CN105219830B - 一种头孢霉素c的制备方法及其所用的基因工程菌 - Google Patents

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CN105219830B CN201410260748.5A CN201410260748A CN105219830B CN 105219830 B CN105219830 B CN 105219830B CN 201410260748 A CN201410260748 A CN 201410260748A CN 105219830 B CN105219830 B CN 105219830B
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Abstract

本发明公开了一种头孢霉素C的制备方法及其所用的基因工程菌,还公开了该基因工程菌的制备方法。所述孢霉素C的制备方法包括以下步骤:(1)将携带如序列表中SEQ ID NO:1所示的核酸的重组表达载体转染顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum),获得重组表达转化体;(2)发酵培养所得重组表达转化体,从培养物中分离头孢霉素C即得。本发明通过在顶头孢霉CPC高产菌株额外引入AcveA基因,有效提高了CPC合成基因的转录水平,从而通过导入CPC合成调控基因AcveA提高了CPC的产量。

Description

一种头孢霉素C的制备方法及其所用的基因工程菌
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种头孢霉素C的制备方法及其所用的基因工程菌。
背景技术
头孢菌素C(CPC)是生产头孢菌素类抗生素重要中间体7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的主要原料。顶头孢霉是发酵产CPC的一类重要工业微生物。经过多年研究,CPC在顶头孢霉体内的生物合成途径已被阐述得较为清楚,其中涉及的所有合成基因都已克隆得到,且纯化获得了这些基因编码的大部分酶(请参见文献Martin JF.Alpha-aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetases in beta-lactam producing organisms.From Abraham'sdiscoveries to novel concepts of non-ribosomal peptide synthesis[J].JAntibiot(Tokyo),2000,53(10):1008-1021)。研究发现,CPC生物合成途径中的基因为成簇排列,主要分为两部分,一是位于7号染色体上的早期基因簇:包括合成基因pcbAB、pcbC、cefD1以及cefD2;二是位于1号染色体上的晚期基因簇,由同一个双向启动子启动的合成基因cefEF和cefG组成(请参见文献Gutierrez S,Fierro F,Casqueiro J,et al.Geneorganization and plasticity of the beta-lactam genes in different filamentousfungi[J].Antonie Van Leeuwenhoek,1999,75(1-2):81-94.)。这些基因直接影响了顶头孢霉最终发酵产物中CPC的含量。
随着CPC生物合成主要途径的阐明,合成途径中的基因调控及其调控机制受到了许多研究者的关注。近年已发现在CPC生物合成过程中起重要作用的一些调控蛋白,如对CPC合成起正调控作用的CPCR1(请参见文献Schmitt EK,Kuck U.The fungalCPCR1protein,which binds specifically to beta-lactam biosynthesis genes,isrelated to human regulatory factor X transcription factors[J].J Biol Chem,2000,275(13):9348-9357.)、AcFKH1(请参见文献Schmitt EK,Hoff B,Kuck U.AcFKH1,anovel member of the forkhead family,associates with the RFX transcriptionfactor CPCR1in the cephalosporin C-producing fungus Acremonium chrysogenum[J].Gene,2004,342(2):269-281.)和PacC(请参见文献Schmitt EK,Kempken R,KuckU.Functional analysis of promoter sequences of cephalosporin C biosynthesisgenes from Acremonium chrysogenum:specific DNA-protein interactions andcharacterization of the transcription factor PACC[J].Mol Genet Genomics,2001,265(3):508-518.),以及负调控子Cre1(请参见文献Jekosch K,Kuck U.Glucosedependent transcriptional expression of the cre1gene in Acremoniumchrysogenum strains showing different levels of cephalosporin C production[J].Curr Genet,2000,37(6):388-395.)。与构巢曲霉veA基因同源的AcveA是近年来在顶头孢霉中发现的一个全局性调控子,其调控了pcbAB、pcbC、cefD1、cefD2、cefEF以及cefG全部6个主要的CPC生物合成基因的转录水平,敲除该基因会大幅度降低CPC的产量(请参见文献Dreyer J,Eichhorn H,Friedlin E,et al.A homologue of the Aspergillus velvetgene regulates both cephalosporin C biosynthesis and hyphal fragmentation inAcremonium chrysogenum[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(10):3412-3422.)。
发明内容
因此本发明所要解决的技术问题是,针对目前存在的菌株头孢霉素C产量不高的问题,提供了一种新的头孢霉素C的制备方法及其所用的基因工程菌。
为解决上述技术问题,本发明采取的技术方案之一是:一种头孢霉素C的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
(1)将携带如序列表中SEQ ID NO:1所示的核酸的重组表达载体转染顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum),获得重组表达转化体;
(2)发酵培养步骤(1)所得重组表达转化体,从培养物中分离头孢霉素C即得。
本发明所述SEQ ID NO:1所示的核酸序列为AcveA基因。本发明所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法,所述核酸的制备方法较佳地包括:从生物体中提取天然存在的核酸分子,通过基因克隆技术获得该核酸分子,或者通过人工合成序列的方法得到所述核酸分子。
其中步骤(1)所述顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)为本领域常规的顶头孢霉菌,优选地为CPC高产顶头孢霉菌CPCC480085。所述CPC高产顶头孢霉菌CPCC480085的制备方法为本领域常规制备方法,较佳地为多轮诱变筛选所得,或者通过商业购买所得。
其中步骤(1)所述重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明的所述的核酸或其突变体的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括:各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等,本发明所述载体优选地为携带如序列表中SEQ ID NO:1所示的核酸的pYG858质粒。
本发明所述pYG858质粒的制备方法为本领域常规制备方法(该质粒的具体制备方法请参见文献:张丕燕,朱春宝,朱宝泉.顶头孢霉pcb AB-pcbC双向启动子区域的克隆与应用[J].微生物学报,2004,44(2):255-257.)。
其中步骤(2)所述发酵培养包括以下步骤:将步骤(1)所述重组表达转化体接种于种子培养基中,温度25-30℃,种子培养3-5天;将所得培养物转接至发酵培养基中,20-25℃发酵培养5-10天。
本发明所述种子培养基为本领域用于培养顶头孢霉菌的常规种子培养基,所述种子培养基的配方较佳地包括以下组分:玉米浆6%,蔗糖3.5%,葡萄糖0.5%,硫酸铵0.8%,甲硫氨酸0.05%,CaCO30.5%,豆油1%,种子培养基的pH为6.5,所述百分比为质量百分比。
其中所述发酵培养基为本领域用于培养顶头孢霉菌的常规发酵培养基,所述发酵培养基的配方较佳地包括以下组分:玉米浆10%,淀粉3%,糊精6%,葡萄糖0.5%,甲硫氨酸0.6%,尿素0.3%,KH2PO40.9%,七水硫酸镁0.3%,硫酸铵1.3%,CaCO31%,微量元素溶液0.2%,豆油2%,所述微量元素溶液较佳地包含以下组分:FeSO4·7H2O0.8%,MnSO4·H2O0.2%,ZnSO4·7H2O0.2%,CuSO4·5H2O0.2%,pH为1.0,所述百分比为质量百分比。
其中所述发酵培养较佳地为振荡培养,所述种子培养较佳地是在250ml摇瓶中进行,所述振荡培养的速度较佳地为200-300rpm,更佳地为230rpm,所述种子培养的温度更佳地为28℃,培养的时间更佳地为3天。当所述发酵培养在250ml摇瓶中进行时,所述振荡培养的震荡速度较佳地为200-300rpm,更佳地为230rpm,所述发酵培养的温度更佳地为25℃,培养的时间更佳地为7天。
为解决上述技术问题,本发明采取的技术方案之二是:一种基因工程菌,所述基因工程菌是包含携带如序列表中SEQ ID NO:1所示的核酸的重组表达载体的顶头孢霉菌。
本发明所述顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum)为本领域常规的顶头孢霉菌,优选地为CPC高产顶头孢霉菌CPCC480085(本发明所述CPCC是中国药用微生物菌种保藏管理中心China Pharmaceutical Culture Collection的缩写)。所述CPC高产顶头孢霉菌CPCC480085的制备方法为本领域常规制备方法,较佳地为多轮诱变筛选所得,或者通过商业购买所得。
本发明所述重组表达载体可通过本领域常规方法将本发明的所述的核酸或其突变体的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体,所述载体包含真菌筛选标记,以及真菌启动子等真菌表达调控原件。所述载体较佳地包括:各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等,本发明所述载体优选地为携带如序列表中SEQID NO:1所示的核酸的pYG858质粒。
为解决上述技术问题,本发明采取的技术方案之三是:一种如上所述基因工程菌的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:利用携带如序列表中SEQ ID NO:1所示的核酸的重组表达载体转化顶头孢霉菌株。
本发明所述转化的方法为本领域转染顶头孢霉的常规转化方法,较佳地包括化学转化法,热激法或电转法,优选地为PEG-CaCl2介导的原生质体转化法。所述原生质体转化法较佳地包括以下步骤:培养收集顶头孢霉原生质体,原生质体浓度大于108个/ml,加入含10~30%PEG6000的P缓冲液,所述P缓冲液的配方较佳地为KCl4.47%,CaCl20.278%和MgCl20.203%。20℃~25℃放置10min~30min,离心去上清,沉淀用适当体积的P缓冲液溶解后分别加入60℃~70℃预热的7%软琼脂中,立即倒入再生平板,所述再生平板为本领域用于培养顶头孢霉的常规再生平板培养基,所述再生平板的配方较佳地为:胰蛋白胨3.0%,大豆蛋白胨0.8%,NaCl0.8%,蔗糖20.6%,pH7.0,将再生平板放入30℃~26℃培养箱中倒置培养,48~72h后上层加入博莱霉素,博来霉素的浓度较佳地为1.5μg/μl~3.5μg/μl,26℃~30℃倒置培养5~8天挑取博来霉素抗性转化子斜面培养,所述斜面培养基为本领域培养顶头孢霉的常规斜面培养基,所述斜面培养基的配方较佳地为:麦芽汁20%,麦芽糖4%,聚胨1%,pH7.0,所述百分比为质量百分比。其中所述顶头孢霉菌(Acremoniumchrysogenum)为本领域常规的顶头孢霉菌,优选地为CPC高产顶头孢霉菌CPCC480085(本发明所述CPCC是中国药用微生物菌种保藏管理中心China Pharmaceutical CultureCollection的缩写)。
为解决上述技术问题,本发明采取的技术方案之四是:如上所述基因工程菌在制备头孢霉素C中的用途。
其中所述的用途为本领域常规用途,较佳地为利用本发明所述基因工程菌发酵生产头孢霉素C。所述发酵生产头孢霉素C的方法为本领域常规的发酵生产方法。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:本发明通过在顶头孢霉CPC高产菌株体内导入CPC合成调控基因AcveA实现了CPC产量的提高,同时额外引入的AcveA对CPC合成基因的转录水平实现了提高。根据CPC合成调控因子和转运调控因子的研究成果,可以将AcveA基因与CPC合成基因组合后引入顶头孢霉CPC高产菌株来实现CPC产量的进一步提高。
附图说明
图1为AcveA PCR电泳图。其中泳道1为λ/HindIII,泳道2为DL2000Marker,泳道3为以H2O为模板,泳道4为以A.chrysogenum基因组DNA为模板。
图2为AcveA表达载体pYG280的构建策略图。
图3为pYG280的酶切验证电泳图。其中泳道1为DL2000Marker,泳道2为λ/HindIII,泳道3为EcoRI+XbaI双切示意图。
图4为pYG280顶头孢霉转化子的PCR验证结果图。其中泳道1为Phleo:以转染了pYG273质粒的顶头孢霉转化子基因组为模板,泳道2为Phleo:plasmid pYG273为模板,泳道3为Phleo:以顶头孢霉出发菌的基因组为模板;泳道4为Phleo:以H2O为模板,泳道5为DL2000Marker。
图5为转化子和出发菌CPCC480085中AcveA,pcbC,cefEF以及cefG的相对转录水平。
图6为转化子与出发菌CPCC480085发酵产物CPC与DAC HPLC检测结果。其中图6(A)为CPC HPLC检测结果。图6(B)为DAC HPLC检测结果。
图7为转化子280-62与出发菌CPCC420662发酵产物的CPC产量的检测结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例1
1菌种与试剂
1.1菌种
大肠杆菌E.coli DH5α,质粒pYG858(质粒pYG858的构建方法请参考文献:张丕燕,朱春宝,朱宝泉.顶头孢霉pcb AB-pcbC双向启动子区域的克隆与应用[J].微生物学报,2004,44(2):255-257.)。顶头孢霉(Acremonium chrysogenum)CPCC480085(中国药用微生物菌种保藏管理中心China Pharmaceutical Culture Collection,CPCC),该菌株购买自中国微生物资源网(北京普天同创生物科技有限公司),资源平台号:1511C0004000004213。CPC标准品购买自国药威奇达药业有限公司。
1.2试剂
限制性内切酶、T4DNA连接酶、LA Taq酶,cDNA逆转录试剂盒和Real-time PCR试剂盒购自大连Takara公司,高纯度质粒抽提试剂盒购自德国MN公司,Lysing Enzyme和博莱霉素均购买自SIGMA公司。RNA抽提试剂盒购自上海生工生物技术有限公司,其它常用试剂购自国药试剂,为分析纯实际。
2方法
2.1顶头孢霉基因组提取、AcveA基因的合成以及AcveA基因顶头孢霉表达载体pYG280的构建
液氮抽提法提取顶头孢霉工业菌株(顶头孢霉CPCC48008)基因组DNA,以其为模板PCR合成AcveA基因,所用引物序列为P1和P2,所述引物及其序列登录号请参见表1。PCR反应体系为:10×LA Taq Buffer2μL;dNTP Mix1.6μL;引物P1和P2各1μL(引物终浓度0.5μM);基因组DNA模板1μL;LA Taq聚合酶0.5μL,用ddH2O补至20μL。PCR扩增条件为:(1)94℃预变性30sec;(2)94℃1min,(3)55℃1min,(4)72℃1min,步骤(2)-(4)重复30个循环。
将在甘油冷冻管中保存的质粒pYG858的DH5α宿主菌菌液接种于含有100μg/mlAmp的LB液体培养基(蛋白胨10g/L,酵母提取物5g/L,氯化钠10g/L,pH7.0)试管中,37℃振荡培养过夜。吸取2ml菌液于Eppendorf离心管,离心(Eppendorf5415R小型冷冻高速离心机,12,000×1min),弃上清,真空吸干残余液体,将沉淀重悬于100μl Solution I(葡萄糖50mmol/L,EDTA10mmol/L,Tris-HCl25mmol/L,pH8.0),于漩涡混和器上振荡使菌体分散,冰浴10min。加入200μl Solution II(NaOH0.2mol/L,SDS1%,现用现配),盖紧盖子后,颠倒管子数次,冰浴3~5min。加入150μlSolution III(5mol/L KAc60mL,冰乙酸11.5mL,水28.5mL),剧烈摇动管子,冰浴3~5min。离心12,000×10min,将上清移至另一离心管,加入400μl异丙醇,室温放置10min。离心12,000×10min,弃上清,沉淀用70%冰冷乙醇洗涤后置于真空干燥器中干燥。最后加入20μl含RNase(50μg/mL)的TE溶解沉淀,质粒溶液在4℃或-20℃保存,备用。
PCR扩增产物经纯化回收试剂盒(Nucleic Acid Purification Kit,购买自Axygen)纯化后,EcoRI和XbaI双酶切,经琼脂糖凝胶电泳回收后与经相同步骤处理的pYG858用T4连接酶16℃连接3h,连接液加入E.coli.DH5α感受态细胞,冰浴30min后42℃热激90sec,37℃,130rpm孵育45min后离心5,000×5min,除去部分上清后涂布于LB(含100μg/ml的Amp)平板,培养15h,挑取阳性转化子接种于含有100μg/ml Amp的LB液体培养基,37℃振荡培养过夜,提取质粒。质粒经EcoRI和XbaI双酶切,琼脂糖凝胶电泳验证正确后送至上海生工生物工程有限公司测序。
2.2顶头孢霉CPC高产菌株CPCC480085菌丝体的培养和原生质体制备
培养方法:从斜面上刮下适量孢子接种于玉米浆培养基(玉米浆3%,葡萄糖1%,淀粉3%,CaCO30.5%,pH6.8)的摇瓶中,28℃、230r/min培养96h,再以10%的接种量转接于YPS培养基(葡萄糖2%,聚胨1%,酵母提取物0.5%,K2HPO4·3H2O0.13%,MgSO4·7H2O0.1%,pH7.0)中,相同条件培养12-16h后,室温离心(himac CR21G,HITACHI,Japan)10000rpm,5min收获菌体。生理盐水洗涤后的菌丝体用5mmol/L的DTT预处理30min,Pbuffer(KCl4.47%,MgCl2·6H2O0.203%,CaCl20.278%)洗涤后用8mg/ml Lysing酶酶解2.5h,收集原生质体悬浮于P buffer中使其浓度大于108个/ml。
2.3顶头孢霉原生质体转化、转化子的鉴定以及相关基因的转录水平检测
采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法将构建的质粒转化顶头孢霉,实验步骤如下所示:取7μl浓度为2μg/μl高纯度的质粒pYG280加入100μl浓度大于108个/ml的原生质体中,冰浴20min,加入含30%PEG6000的Pbuffer(P缓冲液配方为:KCl4.47%,CaCl20.278%,MgCl20.203%)25℃放置15min。5000rpm离心5min后去上清,沉淀用P buffer洗涤一次,5000rpm离心5min后去上清,沉淀用适当体积的P buffer溶解后分别加入65℃预热的7%软琼脂中,立即倒入再生平板(胰蛋白胨3.0%,大豆蛋白胨0.8%,NaCl0.8%,蔗糖20.6%,pH7.0)上层,待上层凝固后将平板放入28℃培养箱中倒置培养,48h后上层加入博莱霉素抗生素,使其终浓度为2μg/μl。28℃倒置培养7天后挑取博来霉素抗性转化子斜面培养(麦芽汁20%v/v,麦芽糖4%,聚胨1%,pH7.0)7天后以液氮抽提法(实验方法请参见周晓玲,沈微,饶志明.一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J].微生物学通报,2004,31(4):89-92.)提取基因组DNA进行PCR验证。PCR验证正确的转化子发酵培养5d后提取RNA,根据试剂盒的说明分别进行逆转录和Real-time PCR。构建质粒、PCR验证以及Real-time PCR所用的引物见表1(所用引物编号为P1-P14,引物序列如序列表中SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:15所示),引物中下划线为引入的酶切位点。
表1 引物列表
Figure BDA0000519901930000091
Figure BDA0000519901930000101
2.4顶头孢霉的发酵和发酵产物的HPLC检测
从培养10天的斜面上刮下适量孢子,接种于装量为20ml种子培养基(玉米浆6%,蔗糖3.5%,葡萄糖0.5%,硫酸铵0.8%,甲硫氨酸0.05%,CaCO30.5%,豆油1%v/v,pH6.5)的250ml摇瓶中,于旋转式摇床培养3d,转速230r/min,温度28℃。再以10%(v/v)接种量转接至装量为20ml发酵培养基(玉米浆10%,淀粉3%,糊精6%,葡萄糖0.5%,甲硫氨酸0.6%,尿素0.3%,KH2PO40.9%,七水硫酸镁0.3%,硫酸铵1.3%,CaCO31%,微量元素溶液0.2%v/v,豆油2%v/v)的250ml摇瓶中,25℃,230r/min,培养7天。微量元素溶液的配方为FeSO4·7H2O0.8%,MnSO4·H2O0.2%,ZnSO4·7H2O0.2%,CuSO4·5H2O0.2%,pH1.0。发酵液经普通滤纸过滤,收集滤液纯水稀释50倍进行HPLC分析。采用C18(5μm,4.6×150mm)柱(Waters公司),流动相为甲醇:0.2%磷酸二氢钠(5:95),检测波长254nm,流速1ml/min,柱温40℃,进样量20μl,分析时间10min。
3结果
3.1AcveA基因顶头孢霉表达载体pYG280的构建
根据GenBank公布的AcveA基因序列(登录号AM410093)设计并合成PCR引物5’-AcveA和3’-AcveA(P1和P2)(请见表1)。以顶头孢霉CPC高产菌基因组DNA为模板PCR合成AcveA基因。所得PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后在1.6k处有单一条带,而阴性对照则无条带,结果如图1所示,其中泳道1为λ/HindIII,泳道2为DL2000Marker,泳道3为以H2O为模板,泳道4为以A.chrysogenum基因组DNA为模板。
将AcveA基因的PCR产物用EcoRI和XbaI双酶切,经琼脂糖凝胶电泳回收后与经相同步骤处理的pYG858相连,构建质粒pYG280,AcveA基因表达载体pYG280的克隆策略见图2。构建的质粒pYG280经酶切验证后正确,酶切验证结果见图3,其中泳道1为DL2000Marker,泳道2为λ/HindIII,泳道3为EcoRI+XbaI双切结果。将构建正确的pYG280质粒送至上海生工生物工程有限公司测序,测序结果与GenBank的公布的基因组AcveA基因序列完全一致。
3.2质粒pYG280对顶头孢霉CPC高产菌株CPCC480085的转化及转化子的验证
取7μl浓度为2μg/μl高纯度的质粒pYG280转化入100μl顶头孢霉CPC高产菌株CPCC480085新鲜制备的原生质体中(浓度大于108个/ml)。根据质粒pYG280上的真核筛选标记腐草霉素抗性基因(phleor),使用博来霉素(浓度2μg/μl)来筛选平板上的转化子。挑选博来霉素抗性平板上生长良好的菌落,斜面培养后使用液氮抽提法(实验方法请参考:周晓玲,沈微,饶志明.一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J].微生物学通报,2004,31(4):89-92.)提取抗性转化子基因组DNA,以此为模板,根据pYG280上的phleo序列设计引物(表1),通过PCR验证,PCR扩增条件为:(1)94℃预变性30sec;(2)94℃1min,(3)65℃30sec,(4)72℃1min,步骤(2)-(4)重复30个循环。
PCR产物的电泳图谱如图4所示,其中泳道1为Phleo:以转染了pYG273质粒的顶头孢霉转化子基因组为模板,泳道2为Phleo:plasmid pYG273为模板,泳道3为Phleo:以顶头孢霉出发菌的基因组为模板;泳道4为Phleo:以H2O为模板,泳道5为DL2000Marker。结果显示阳性对照质粒pYG280和转化子均能扩增出375bp的片段,而出发菌CPCC480085则无法扩增出此片段。表明构建的AcveA基因表达载体pYG280已经插入到顶头孢霉CPC高产菌的基因组中,AcveA基因在重组菌的基因组中也获得了额外的拷贝。
3.3转化子中AcveA,pcbC,cefEF以及cefG转录水平的检测
将验证正确的转化子与出发菌CPCC480085同时发酵培养,每个转化子接种两个种子瓶,种子培养三天后每瓶种子转接两个发酵瓶,根据RNA抽提试剂盒(RNA抽提试剂盒购买自上海生工生物工程有限公司)的说明提取发酵5d的总RNA。同时HPLC分析转化子发酵6d后的CPC产量和DAC产量,结果表明获得的转化子的CPC产量比出发菌CPCC480085有所提高。
所得转化子和出发菌CPCC480085的RNA进行Real-time-PCR分析,除了检测导入的AcveA基因的转录水平外,还选取了CPC合成途径限速步骤参与的催化酶所对应的基因转录水平进行了分析。检测了CPC合成的早期基因pcbC,晚期基因cefEF以及cefG这3个基因的mRNA转录水平。使用真核生物通用引物Oligo-p(dT)18Primer逆转录合成基因组cDNA第一链。以顶头孢霉actin基因(GenBank登录号:AF056976)的150bp左右片段作为内参基因,通过Real-time-PCR检测转化子与出发菌CPCC480085发酵4个基因的mRNA转录水平。Actin、AcveA、pcbC、cefEF以及cefG上下游的Real-time-PCR引物见表1(所述引物序列分别如表1中P5-P12所示)。以出发菌CPCC480085的基因转录水平为1,转化子中以上4个基因的mRNA相对转录水平的检测结果见表2和图5所示。结果显示发酵5天后转化子中AcveA基因的转录水平较出发菌提高了165%,说明转化子中整合至基因组获得的额外拷贝的AcveA基因提高了其转录水平。pcbC、cefEF以及cefG的mRNA相对转录水平分别比出发菌提高了825%,353%和25%。说明通过额外转入AcveA基因,这些CPC生物合成基因的转录水平也得到了提高,证明AcveA基因的转录与头孢菌素C生物合成基因转录间的正相关关系。
表2 转化子与出发菌中各个基因相对转录水平的Realtime PCR检测结果
Figure BDA0000519901930000131
3.4转化子发酵产物的分析
将3.3所得转化子以及出发菌CPCC480085发酵3天,4天,5天和6天后的发酵产物进行HPLC分析(4个平行瓶),比较CPC和DAC产量,结果显示转化子的CPC产量比出发菌CPCC480085有所提高,发酵终点(发酵第6天)CPC产量提高了22.7%,DAC提高了12%。CPC和DAC产量的HPLC检测结果见图6,其中图6(A)为CPC HPLC检测结果。图6(B)为DAC HPLC检测结果。其中所述DAC为乙酰基头孢菌素C。
顶头孢霉发酵产物的HPLC检测结果发现最终CPC产量较出发菌提高22.7%,这与上述CPC合成基因转录水平的提高对应。除了CPC的产量,我们还对CPC生物合成途径的另一头孢产物乙酰基头孢菌素C(DAC)的发酵产量进行了分析,发现在发酵第6d,DAC的产量提高了12%。这一结果与Real-time PCR的结果对应,说明转入AcveA基因后增强了其表达产物ACVEA对CPC合成基因的转录调控,从而增加了下游DAC和CPC的产量。
在对所得转化子的Real-time PCR检测中发现,与对照菌相比,AcveA基因的转录水平提高了165%。CPC合成主要限速步骤中的相关基因pcbC、cefEF以及cefG的mRNA相对转录水平在发酵第6d分别比出发菌提高了825%,353%和25%。在高产菌中过表达AcveA基因对CPC早期合成基因的影响(pcbC)要大于晚期合成基因(cefEF、cefG)并且这种调控呈递减的趋势。而且本实验的结果显示受AcveA基因调控影响最大的基因是pcbC,这可能与本实验所用的出发菌是经过多轮诱变筛选的CPC高产菌有关。表明导入AcveA基因后CPC合成途径中的头孢产物的产量都有了提高,这一结果也与上述3个基因的转录水平提高相对应。
本发明通过在顶头孢霉CPC高产菌株体内导入CPC合成调控基因AcveA实现了CPC产量的提高,同时额外引入的AcveA基因对CPC合成基因的转录水平实现了一定的调控。根据CPC合成调控因子和转运调控因子的研究成果,今后的研究中可以将这些基因与CPC合成基因组合后引入顶头孢霉CPC高产菌株来实现CPC产量的进一步提高。
实施例2顶头孢霉原生质体的转化以及发酵培养
采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法将构建的质粒转化顶头孢霉,具体步骤如下:取7μl浓度为2μg/μl高纯度的质粒pYG280加入100μl浓度大于108个/ml的原生质体中,冰浴20min,加入含10%PEG6000的P缓冲液(P缓冲液配方为:KCl4.47%,CaCl20.278%,MgCl20.203%)20℃放置10min。5000rpm离心5min后去上清,沉淀用P缓冲液洗涤一次,5000rpm离心5min后去上清,沉淀用适当体积的P缓冲液溶解后分别加入60℃预热的7%软琼脂中,立即倒入再生平板(胰蛋白胨3.0%,大豆蛋白胨0.8%,NaCl0.8%,蔗糖20.6%,pH7.0)上层,待上层凝固后将平板放入25℃培养箱中倒置培养,48h后上层加入博莱霉素抗生素,使其终浓度为2μg/μl。26℃倒置培养5天后挑取博来霉素抗性转化子斜面培养(斜面培养基配方为:麦芽汁20%v/v,麦芽糖4%,聚胨1%,pH7.0),培养7天后以液氮抽提法(实验方法请参见周晓玲,沈微,饶志明.一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J].微生物学通报,2004,31(4):89-92.)提取基因组DNA进行PCR验证。PCR验证正确的转化子发酵培养5天后提取RNA,根据试剂盒的说明分别进行逆转录和Real-time PCR。构建质粒、PCR验证以及Real-time PCR所用的引物见表1(所用引物编号为P1-P14,引物序列如序列表中SEQ IDNO:2-SEQ ID NO:15所示),引物中下划线为引入的酶切位点。
将鉴定所得正确的顶头孢霉转化子在斜面培养基上培养十天后,从斜面培养基上刮下适量孢子,接种于装量为20ml种子培养基(玉米浆6%,蔗糖3.5%,葡萄糖0.5%,硫酸铵0.8%,甲硫氨酸0.05%,CaCO30.5%,豆油1%v/v,pH6.5)的250ml摇瓶中,于旋转式摇床培养5天,转速230r/min,温度25℃。再以10%(v/v)接种量转接至装量为20ml发酵培养基(玉米浆10%,淀粉3%,糊精6%,葡萄糖0.5%,甲硫氨酸0.6%,尿素0.3%,KH2PO40.9%,七水硫酸镁0.3%,硫酸铵1.3%,CaCO31%,微量元素溶液0.2%v/v,豆油2%v/v)的250ml摇瓶中,25℃,230r/min,培养10天。微量元素溶液的配方为FeSO4·7H2O0.8%,MnSO4·H2O0.2%,ZnSO4·7H2O0.2%,CuSO4·5H2O0.2%,pH1.0。发酵液经普通滤纸过滤,收集滤液纯水稀释50倍进行HPLC分析。采用C18(5μm,4.6×150mm)柱(Waters公司),流动相为甲醇:0.2%磷酸二氢钠(5:95),检测波长254nm,流速1ml/min,柱温40℃,进样量20μl,分析时间10min。
实施例3发酵培养顶头孢霉菌
采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法将构建的质粒转化顶头孢霉,具体步骤如下:取7μl浓度为2μg/μl高纯度的质粒pYG280加入100μl浓度大于108个/ml的原生质体中,冰浴20min,加入含30%PEG6000的P缓冲液(P缓冲液配方为:KCl4.47%,CaCl20.278%,MgCl20.203%)25℃放置30min。5000rpm离心5min后去上清,沉淀用P缓冲液洗涤一次,5000rpm离心5min后去上清,沉淀用适当体积的P缓冲液溶解后分别加入70℃预热的7%软琼脂中,立即倒入再生平板(胰蛋白胨3.0%,大豆蛋白胨0.8%,NaCl0.8%,蔗糖20.6%,pH7.0)上层,待上层凝固后将平板放入30℃培养箱中倒置培养,72h后上层加入博莱霉素抗生素,使其终浓度为2μg/μl,30℃倒置培养8天后挑取博来霉素抗性转化子斜面培养(斜面培养基配方为:麦芽汁20%v/v,麦芽糖4%,聚胨1%,pH7.0),培养10天后以液氮抽提法(实验方法请参见周晓玲,沈微,饶志明.一种快速提取真菌染色体DNA的方法[J].微生物学通报,2004,31(4):89-92.)提取基因组DNA进行PCR验证。PCR验证正确的转化子发酵培养5天后提取RNA,根据试剂盒的说明分别进行逆转录和Real-time PCR。构建质粒、PCR验证以及Real-time PCR所用的引物见表1(所用引物编号为P1-P14,引物序列如序列表中SEQ IDNO:2-SEQ ID NO:15所示),引物中下划线为引入的酶切位点。
将鉴定所得正确的顶头孢霉转化子在斜面培养基上培养10天后,从斜面培养基上刮下适量孢子,接种于装量为20ml种子培养基(玉米浆6%,蔗糖3.5%,葡萄糖0.5%,硫酸铵0.8%,甲硫氨酸0.05%,CaCO30.5%,豆油1%v/v,pH6.5)的250ml摇瓶中,于旋转式摇床培养3天,转速230r/min,温度30℃。再以10%(v/v)接种量转接至装量为20ml发酵培养基(玉米浆10%,淀粉3%,糊精6%,葡萄糖0.5%,甲硫氨酸0.6%,尿素0.3%,KH2PO40.9%,七水硫酸镁0.3%,硫酸铵1.3%,CaCO31%,微量元素溶液0.2%v/v,豆油2%v/v)的250ml摇瓶中,20℃,230r/min,培养5天。微量元素溶液的配方为FeSO4·7H2O0.8%,MnSO4·H2O0.2%,ZnSO4·7H2O0.2%,CuSO4·5H2O0.2%,pH1.0。发酵液经普通滤纸过滤,收集滤液纯水稀释50倍进行HPLC分析。采用C18(5μm,4.6×150mm)柱(Waters公司),流动相为甲醇:0.2%磷酸二氢钠(5:95),检测波长254nm,流速1ml/min,柱温40℃,进样量20μl,分析时间10min。
实施例4利用其他顶头孢霉转化子制备CPC
取实施例1构建的AcveA基因顶头孢霉表达载体pYG280,按照实施例1所述方法转化顶头孢霉CPCC420662(该菌株购买自中国微生物资源网,北京普天同创生物科技有限公司,该菌株的资源平台号:1511C0004000002896),获得了转化子(所得转化子编号为280-62)。根据实施例1所述的培养条件和培养基进行发酵培养,发酵6天后根据实施例1所述方法检测CPC产量。检测结果表明,所得转化子280-62的CPC产量比其出发菌CPCC420662提高了8%,CPC产量检测结果如图7所示。该结果表明,利用本发明所述AcveA基因顶头孢霉表达载体pYG280,结合本发明述头孢霉素C的制备方法,利用不同的顶头孢霉制备所得顶头孢霉转化子的CPC产量均得到了提高。
对比实施例1
敲除cefP基因后对敲除菌进行回补cefP基因(具体实验步骤请参见文献:UllanRV,Teijeira F,Guerra SM,et al.Characterization of a novel peroxisome membraneprotein essential for conversion of isopenicillin N into cephalosporin C[J].Biochem J,2010,432(2):227-236.)。所用菌株是:顶头孢霉C10(ATCC48272)。实验步骤为:构建载体转化C10菌株,对cefP基因进行插入失活,突变菌株CPC发酵水平较出发菌C10产量明显下降。然后将含有cefP表达元件的载体转化此cefP基因插入失活的突变菌株,对cefP进行回补实验,结果发现由于插入失活导致的CPC的产量降低并没有得到恢复。
虽然敲除cefP基因后导致CPC产量下降,但是将所得基因敲除菌进行回补后,所得回补菌株的CPC的产量没有回复到敲除前出发菌的水平,因此上述实验结果表明,过表达某个基因不一定会得到与敲除该基因相反的实验结果。
对比实施例2
敲除AcveA基因后对敲除菌进行回补AcveA基因(具体实验步骤请参见文献:Dreyer J,Eichhorn H,Friedlin E,et al.A homologue of the Aspergillus velvetgene regulates both cephalosporin C biosynthesis and hyphal fragmentation inAcremonium chrysogenum[J].Appl Environ Microbiol,2007,73(10):3412-3422.)。所用菌株是:顶头孢霉A3/2(DSM2353)。实验步骤为:用双交换法,构建敲除质粒转化顶头孢霉A3/2,将AcveA基因敲除,获得的敲除菌株的CPC发酵产量只有出发菌A3/2的20%,然后在此敲除菌体内导入AcveA基因表达质粒,对获得的转化子进行CPC发酵产量的分析,发现CPC产量较敲除株有所提高,但是没有回复到出发菌的CPC水平。
在AcveA基因敲除的突变菌株和AcveA基因位点插入突变的菌株中均进行了平回补实验,然而所得到的菌株的CPC的含量并没有完全回复到出发菌的CPC产量,由此可以推测,上述实验结果表明,过表达某个基因不一定会得到与敲除该基因相反的实验结果。
应理解,在阅读了本发明的上述内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
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Claims (10)

1.一种头孢霉素C的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
(1)将携带如序列表中SEQ ID NO:1所示的核酸的重组表达载体转染顶头孢霉菌(Acremonium chrysogenum),获得重组表达转化体;
(2)发酵培养步骤(1)所得重组表达转化体,从培养物中分离头孢霉素C即得。
2.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述顶头孢霉菌为顶头孢霉菌CPCC480085。
3.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)所述重组表达载体为携带如序列表中SEQ ID NO:1所示的核酸的pYG858质粒。
4.如权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述发酵培养包括以下步骤:将该重组表达转化体接种于种子培养基中,温度25~30℃,种子培养3~5天;将所得培养物转接至发酵培养基中,20~25℃,发酵培养5~10天。
5.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述种子培养基为:玉米浆6%,蔗糖3.5%,葡萄糖0.5%,硫酸铵0.8%,甲硫氨酸0.05%,CaCO30.5%,豆油1%,种子培养基的pH为6.5,所述百分比为质量百分比。
6.如权利要求4所述的制备方法,其特征在于,所述发酵培养基为:玉米浆10%,淀粉3%,糊精6%,葡萄糖0.5%,甲硫氨酸0.6%,尿素0.3%,KH2PO40.9%,七水硫酸镁0.3%,硫酸铵1.3%,CaCO31%,微量元素溶液0.2%,豆油2%,所述微量元素溶液为:FeSO4·7H2O0.8%,MnSO4·H2O0.2%,ZnSO4·7H2O0.2%,CuSO4·5H2O0.2%,pH为1.0,所述百分比为质量百分比。
7.一种基因工程菌,其特征在于,所述基因工程菌是包含携带如序列表中SEQ ID NO:1所示的核酸的重组表达载体的顶头孢霉菌。
8.一种如权利要求7所述基因工程菌的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:利用携带如序列表中SEQ ID NO:1所示的核酸的重组表达载体转化顶头孢霉菌株。
9.如权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述转化的方法为PEG-CaCl2介导的原生质体转化法,该原生质体转化法包括以下步骤:培养收集顶头孢霉原生质体,原生质体浓度大于108个/ml,加入含10~30%PEG6000的P缓冲液,所述P缓冲液为:KCl4.47%,CaCl20.278%和MgCl20.203%,20℃~25℃放置10~30分钟,离心去上清,沉淀用适当体积的P缓冲液溶解后分别加入60℃~70℃预热的7%软琼脂中,立即倒入再生平板,所述再生平板为:胰蛋白胨3.0%,大豆蛋白胨0.8%,NaCl0.8%,蔗糖20.6%,pH7.0,将再生平板放入25℃~30℃培养箱中倒置培养,48~72小时后上层加入博莱霉素,博来霉素的浓度为1.5μg/μl~3.5μg/μl,26℃~30℃倒置培养5~8天后挑取博来霉素抗性转化子斜面培养7~10天即得,所述百分比均为质量百分比。
10.如权利要求7所述基因工程菌在制备头孢霉素C中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001066767A2 (en) * 2000-03-09 2001-09-13 Bristol-Myers Squibb Company Direct production of desacetylcephalosporin c
CN102174420A (zh) * 2011-01-28 2011-09-07 中国科学院微生物研究所 生产高纯度头孢菌素c的基因工程菌及其应用
CN102719473A (zh) * 2012-06-28 2012-10-10 中国科学院微生物研究所 一种顶头孢霉工程菌及其构建方法
CN103374563A (zh) * 2012-04-13 2013-10-30 上海医药工业研究院 一种改良7-aca产生菌的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001066767A2 (en) * 2000-03-09 2001-09-13 Bristol-Myers Squibb Company Direct production of desacetylcephalosporin c
CN102174420A (zh) * 2011-01-28 2011-09-07 中国科学院微生物研究所 生产高纯度头孢菌素c的基因工程菌及其应用
CN103374563A (zh) * 2012-04-13 2013-10-30 上海医药工业研究院 一种改良7-aca产生菌的方法
CN102719473A (zh) * 2012-06-28 2012-10-10 中国科学院微生物研究所 一种顶头孢霉工程菌及其构建方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Homologue of the Aspergillus velvet Gene Regulates both Cephalosporin C Biosynthesis and Hyphal Fragmentation in Acremonium chrysogenum;Jacqueline Dreyer等;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;20070330;第37卷(第10期);第3412-3422页 *
顶头孢霉中过表达AcveA 提高头孢菌素C 产量;龚桂花等;《中国医药工业杂志》;20140810;第45卷(第8期);第719-723页 *

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