGTG，扩增右同源臂的右侧引物为：gattacgccaagcttTATCGGGATTTCATCATTG；左右同源臂长度皆为2.0Kb，扩增模板为产黄青霉基因组DNA。
术语解释
扩环酶
在本发明中，术语扩环酶表示扩环酶(EC1.14.20.1，由cefE基因编码)，具有将5元青霉素环结构扩展为6元头孢菌素环结构的活性。
在本发明中，优选的是来源自S.clavuligerus的野生型扩环酶的突变型扩环酶。突变型扩环酶是指如CN101040043A所报道的下述突变体：
选自由位置2、18、59、73、74、89、90、99、101、105、112、113、155、170、177、209、213、217、244、249、251、277、278、280、281、284、293、 300、307和311构成的组1中的氨基酸位置经过修饰。上述位置编号是用S. clavuligerus的cefE基因编码的扩环酶的氨基酸序列(CN101040043A中序列1) 的氨基酸位置编号来表示的。
优选的突变型扩环酶是序列1-7号所示核酸编码的突变型扩环酶。
最优选的突变型扩环酶是序列5所示核酸编码的突变型扩环酶。
本发明优选的启动子包括：
Ptef1启动子，其为嗜热毁丝霉翻译延伸因子TEF1A的启动子，其序列如 Seq No.8所示；
PgapA启动子，其为来源自E.coli的组成型启动子，其序列如Seq No.9所示；
PtrpC启动，其为构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的启动子PtrpC，其序列如 SeqNo.10所述；
Pipns启动子，产黄青霉异青霉素N合成酶(IPNS)基因pcbC的启动子 Pipns，其序列如Seq No.11所述。
最优选的启动子为Ptef1启动子。
本发明中所使用的其他技术术语，如无特殊说明，其具有生物领域的通常含义。
本发明通过CRISPR/Cas9技术将扩环酶整合到产黄青霉野生株的基因组，实现中间产物Ad-7-ADCA的体内合成，并通过不同启动子的改造以提高扩环酶的表达量。
附图说明
图1：AdEx敲入示意图
图2：pFC-AdEx1表达质粒图谱
图3：pFC-AdEx2表达质粒图谱
图4：pFC-AdEx3表达质粒图谱
图5：pFC-AdEx4表达质粒图谱
图6：pFC-AdEx5表达质粒图谱
图7：pFC-AdEx6表达质粒图谱
图8：pFC-AdEx7表达质粒图谱
图9：sgRNA和Cas9融合质粒PCsg-ku70质粒图谱
图10：pInsert-PTef1-AdEx5质粒图谱
图11：pInsert-PgapA-AdEx5质粒图谱
图12：pInsert-PTrpc-AdEx5质粒图谱
图13：pInsert-INPS-AdEx5质粒图谱
图14：pANcas9-03质粒图谱
图15：Ad-7-ADCA检测图谱
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图和本发明的优选实施例进行详细描述。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
产黄青霉(Penicillium chrysogenum)采购于中国普通微生物菌种保藏管理中心CGMCC3.15712；大肠杆菌Trans 10感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；质粒pFC333购买自addgene；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购买自生工生物工程(上海)股份有限公司，SDS-PAGE试剂盒购买自上海雅酶生物科技有限公司；质粒pANcas9-03质粒由本公司前期构建；sgRNA表达框序列、扩环酶AdEx序列1-7号(Expandase，本发明中简称为AdEx)，序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，启动子PtrpC、Pipns、PgpdA 序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并插入在pUC57载体NdeI、 HindⅢ酶切位点之间，获得pUC57-SgRNA、pUC57-AdEx1-7、pUC57-PTrpc、 pUC57-INPS、pUC57-PgapA质粒。
AD-7-ADCA的HPLC检测方法：
色谱柱：Agilent Eclipse plus C18(3.5μm，150×4.6mm)；流动相：0.1％TFA 水溶液为流动相A，0.1％TFA乙腈溶液为流动相B；流速：1ml/min；梯度洗脱程序：90％A+10％B(0.00min)，30％A+70％B(10.00min)，0％A+100％B (12.00min)，0％A+100％B(13.00min)，90％A+10％B(13.5min)，90％A+10％B (20.00min)；柱温：35℃；进样量：10μL；检测波长：214nm/254nm。
实施例1AdEx酶活筛选
(1)根据表3中的引物(擎科合成)、模板进行pFC-AdEx1、pFC-AdEx2、 pFC-AdEx3、pFC-AdEx4、pFC-AdEx5、pFC-AdEx6、pFC-AdEx7等质粒构建过程中各片段的特异性扩增，采用Takala公司的高保真酶Primer Star Mix进行 PCR反应，反应体系如下：
表1PCR扩增反应体系
PCR扩增程序如下：
表2PCR反应程序
(2)扩增产物取5μl进行1％的琼脂电泳，检测扩增结果。采用凝胶回收试剂盒对目的片段进行切胶回收。采用NEB的多片段重组酶将目的片段进行连接重组，连接重组产物转化至大肠杆菌感受态细胞Trans 10。加入灭菌的 LB液体培养基，37℃250rpm震荡培养1h；挑点至事先加入氨苄抗生素的LB 固体平板上，37℃倒置过夜培养；
(3)待长出白色单菌落后，挑取白色单菌落于含有2mLLB液体培养基的离心管中(含100μg/ml氨苄抗生素)，37℃180rpm震荡培养6h；
(4)对菌液进行PCR检测，将取验证为阳性的菌液500μl送擎科公司测序，并将剩余菌液保存于20％甘油中。
(5)扩大培养测序验证正确的菌种，采用生工的质粒提取试剂盒进行质粒提取，获得质粒pFC-AdEx1、pFC-AdEx2、pFC-AdEx3、pFC-AdEx4、 pFC-AdEx5、pFC-AdEx6、pFC-AdEx7等。
表.3pCF-AdEx(1-7号)构建所需引物
实施例2产黄青霉原生质体的制备
(1)KST缓冲液：0.7M KCl，0.8M山梨醇，20mM Tris-HCl，PH5.8-6.4。
(2)STC缓冲液：2.5g二水氯化钙，109.5g山梨醇，5.0mL 1M Tris-HCl (pH7.5)溶于250mL水，分装成50mL一管后，121℃灭菌15min。
(3)YPG培养基：胰蛋白胨20g/l、酵母粉10g/l、甘油20ml/L
(4)产黄青霉孢子接种于YPG培养基，25℃下培养3d，获得种子液。随后将种子液以5％的接种量接入新鲜的YPG培养基，25℃下培养24h。菌体离心后，用KST缓冲液洗涤2遍，然后在溶壁酶1％，纤维素酶2％，Yatalase 1％的混合酶液中酶解2-3h，酶解液用10层纱布进行过滤。滤液4000rpm离心 10min，用STC缓冲液洗涤一次，然后悬浮于一定体积的STC缓冲液，将原生质体的数量调整至1×107个/mL，分装于1.5mL离心管，每管200μL。
实施例3pFC-AdEx(1-7号)在产黄青霉中表达
(1)再生培养基：10g一水葡萄糖，0.5g七水硫酸镁，3g氯化钠，342g 蔗糖，1ml 1％的硫酸亚铁，琼脂20g，2g/l的硝酸钠，体积1L。
(2)1号培养基：甘油0.75％、红糖1％、酵母粉0.3％、氯化钠0.9％、硫酸亚铁0.0002％磷酸二氢钾0.0006％、硫酸镁0.0006％、硫酸钙0.025％、硫酸铜0.0001％、琼脂2.0％、pH调至6.2，121℃灭菌30min。
(3)将表达质粒pFC-AdEx1、pFC-AdEx2、pFC-AdEx3、pFC-AdEx4、 pFC-AdEx5、pFC-AdEx6、pFC-AdEx7分别转入产黄青霉原生质体，轻轻混匀，放在冰上孵育1h。
(4)从冰上取出，室温放置2min，加入1mL的60％的PEG 4000solution，轻轻旋转混匀，室温孵育25min。
(5)将原生质体混合液转移到无菌的15mL离心管中，加入10mL的1M 山梨醇，轻轻混匀，4000rpm离心10min，收集原生质体。
(6)取100-200μl原生质体涂布于含50ug/mL腐草霉素的再生培养基筛选平板，25℃培养7-10d。待筛选培养平板上长出白色小菌落后将其转入加有 50ug/mL腐草霉素1号培养基平板，24℃下培养5d左右，并将含有表达质粒的菌株命名为PCIS001、PCIS002、PCIS003、PCIS004、PCIS005、PCIS006、 PCIS007。
(7)挑取单菌落菌块于400μl无菌水中，利用核酸提取仪(8m/s、8个循环)对菌体破碎制备PCR反应所需DNA模板。对敲入转化子PCIS001、 PCIS002、PCIS003、PCIS004、PCIS005、PCIS006、PCIS007验证分别使用表1中引物AdEx扩增引物对目的基因AdEx验证，PCR反应条件同实施例1， PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
实施例4PCIS001-PCIS007菌株进行Ad-7-ADCA的合成
(1)2号培养基配制：玉米浆1.1％、硝酸钠0.6％、氯化钠0.4％、磷酸二氢钾0.6％、三氯化铁0.0003％、硫酸镁0.05％、硫酸铜0.0001％、pH调至5.2。
(2)小米培养基：称取所需要的小米，加入适量的2号培养基[增重为 26％—38％]，搅拌均匀待米吸收尽水后，放灭菌锅121℃蒸20分钟，搓散分装茄子瓶内，每瓶为30克，包头再放灭菌锅121℃灭菌30分钟后放入无菌室。
(3)发酵培养基组分：玉米浆2.5％、硫酸铵0.45％、碳酸钙0.8％、磷酸二氢钾0.4％、硫酸钠0.15％、乳糖11％、酵母粉0.5％、pH调至6.2-6.4、5g/L 己二酸，发酵瓶配制时加4滴油，用NaOH调pH(装量为50ml/瓶)。
(4)米孢子制备：取接种于1号培养基、24℃、相对湿度60％培养6d左右、已变绿的孢子于500ml无菌水中，用无菌的匀浆器制备孢子悬液，然后将孢子悬液加入到制备好的小米培养基中，混匀，于24℃、相对湿度60％培养至产孢，每24h翻米一次。
(5)取米孢子20粒左右加入到发酵培养基，25℃，250rpm培养，每24h 补加200μl的250mMα-酮戊二酸(pH调至7.0)和250μl的1％己二酸(pH调至 7.0)。
(6)发酵4d开始取样检测：样品处理方式为250μl发酵液+750μl水+4ml 甲醇(稀释20倍)，混匀、离心、过膜除杂质，按照HPLC检测方法进行检测。各菌株在发酵12d时产物含量达到最高值，Ad-7-ADCA含量见表4，其中含有pFC-AdEx5表达质粒的PCIS005菌株合成的Ad-7-ADCA产量最高， Ad-7-ADCA检测图谱见附图，其中图15为Ad-7-ADCA检测图谱。通过表4数据可知含有pFC-AdEx5表达质粒的PCIS005菌株合成的Ad-7-ADCA产量最高，因此选取扩环酶AdEx5做进一步的启动子优化。
表4Ad-7-ADCA含量检测结果
实施例5CRISPR/Cas9敲除系统sgRNA和Cas9融合质粒PCsg-ku70、 AdEx5敲入质粒pInsert-Ptef1-AdEx5等的构建
载体构建所需引物及模板如表5，经测序验证获得构建成功的pCsg-ku70、pInsert-pTef1-AdEx5等质粒。
表5pCsg-ku70、pInsert-AdEx构建所需引物
实施例6产黄青霉原生质体的制备
(1)产黄青霉原生质体的制备同实施例2。
(2)再生培养基及其转化过程中所需试剂同实施例3
(3)按照以下质粒组合pCsg-ku70+pInsert-Ptef1-AdEx5、 pCsg-ku70+pInsert-PgapA-AdEx5、pCsg-ku70+pInsert-Ptrpc-AdEx5、pCsg-ku70+pInsert-INPS-AdEx5分别转入产黄青霉原生质体，轻轻混匀，放在冰上孵育1h。
(4)从冰上取出，室温放置2min，加入1mL的60％的PEG 4000solution，轻轻旋转混匀，室温孵育25min。
(5)将原生质体混合液转移到无菌的15mL离心管中，加入10mL的1M 山梨醇，轻轻混匀，4000rpm离心10min，收集原生质体。
(6)取100-200μl原生质体涂布于含50ug/mL腐草霉素的再生培养基筛选平板，25℃培养7-10d。待筛选培养平板上长出白色小菌落后将其转入加有 50ug/mL腐草霉素1号培养基平板，24℃下培养5d左右，并将进行AdEx5完整阅读框PTef1-AdEx5、PgapA-AdEx5、PTrpc-AdEx5、INPS-AdEx5敲入基因组 Ku70位点的菌株分别命名为PCIS008、PCIS0010、PCIS011、PCIS014。
(7)挑取单菌落菌块于400μl无菌水中，利用核酸提取仪(8m/s、8个循环)对菌体破碎制备PCR反应所需DNA模板。对敲入转化子PCIS008、 PCIS0010、PCIS011、PCIS014进行PCR反应，PCR产物送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。
实施例7利用PCIS008、PCIS010、PCIS011、PCIS014进行Ad-7-ADCA 的生产
(1)2号培养基配制：玉米浆1.1％、硝酸钠0.6％、氯化钠0.4％、磷酸二氢钾0.6％、三氯化铁0.0003％、硫酸镁0.05％、硫酸铜0.0001％、pH调至5.2。
(2)小米培养基：称取所需要的小米，加入适量的2号培养基[增重为 26％—38％]，搅拌均匀待米吸收尽水后，放灭菌锅121℃蒸20分钟，搓散分装茄子瓶内，每瓶为30克，包头再放灭菌锅121℃灭菌30分钟后放入无菌室。
(3)发酵培养基组分：玉米浆2.5％、硫酸铵0.45％、碳酸钙0.8％、磷酸二氢钾0.4％、硫酸钠0.15％、乳糖11％、酵母粉0.5％、pH调至6.2-6.4、5g/L 己二酸，发酵瓶配制时加4滴油，用NaOH调pH(装量为50ml/瓶)。
(4)米孢子制备：取接种于1号培养基、24℃、相对湿度60％培养6d左右、已变绿的孢子于500ml无菌水中，用无菌的匀浆器制备孢子悬液，然后将孢子悬液加入到制备好的小米培养基中，混匀，于24℃、相对湿度60％培养至产孢，每24h翻米一次。
(5)取米孢子20粒左右加入到发酵培养基，25℃，250rpm培养，每24h 补加200μl的250mMα-酮戊二酸(pH调至7.0)和250μl的1％己二酸(pH调至 7.0)。
(6)发酵4d开始取样检测：样品处理方式为250μl发酵液+750μl水+4ml 甲醇(稀释20倍)，混匀、离心、过膜除杂质，按照HPLC检测方法进行检测。各菌株在发酵12d时产物含量达到最高值，Ad-7-ADCA含量见表6，其中处理使用Tef1启动子调控AdEx5表达时即菌株PCIS008的Ad-7-ADCA含量最高，Ad-7-ADCA检测图谱见附图，其中图15为Ad-7-ADCA检测图谱。
表6Ad-7-ADCA含量检测结果
AdEx1核酸序列(Seq No.1)：
atggacacgacggtgcccaccttcagcctggccgaactccagcagggcctgcgccaggacgagttccgcaggtgtctgagggacaagggcctcttctatctgacggactgcggtctgaccgacaccgagctgaagtcggccaaggacatcgtcatcgacttcttcgagcacggcagc gaggcggagaagcgcgccgtcacctcgcccgtccccaccatgcgccgcggcttcaccgggctggagtcggagagcaccgcccagattaccaataccggcagctactccgactactcgatgtgctactcgatgggcaccgcggacaacctcttcccgtccggtgacttcgagcggatc tggacccagtacttcgaccgccagtacaccgcctcccgcgcggtcgcccgggaggtcctgcgggcgaccgggaccgagcccgacggcggggtcgaggccttcctcgactgggagccgctgctgcggttccgctacttcccgcaggtccccgagcaccgcagcgccgaggagca gctcctgcggatggcgccgcactacgacctgtcgatggtcaccctcatccagcagacaccctgcgccaacggcttcgtcagcctccaggccgaggtcggcggcgcgttcacggacctgccctaccgtccggacgccgtcctcgtcttctgcggcgccatcgcgaccctggtgaccgg cggccaggtcaaggccccccggcaccatgtcgcggccccccgcagggaccagatagcgggcagcagccgcacctccagtgtgttcttcctccgtcccaacgcggacttcaccttctccgtcccgcaggcgcgcggctacggcttcaatgtcagcctggacggcgagaccgccacgt tccaggattggatcggggtcaactacgtgaacatccgccgcacatccaaggattga
AdEx2核酸序列(Seq No.2)：
atggacacgacggtgcccaccttcagcctggccgaactccagcagggcctgcgccaggacgagttccgcaggtgtctgagggacaag ggcctcttctatctgacggactgcggtctgaccgacaccgagctgaagtcggccaaggacatcgtcatcgacttcttcgagcacggcagcgaggcggagaagcgcgccgtcacctcgcccgtccccaccatccgccgcggcttcaccgggctggagtcggagagcaccgcccagat taagaataccggcagctactccgactactcgatgtgctactcgatgggcaccgcggacaacctcttcccgtccggtgacttcgagcggatctggacccagtacttcgaccgccagtacaccgcctcccgcgcggtcgcccgggaggtcctgcgggcgaccgggaccgagcccgacg gcggggtcgaggccttcctcgactgcgagccgctgctgcggttccgctacttcccgcaggtccccgagcaccgcagcgccgaggagcagcccctgcggatggcgccgcactacgacctgtcgatggtcaccctcatccagcagacaccctgcgccaacggcttcgtcagcctccag gccgaggtcggcggcgcgttcacggacctgccctaccgtccggacgccgtcctcgtcttctgcggcgccatcgcgaccctggtgaccggcggccaggtcaaggccccccggcaccatgtcgcggccccccgcagggaccagatagcgggcagcagccgcacctccagtgtgttc ttcctccgtcccaacgcggacttcaccttctccgtcccgctggcgcgcgagtacggcttcaatgtcagcctggacggcgagaccgccaagttccaggattggatcagcgtcaactacgtgaacatccgcaccacatccaaggactga
AdEx3核酸序列(Seq No.3)：
atgtacacgacggtgcccaccttcagcctggccgaactccagcagggcctgcgccaggacgagttccgcaggtgtctgagggacaag ggcctcttctatctgacggactgcggtctgaccgacaccgagctgaagtcggccaaggacatcgtcatcgacttcttcgagcacggcagcgaggcggagaagcgcgccgtcacctcgcccgtccccaccatgcgccgcggcttcaccgggctggagtcggagagcaccgcccagat taccaataccggcagctactccgactactcgatgtgctactcgatgggcaccgcggacaacctcttcccgtccggtgacttcgagcggatctggacccagtacttcgaccgccagtacaccgcctcccgcgcggtcgcccgggaggtcctgcgggcgaccgggaccgagcccgacgg cggggtcgaggccttcctcgactgggagccgctgctgcggttccgctacttcccgcaggtccccgagcaccgcagcgccgaggagcagcccctgcggatggcgccgcactacgacctgtcgatggtcaccctcatccagcagacaccctgcgccaacggcttcgtcagcctccagg ccgaggtcggcggcgcgttcacggacctgccctaccgtccggacgccgtcctcgtcttctgcggcgccatcgcgaccctggtgaccggcggccaggtcaaggccccccggcaccatgtcgcggccccccgcagggaccagatagcgggcagcagccgcacctccagtgtgttctt cctccgtcccaacgcggacttcaccttctccgtcccgctggcgcgcgagtacggcttcaatgtcagcctggacggcgagaccgccacgttccaggattggatcggggtcaactacgtgaacatccgccgcacatccaaggactga
AdEx4核酸序列(Seq No.4)：
ATGGACACGACGGTGCCCACCTTCAGCCTGGCCGAACTCCAGCAGGGCCTGCGCCA GGACGAGTTCCGCAGGTGTCTGAGGGACAAGGGCCTCTTCTATCTGACGGACTGCGGTCTGACCGACACCGAGCTGAAGTCGGCCAAGGACATCGTCATCGACTTCTTCGAG CACGGCAGCGAGGCGGAGAAGCGCGCCGTCACCTCGCCCGTCCCCACCATGCGCCGCGGCTTCACCGGGCTGGAGTCGGAGAGCACCGCCCAGATTACCAATACCGGCAG CTACTCCGACTACTCGATGTGCTACTCGATGGGCACCGCGGACAACCTCTTCCCGTCCGGTGACTTCGAGCGGATCTGGACCCAGTACTTCGACCGCCAGTACACCGCCTCCCGCGCGGTCGCCCGGGAGGTCCTGCGGGCGACCGGGACCGAGCCCGACGGCGGGGTCGAGGCCTTCCTCGACTGCGAGCCGCTGCTGCGGTTCCGCTACTTCCCGCAGGTCCCCGAGCACCGCAGCGCCGAGGAGCAGCCCCTGCGGATGGCGCCGCACTACGACCT GTCGATGGTCACCCTCATCCAGCAGACACCCTGCGCCAACGGCTTCGTCAGCCTCCAGGCCGAGGTCGGCGGCGCGTTCACGGACCTGCCCTACCGTCCGGACGCCGTCCTC GTCTTCTGCGGCGCCATCGCGACCCTGGTGACCGGCGGCCAGGTCAAGGCCCCCCGGCACCAAGTCGCGGCCCCCCGCAGGGACCAGATAGCGGGCAGCAGCCGCACCTCC AGTGTGTTCTTCCTCCGTCCCAACGCGGACTTCACCTTCTCCGTCCCGCTGGCGCGCGAGTGCGGCTTCAATGTCAGCCTGGACGGCGAGACCGCCACGTTCCAGGATTGGAT CGGGGTCAACTACGTGAACATCCGCCGCACATCCAAGGCATGA
AdEx5核酸序列(Seq No.5)：
ATGGACACGACGGTGCCCACCTTCAGCCTGGCCGAACTCCAGCAGGGCCTGCGCCA GGACGAGTTCCGCAGGTGTCTGAGGGACAAGGGCCTCTTCTATCTGACGGACTGCGGTCTGACCGACACCGAGCTGAAGTCGGCCAAGGACATCGTCATCGACTTCTTCGAG CACGGCAGCGAGGCGGAGAAGCGCGCCGTCACCTCGCCCGTCCCCACCATGCGCC GCGGCTTCACCGGGCTGGAGTCGGAGAGCACCGCCCAGATTACCAATACCGGCAGCTACTCCGACTACTCGATGTCGTACTCGATGGGCACCGCGGACAACCTGTTCCCCA GCGCCGAGTTCGAGAAGGCGTGGGAGGACTACTTCGCGCGGATGTACCGCGCTTCGCAGGACGTCGCGCGGCAGGTGCTGACCTCGGTCGGCGCGGAACCCGAGGTCGGCATGGACGCCTTCCTCGACTGCGAACCCCTGCTGCGCCTGCGCTACTTCCCCGAGGTGCCCGAGGATCGCGTGGCCGAGGAGCAGCCGCTGCGGATGGCCCCGCACTACGAC CTGTCGATGGTCACCCTCATCCAGCAGACACCCTGCGCCAACGGCTTCGTCAGCCTCCAGGCCGAGGTCGGCGGCGCGTTCACGGACCTGCCCTACCGTCCGGACGCCGTCC TCGTCTTCTGCGGCGCCATCGCGACCCTGGTGACCGGCGGCCAGGTCAAGGCCCCC CGGCACCATGTCGCGGCCCCCCGCAGGGACCAGATAGCGGGCAGCAGCCGCACCTCCAGTGTGTTCTTCCTCCGTCCCAACGCGGACTTCACCTTCTCCGTCCCGCTGGCGC GCGAGTGCGGCTTCAATGTCAGCCTGGACGGCGAGACCGCCACGTTCCAGGATTGGATCGGGGTCAACTACGTGAACATCCGCCGCACATCCAAGGCATGA
AdEx6核酸序列(Seq No.6)：
ATGGACACGACGGTGCCCACCTTCAGCCTGGCCGAACTCCAGCAGGGCCTGCGCCA GGACGAGTTCCGCAGGTGTCTGAGGGACAAGGGCCTCTTCTATCTGACGGACTGCGGTCTGACCGACACCGAGCTGAAGTCGGCCAAGGACATCGTCATCGACTTCTTCGAG CACGGCAGCGAGGCGGAGAAGCGCGCCGTCACCTCGCCCGTCCCCACCACGCGCCGCGGCTTCACCGGGCTGGAGTCGGAGAGCACCGCCCAGATTACCAATACCGGCAG CTACTCCGACTACTCGATGTGCTACTCGATGGGCACCGCGGACAACCTCTTCCCGTCCGGTGACTTCGAGCGGATCTGGACCCAGTACTTCGACCGCCAGTACACCGCCTCCCGCGCGGTCGCCCGGGAGGTCCTGCGGGCGACCGGGACCGAGCCCGACGGCGGGGTCGAGGCCTTCCTCGACTGCGAGCCGCTGCTGCGGTTCCGCTACTTCCCGCAGGTCC CCGAGCACCGCAGCGCCGAGGAGCAGCCCCTGCGGATGGCGCCGCACTACGACCTGTCGATGGTCACCCTCATCCAGCAGACACCCTGCGCCAACGGCTTCGTCAGCCTCC AGGCCGAGGTCGGCGGCGCGTTCACGGACCTGCCCTACCGTCCGGACGCCGTCCTCGTCTTCTGCGGCGCCATCGCGACCCTGGTGACCGGCGGCCAGGTCAAGGCCCCCCG GCACCATGTCGCGGCCCCCCGCAGGGACCAGATAGCGGGCAGCAGCCGCACCTCCAGTGTGTTCTTCCTCCGTCCCAACGCGGACTTCACCTTCTCCGTCCCGCTGGCGCGC GAGTGCGGCTTCAATGTCAGCCTGGSCGGCGAGACCGCCACGTTCCAGGATTGGATCGGGGTCAACTACGTGAACATCCGCCGCACATCCAAGGCATGA
AdEx7核酸序列(Seq No.7)：
ATGTACACGACGGTGCCCACCTTCAGCCTGGCCGAACTCCAGCAGGGCCTGCACCA GGACGAGTTCCGCAGGTGTCTGAGGGACAAGGGCCTCTTCTATCTGACGGACTGCGGTCTGACCGACACCGAGCTGAAGTCGGCCAAGGACATCGTCATCGACTTCTTCGAG CACGGCAGCGAGGCGGAGAAGCGCGCCGTCACCTCGCCCGTCCCCACCATGCGCCGCGGCTTCACCGGGCTGGAGTCGGAGAGCACCGCCCAGATCACCAGCACCGGCAG CTACTCCGACTACTCGATGTGCTTCTCGATGGGCATCGCGGACAACCTCTTCCCGTCCGACGACTTCGAGCGGATCTGGACCCAGTACTTCGACCGCCAGTACACCGCCTCCC GCGCGGTCGCCCGGGAGGTCCTGCGGGCGACCGGGACCGAGCCCGACGGCGGGGTCGAGGCCTTCCTCGACTGGGAGCCGCTGCTGCGGTTCCGCTACTTCCCGCAGGTCC CCGAGCACCGCAGCGCCGAGGAGCAGATCCTGCGGATGGCGCCGCACTACGACCT GTCGATGGTCACCCTCATCCAGCAGACACCCTGCGCCAACGGCTTCGTCAGCCTCCAGGCCGAGGTCGGCGGCGCGTTCACGGACCTGCCCTACCGTCCGGACGCCGTCCTCGTCTTCTGCGGCGCCATCGCGACCCTGGTGACCGGCGGCCAGGTCAAGGCCCCCCGGCACCATGTCGCGGCCCCCCGCAGGGACCAGATAGCGGGCAGCAGCCGCACCTCC AGTGTGTTCTTCCTCCGTCCCAACGCGGACTTCACCTTCTCCGTCCCGCTGGCGCGCGAGTACGGCTTCGATGTCAGCCTGGACGGCGAGACCGCCACGTTCCAGGATTGGAT CGGGGGCAACTACGTGAACATCCGCACATCCAAGGACTGA
Ptef1核酸序列(Seq No.8)：
cgagacagcagaatcaccgcccaagttaagcctttgtgctgatcatgctctcgaacgggccaagttcgggaaaagcaaaggagcgttta gtgaggggcaatttgactcacctcccaggcaacagatgaggggggcaaaaagaaagaaattttcgtgagtcaatatggattccgagcatcattttcttgcggtctatcttgctacgtatgttgatcttgacgctgtggatcaagcaacgccactcgctcgctccatcgcaggctggtcgcagac aaattaaaaggcggcaaactcgtacagccgcggggttgtccgctgcaaagtacagagtgataaaagccgccatgcgaccatcaacgcgttgatgcccagctttttcgatccgagaatccaccgtagaggcgatagcaagtaaagaaaagctaaacaaaaaaaaatttctgcccctaagc catgaaaacgagatggggtggagcagaaccaaggaaagagtcgcgctgggctgccgttccggaaggtgttgtaaaggctcgacgcccaaggtgggagtctaggagaagaatttgcatcgggagtggggcgggttacccctccatatccaatgacagatatctaccagccaagggttt gagcccgcccgcttagtcgtcgtcctcgcttgcccctccataaaaggatttcccctccccctcccacaaaattttctttcccttcctctccttgtccgcttcagtacgtatatcttcccttccctcgcttctctcctccatccttctttcatccatctcctgctaacttctctgctcagcacctctacgcattactagccgtagtatctgagcacttctcccttttatattccacaaaacataacacaaccttcacc
PgapA核酸序列(SeqNo.9)：
CATATGgaattcccttgtatctctacacacaggctcaaatcaataagaagaacggttcgtctttttcgtttatatcttgcatcgtcccaaag ctattggcgggatattctgtttgcagttggctgacttgaagtaatctctgcagatctttcgacactgaaatacgtcgagcctgctccgcttggaagcggcgaggagcctcgtcctgtcacaactaccaacatggagtacgataagggccagttccgccagctcattaagagccagttcatggg cgttggcatgatggccgtcatgcatctgtacttcaagtacaccaacgctcttctgatccagtcgatcatccgctgaaggcgctttcgaatctggttaagatccacgtcttcgggaagccagcgactggtgacctccagcgtccctttaaggctgccaacagctttctcagccagggccagccc aagaccgacaaggcctccctccagaacgccgagaagaactggaggggtggtgtcaaggaggagtaagctccttattgaagtcggaggacggagcggtgtcaagaggatattcttcgactctgtattatagataagatgatgaggaattggaggtagcatagcttcatttggatttgctttcc aggctgagactctagcttggagcatagagggtcctttggctttcaatattctcaagtatctcgagtttgaacttattccctgtgaaccttttattcaccaatgagcattggaatgaacatgaatctgaggactgcaatcgccatgaggttttcgaaatacatccggatgtcgaaggcttggggcacctgcgttggttgaatttagaacgtggcactattgatcatccgatagctctgcaaagggcgttgcacaatgcaagtcaaacgttgctagcagttcc aggtggaatgttatgatgagcattgtattaaatcaggagatatagcatgatctctagttagctcaccacaaaagtcagacggcgtaaccaaaagtcacacaacacaagctgtaaggatttcggcacggctacggaagacggagaagccaccttcagtggactcgagtaccatttaattctatt tgtgtttgatcgagacctaatacagcccctacaacgaccatcaaagtcgtatagctaccagtgaggaagtggactcaaatcgacttcagcaacatctcctggataaactttaagcctaaactatacagaataagataggtggagagcttataccgagctcccaaatctgtccagatcatggttg accggtgcctggatcttcctatagaatcatccttattcgttgacctagctgattctggagtgacccagagggtcatgacttgagcctaaaatccgccgcctccaccatttgtagaaaaatgtgacgaactcgtgagctctgtacagtgaccggtgactctttctggcatgcggagagacggacg gacgcagagagaagggctgagtaataagccactggccagacagctctggcggctctgaggtgcagtggatgattattaatccgggaccggccgcccctccgccccgaagtggaaaggctggtgtgcccctcgttgaccaagaatctattgcatcatcggagaatatggagcttcatcg aatcaccggcagtaagcgaaggagaatgtgaagccaggggtgtatagccgtcggcgaaatagcatgccattaacctaggtacagaagtccaattgcttccgatctggtaaaagattcacgagatagtaccttctccgaagtaggtagagcgagtacccggcgcgtaagctccctaattgg cccatccggcatctgtagggcgtccaaatatcgtgcctctcctgctttgcccggtgtatgaaaccggaaaggccgctcaggagctggccagcggcgcagaccgggaacacaagctggcagtcgacccatccggtgctctgcactcgacctgctgaggtccctcagtccctggtaggca gctttgccccgtctgtccgcccggtgtgtcggcggggttgacaaggtcgttgcgtcagtccaacatttgttgccatattttcctgctctccccaccagctgctcttttcttttctctttcttttccca
PtrpC核酸序列(Seq No.10)：
TCGACAGAAGATGATATTGAAGGAGCACTTTTTGGGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAG GTCAACAATGAATGCCTATTTTGGTTTAGTCGTCCAGGCGGTGAGCACAAAATTTGTGTCGTTTGACAAGATGGTTCATTTAGGCAACTGGTCAGATCAGCCCCACTTGTAG CAGTAGCGGCGGCGCTCGAAGTGTGACTCTTATTAGCAGACAGGAACGAGGACAT TATTATCATCTGCTGCTTGGTGCACGATAACTTGGTGCGTTTGTCAAGCAAGGTAAGTGAACGACCCGGTCATACCTTCTTAAGTTCGCCCTTCCTCCCTTTATTTCAGATTCA ATCTGACTTACCTATTCTACCCAAGCAT
Pipns核酸序列(SeqNo.11)：
gaattccttatactgggcctgctgcattggtctgccattgcagggtatatatggctgacctggccaatctccatcgagaatctgggcgactga agaactgcccgcagacaagatggagactttcgtctagcacggtctagggcagatccgatgccattggctctgtcaactgtcgactacatgtatctgcatgttgcatcgggaaatcccaccacagggacagccaagcggccccgcgacttggcagtgggcaaactacgcccgattctggtg ccaagaaccgagaagaatgagacagacccacgttgcactctaaccggatgctatcgacttacggtggctgaagattcaacacgctgcaacgagagccaaggtggtccggacattttctacgtgccggtttaccttggaacatcgccgtcgttgagtgcacgttgcctactctctcgtggctt ggctgggcccacgagcccgattgactcgacggtgttacttgggtatctatggccccgttttctggcacggtaatgataagtacttactagtcttcgagcgggggagtgttgctctgcccgagcatcaacgattggcctgatcgcaccgtctgcaaatgccacggtgcggaccgactgaaatc tcagaccaccaaagaccctccgacttcgagatacggttactaattttacactggctccagcggccccatccagtaagcatctgggctgcaagcgtataatgtctccaggttgtctcagcataaacaccccgcccccgctcaggcacacaggaagagagctcaggtcgtttccattgcgtcca tactcttcactcattgtcatctgcaggagaacttcccctgtccctttgccaagccctctcttcgtcgttgtccacgccttcaagttttcaccattatttttctagac
Tef1终止子序列(Seq No.12)：
gcggacattcgatttatgccgttatgacttccttaaaaaagcctttacgaatgaaagaaatggaattagacttgttatgtagttgattctacaatg gattatgattcctgaacttcaaatccgctgttcattattaatctcagctcttcccgtaaagccaatgttgaaactattcgtaaatgtacctcgttttgcgtgtaccttgcttatcacgtgatattacatgacctggacagagttctgcgcgaaagtcataacgtaaatcccgggcggtaggtgcgtcccg ggcggaaggtagttttctcgtccaccccaacgcgtttatcaacctcaactttcaacaaccatcatgccaccaaaagcgcgtaaaacaaagcgagatttgattgagcaagagggcaggatccaatgcgcgattcaagacattaaaaatggaaaatttcaaaaaattgcgcccgcagcgcgtg catacaaaattcatcccaatac。

Claims (13)

1.一株产黄青霉菌株，其过表达外源扩环酶(Expandase，简称为AdEx)；
优选地，所述产黄青霉菌株可以合成己二酰-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(adipyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，Ad-7-ADCA)。
2.如权利要求1所述的产黄青霉菌株，所述过表达通过扩环酶上游连接有启动子的方式，所述启动子选自下列组：Ptef1、PgapA、PtrpC、Pipns，所述启动子的核苷酸序列为SeqNo.8、SeqNo.9、SeqNo.10、SeqNo.11；
优选地，所述启动子为Ptef1，所述启动子的核苷酸序列为SeqNo.8；
优选地，所述扩环酶通过基因编辑手段整合到产黄青霉野生株的基因组，优选地通过扩环酶基因替换Ku70基因。
3.如权利要求1或2所述的产黄青霉菌株，所述扩环酶是来源自Streptomycesclavuligerus的扩环酶的突变体。
4.如权利要求1-3任一项所述的产黄青霉菌株，所述扩环酶为序列1-序列7中任一序列所示核苷酸编码的氨基酸；优选地，所述突变型扩环酶为核苷酸序列为SeqNo.5编码的突变型扩环酶。
5.如权利要求1所述的产黄青霉菌株，其特征在于，产黄青霉菌株的野生株为具有改善的β-内酰胺产量的产黄青霉菌株，优选如X-1612、WisQ-176、WisBL3-D10、Wis48-701、Wis49-133、Wis54-1255、DS04825、AS-P-78，进一步优选中国普通微生物菌种保藏管理中心的CGMCC3.15712。
6.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括启动子，编码扩环酶的基因和终止子；所述启动子选自下列组：Ptef1、PgapA、PtrpC、Pipns，所述启动子的核苷酸序列为SeqNo.8、SeqNo.9、SeqNo.10、SeqNo.11，优选的，所述启动子的核苷酸序列为Seq No.8；所述扩环酶是来源自Streptomyces clavuligerus的扩环酶的突变体，优选地，所述突变型扩环酶为序列1-序列7中任一序列编码的突变型扩环酶，更优选地，所述突变型扩环酶为核苷酸序列SeqNo.5编码的突变型扩环酶。
7.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒包括如权利要求6所述的表达盒；优选所述的重组质粒的骨架质粒为pUC57质粒。
8.一种重组质粒组合，其特征在于，其包括Cas9表达质粒、sgRNA质粒，或者Cas9和sgRNA的融合质粒，以及如权利要求7所述的重组质粒；所述Cas9表达质粒和sgRNA质粒用于将如权利要求6所述的表达盒同源重组至产黄青霉野生株的基因组中。
9.如权利要求1-5任一项所述的产黄青酶菌株或如权利要求6所述的表达盒或如权利要求7所述的重组质粒或如权利要求8所述的重组质粒组合在制备己二酰-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(adipyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，Ad-7-ADCA)或7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，7-ADCA)中的应用。
10.一种合成己二酰-7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(adipyl-7-aminodeacetoxycephalosporanic acid，Ad-7-ADCA)的方法，其特征在于在含有己二酸的培养基中培养权利要求1-5任一项所述的产黄青霉菌株；优选地，所述的制备方法为在1号培养基中培养后，转至小米培养基中培养，继而转至发酵培养基中进行发酵；更优选地，所述1号培养基包括甘油、红糖、酵母粉、氯化钠、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸钙、硫酸铜、琼脂；所述小米培养基包括玉米浆、硝酸钠、氯化钠、磷酸二氢钾、三氯化铁、硫酸镁、硫酸铜；
所述发酵培养基包括玉米浆、硫酸铵、碳酸钙、磷酸二氢钾、硫酸钠、乳糖、酵母粉、己二酸；和/或，所述培养和发酵的温度为21-28℃，例如为25℃；和/或，所述培养在震荡中进行，所述震荡的转速为220-260rpm，例如为250rpm；和/或，所述培养的时长为5-10天，例如为7天；和/或，
所述发酵的时长为4-15天，例如为12天。
11.一种构建如权利要求1-5任一所述产黄青霉菌株的方法，其特征在于通过CRISPR-Cas9系统介导的同源重组方式，将扩环酶整合到产黄青霉野生株的基因组，优选地通过扩环酶基因替换Ku70基因。
12.如权利要求11所述的构建方法，CRISPR-Cas9系统中引导Ku70基因敲除的sgRNA为两条，包括：sgRNA 1：Cccaggaagtcaagcaactg；sgRNA 2：gcagaaaagcatgttggcca。
13.如权利要求11或12所述的构建方法，其中引导同源重组的系统包含左同源臂和右同源臂；扩增左同源臂的左侧引物为：gagagtgcaccatatgATAAAGAAGTATCGGTG；扩增右同源臂的右侧引物为：gattacgccaagcttTATCGGGATTTCATCATTG；左右同源臂长度皆为2.0Kb，扩增模板为产黄青霉基因组DNA。
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