CN113106028A

CN113106028A - 高产头孢菌素c的基因工程菌构建方法及其应用

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Publication number: CN113106028A
Application number: CN202110513227.6A
Authority: CN
Inventors: 梁恒宇; 韩超; 熊琼超; 李雪亮; 王世超; 周鹏
Original assignee: Henan Jiankangyuan Biomedical Research Institute Co ltd
Current assignee: Henan Jiankangyuan Biomedical Research Institute Co ltd
Priority date: 2021-05-11
Filing date: 2021-05-11
Publication date: 2021-07-13
Anticipated expiration: 2041-05-11
Also published as: CN113106028B

Abstract

本发明公开了一种高产头孢菌素C的基因工程菌构建方法及其应用，涉及头孢菌素C的制备技术领域，本发明通过对产黄枝顶头孢霉内源性脂肪酶基因进行过量表达，提高CPC发酵过程中的脂肪酶活力，促进豆油中的甘油三酯水解为脂肪酸等分子，从而提高CPC发酵产量，本发明公开的产黄枝顶头孢霉脂肪酶基因AclipA能够有效地调节产黄枝顶头孢霉菌的头孢菌素C的合成速率和产量。利用本发明的产黄枝顶头孢霉脂肪酶基因AclipA及其编码的蛋白质能够有效提高产黄枝顶头孢霉菌对发酵原料豆油的利用效率，促进头孢菌素C的合成速率和产量，具有很好的工业应用前景。

Description

高产头孢菌素C的基因工程菌构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程菌技术领域，特别是一种高产头孢菌素C的基因工程菌构建方法及其应用。

背景技术

头孢菌素 C（Cephalosporin C，英文缩写CPC）是自然界中发现的第二种β-内酰胺类抗生素，也是生产头孢类抗生素重要中间体7-氨基头孢烷酸（7-ACA）的主要原料。CPC能够抑制细菌细胞壁合成，但其抗菌活性较低。同时因其对人体安全无毒而获得了广泛关注和研究。目前，工业上主要利用产黄枝顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）发酵生产CPC。经过多年研究，CPC 在产黄枝顶头孢霉中的生物合成途径已经研究清楚，且产黄枝顶头孢霉的遗传操作系统已经相对成熟，这为利用基因工程手段改造这一重要的工业真菌奠定了良好基础。

目前，工业上生产CPC主流工艺是采用葡萄糖和豆油等植物油作为产黄枝顶头孢霉的复合碳源。CPC发酵初期，葡萄糖等快速利用碳源为菌体自身生长提供必要营养物质；由于受到葡萄糖效应的限制，发酵后期当菌体生长到一定程度后，往往通过流加豆油等植物油作为迟效碳源，为菌体合成次级代谢产物继续提供碳骨架。两种碳源结合使用同时带来了问题，但随着大宗作物原料价格的提高，豆油作为CPC主要发酵原料的成本越来越高，而实际生产时发现豆油利用不完全，浪费严重。此外，由于发酵菌种对豆油利用度不高而造成后续发酵残液COD值含量高，增加企业后期对发酵残液进行环保处理的压力。

植物油的主要成分是甘油三脂，而甘油三酯一般不能作为微生物的直接碳源。植物油经外源添加脂肪酶分解后产生脂肪酸、甘油、甘油单酯和甘油二酯等。豆油中甘油三酯的主要成分是亚油酸和油酸这两种不饱和脂肪酸（含量能占到总脂肪酸的70%~80%）以及甘油。已有研究表明，以油酸或亚油酸作为碳源部分或完全替代豆油不仅能够促进产黄枝顶头孢霉生长，而且促进CPC合成代谢并进一步高产。然而，油酸和亚油酸作为功能性脂肪酸的价格过高是阻碍不饱和脂肪酸替代豆油工艺工业化的根本原因。因而，有人通过向豆油中添加脂肪酶（Lipase）将甘油三酯水解为脂肪酸的方式进行CPC发酵，并起到促进CPC进一步高产的效果。然而，这种方式同样缺点明显。首先是外源脂肪酶的添加进一步增加CPC生产的成本；其次是需要在CPC生产工艺中增加豆油酶解工艺和酶解罐等设备，且酶解工艺不易控制。

近年来对CPC发酵过程中豆油的作用和代谢机制也发现，发酵液中脂肪酶活性的高低是影响CPC产量的关键。发酵液中的豆油首先被产黄枝顶头孢霉自身分泌的胞外脂肪酶酶解，产生脂肪酸混合液和甘油。脂肪酸进入细胞内部后，经过β-氧化产生乙酰辅酶 A后进入三羧酸循环，并可产生多种氨基酸用于菌体生长和CPC等次级代谢产物的合成，其中包括合成CPC的3种氨基酸前体（L-α-氨基己二酸、L-半胱氨酸和L-缬氨酸）；甘油则主要进入糖酵解途径转化为丙酮酸，最终代谢产生相应的氨基酸或进入三羧酸循环。这可能是添加了酶解豆油后，菌丝体内的脂肪滴数量增多并加快了菌体的分化。在此前的研究中发现，野生型产黄枝顶头孢霉菌体合成的脂肪酶有限，发酵结束后发酵液中有大量油脂残留。由此可见，豆油酶解效率直接影响CPC合成速率。因此，我们从提高豆油酶解效率的角度出发，优化了豆油的酶解方案，希望通过提高产黄枝顶孢自身豆油酶解能力从而提高CPC的合成效率和产量。

发明内容

为了克服上述不足，本发明提出对产黄枝顶头孢霉内源性脂肪酶基因进行过量表达，提高CPC发酵过程中的脂肪酶活力，促进豆油中的甘油三酯水解为脂肪酸等分子，从而提高CPC发酵产量。

为达到上述目的，本发明首先提出一种高产头孢菌素C的基因工程菌。

上述基因工程菌是通过对产黄枝顶头孢霉的内源性脂肪酶AclipA基因进行过量表达获得，所述脂肪酶AclipA的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID:No1 所示；

上述基因工程菌中，所述脂肪酶AclipA的氨基酸序列如SEQ ID:No2 所示；

本发明提供一种分离的核酸，所述核酸为由序列表中 SEQ ID:No1所示核苷酸序列组成的核酸或序列表中SEQ ID:No2 所示氨基酸序列组成的蛋白质；发明所述核酸的制备方法为本领域常规制备方法，所述制备方法较佳地包括：从自然界中提取天然存在的编码产黄枝顶头孢霉脂肪酶的DNA核酸，通过基因克隆技术获得编码产黄枝顶头孢霉脂肪酶AclipA的DNA核酸，或者通过人工全序列合成的方法得到编码产黄枝顶头孢霉脂肪酶AclipA的核酸。脂肪酶AclipA的基因全长序列如序列表中 SEQ ID:No1 所示。如本领域技术人员所知：编码 SEQ ID:No2 所示的氨基酸序列的碱基序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来提供一个核酸的同系物。本发明中核酸的同系物可以通过对编码该蛋白序列基因的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。其中所述含有突变点的引物的制备方法为本领域常规制备方法，较佳的为人工合成。利用本发明所述 PCR 引物进行PCR扩增程序，即得编码所述产黄枝顶头孢霉脂肪酶AclipA的DNA核酸分子。

本发明提供一种分离的蛋白质，其是由序列表中 SEQ ID:No2 所示氨基酸序列组成的蛋白质；本发明所述分离的蛋白质的制备方法为本领域常规制备方法。所述制备方法较佳地为：从自然界中天然存在的蛋白质中分离获得，从重组表达该蛋白质的表达转化子中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得；具有序列表中SEQ ID:No2 所示氨基酸序列的蛋白质命名为产黄枝顶头孢霉脂肪酶。

本发明提供一种包含上述DNA核酸的重组表达载体。其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，将本发明所述的编码产黄枝顶头孢霉脂肪酶的基因核酸分子连接于各种表达载体上构建而成；本发明所述的表达载体为本领域常规的各种载体；所述载体较佳地包括：各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选地为质粒pBARGPE1-Hygro。

一种包含上述重组表达载体的重组表达转化子。本发明所述重组表达转化子的制备方法较佳地为：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物较佳地为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且所携带的脂肪酶基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为大肠杆菌(E.coli) 菌株BL21(DE3) 或大肠杆菌菌株DH5α。将前述重组表达质粒转化至大肠杆菌DH5α中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法、农杆菌介导转化法、热激法或电转法。

含有上述的DNA核酸或如上所述的重组表达载体在制备CPC中的应用，含有上述的蛋白质或如上所述的重组表达转化子在制备头孢霉素C中的应用也属于本发明的保护范围。

高产头孢菌素C的基因工程菌的构建方法，包含权利要求1或2所述的基因工程菌，培养得到头孢菌素C的步骤。

上述方法中，所述培养方法包括以下步骤：将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得，将转化所得宿主微生物在25℃~40℃，震荡培养4~6d得到发酵液，将所得发酵液离心后取上清液即得；本发明所述的宿主微生物为本领域常规使用的产黄枝顶头孢霉微生物，也可以是工业上使用的高产菌株，较佳的为ATCC11550、CGMCC 3.3795，其拉丁文学名是Acremonium chrysogenum，该菌株通过市售可得。其中所述培养温度为本领域常规的培养温度，更佳地为 28℃~32℃。所述震荡培养的震荡速度更佳地为200~300rpm，优选地为230rpm，培养时间更佳地为 72~120 小时，优选地为96小时。

与现有技术相比，本发明公开的产黄枝顶头孢霉脂肪酶基因AclipA能够有效地调节产黄枝顶头孢霉菌的头孢菌素C的合成速率和产量。利用本发明的产黄枝顶头孢霉脂肪酶基因AclipA及其编码的蛋白质能够有效提高产黄枝顶头孢霉菌对发酵原料豆油的利用效率，促进头孢菌素C的合成速率和产量，具有很好的工业应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明的产黄枝顶头孢霉基因组总DNA电泳检测图；

图2 为本发明以ATCC11550基因组为模板AclipA基因PCR扩增结果图；

图3为本发明的构建质粒pBARGPE1-ACLipaseOE的示意图；

图4为本发明的野生型菌株ATCC11550和脂肪酶基因AclipA过表达突变株ATCC11550-pBARGPE1-ACLipaseOE脂肪酶基因AclipA表达水平差异图；

图5为野生型菌株ATCC11550和ATCC11550-pBARGPE1-ACLipaseOE的发酵及其CPC产量的测定图。

具体实施方式

下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步描述，在此发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

本实施例采用的菌株和质粒：大肠杆菌E. coli DH5α（购自日本Takara）；过表达的脂肪酶基因的菌株为产黄枝顶头孢霉（Acremonium chrysogenum）ATCC11550和CGMCC3.3795，分别收藏于美国模式培养物集存库(American type culture collection，英文简写ATCC)和中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological CultureCollection Center, CGMCC)。质粒pBARGPE1-Hygro为通用型丝状真菌表达质粒，购自淼灵质粒平台（货号：P0381）。质粒pBARGPE1-ACLipaseOE的构建操作方法请参考文献（宋佳. 黑曲霉ras基因功能的初步探究[D]. 哈尔滨工业大学，2018；张丕燕等，产黄枝顶头孢霉pcbAB-pcbC双向启动子区域的克隆与应用[J]，微生物学报，2004，44(2):255-257）。

本实施例采用的酶和试剂：限制性内切酶BamHI（酶切位点：5’-GGATCC-3’）、限制性内切酶EcoRI（酶切位点：5’-GAATTC -3’）、PrimeSTAR高保真酶、Mighty Mix连接酶、克隆用载体pMD19- T、DL2000DNA Marker、DL15000DNA Marker、PrimeScript RT Reagent Kit、SYBRPremix Ex Taq等均购自Takara 公司，UNIQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒、DNaseI、RNase Inhibitor等购自生工生物工程（上海）有限公司，Lysing Enzymes fromTrichoderma harzianum购自Sigma，大量质粒抽提试剂盒购自MN公司。CPC标准品购买自焦作健康元生物制品有限公司。

本实施例采用的PDA培养基：马铃薯 200 g/L，葡萄糖 20 g/L，琼脂 15 g/L，121℃ 30 min灭菌处理。

种子培养基：葡萄糖 5 g/L，蔗糖35 g/L，玉米浆 10 mL/L，硫酸铵8 g/L，DL-甲硫氨酸 0.5 g/L，碳酸钙5 g/L，豆油5 mL/L。

发酵培养基：淀粉30 g/L，糊精 60 g/L，α-淀粉酶 0.2 g/L，玉米浆 10 mL/L，DL-甲硫氨酸6 g/L，尿素 2 g/L，硫酸铵 11 g/L，硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）3 g/L，磷酸氢二钾 9g/L，碳酸钙 5 g/L，豆油 5 mL/L。

一、产黄枝顶头孢霉基因组DNA提取

采用北京索莱宝科技有限公司生产的D2300-50型Solarbio-真菌基因组DNA提取试剂盒对产黄枝顶头孢霉ATCC11550基因组总DNA进行提取。取50~100mg对数生长期的菌丝体，用玻璃研磨器适当研磨分散菌丝，加200ul试剂盒中提供的溶液A，加入20ul RNase A，再加入100mg玻璃珠，在高速振荡器上振荡约30min，然后按照试剂盒提供的步骤提取总基因组DNA，图1为本发明的产黄枝顶头孢霉基因组总DNA电泳检测图。

二、基因过表达质粒载体pBARGPE1-ACLipaseOE的构建

产黄枝顶头孢霉脂肪酶1编码基因AclipA的获得，构建重组质粒pBARGPE1-ACLipaseOE的示意图见图3。具体步骤如下：（1）采用Trizol试剂提取产黄枝顶头孢霉ATCC11550的总RNA，然后进行反转录获得cDNA。（2）、以步骤（1）获得的cDNA为模板，以PrimeSTAR高保真酶和引物LIP-F/LIP-R进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行测序验证，其中引物LIP-F序列：5′-ggatccATGGTGTCCCTCACTCGAGCAGCCT-3′(SEQ ID:NO3，下划线为限制性内切酶BamHI的识别位点)和引物LIP-R序列：5′-gaattcTTAGAACCTTAGCTTCTCAATATG-3′(SEQ ID:NO4，下划线为限制性内切酶EcoRI的识别位点)，获得约1815bp的PCR扩增cDNA产物。（3）将步骤（2）获得的 PCR扩增产物和载体pEASY-Blunt进行连接，得到重组质粒pEASY-ACLipaseOE。（4）用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切重组质粒pEASY-ACLipase，回收约1815bp的 DNA片段ACLipaseOE。（5）用限制性内切酶BamHI和EcoRI双酶切质粒pBARGPE1-Hygro，回收约5970bp的载体骨架。（6）将DNA片段ACLipaseOE和载体骨架进行连接，得到重组质粒pBARGPE1-ACLipaseOE。将重组质粒pBARGPE1-ACLipaseOE进行测序。根据测序结果，对重组质粒pBARGPE1-ACLipaseOE结构描述如下：将质粒pBARGPE1-Hygro的限制性内切酶BamHI和EcoRI之间的小片段取代为序列表的序列SEQ ID:No1所示的DNA分子。重组质粒pBARGPE1-ACLipaseOE表达序列表中序列SEQ ID:No2所示的脂肪酶。重组质粒pBARGPE1-ACLipaseOE具有gpdA启动子、AclipA基因、trpC终止子和潮霉素抗性基因。

三、过表达脂肪酶基因AclipA的产黄枝顶头孢霉菌株制备

产黄枝顶头孢霉ATCC11550菌丝体的培养和原生质体制备：(1)从培养斜面上刮下适量产黄枝顶头孢霉菌ATCC11550孢子，分别接种于100mL YPS液体培养基（葡萄糖2％，酵母提取物0 .5％，聚胨1％，MgSO₄·7H₂O 0 .1％，K₂HPO₄·3H₂O 0.13％，pH7 .0）中，28℃、230rpm振荡培养4～5d；(2)8000rpm离心15min收集菌丝体，用无菌水洗涤一次；(3) 0.22μm无菌滤膜过滤50mL 二硫苏糖醇(DTT，5mmol/L)溶液，30℃、150rpm振荡孵育40～60min；(4)8000rpm离心5min，用P Buffer(KCl 44.7g/L，MgCl₂·6H₂O 2.03g/L，CaCl₂ 2.78g/L)常温洗涤2次；(5)经0.22μm无菌滤膜过滤60mL Lysing酶解液(P Buffer配制，10mg/mL)，30℃、150rpm振荡孵育3～4h；(6)镜检，当大部分菌丝释放原生质体后，加入4倍体积的P Buffer，用灭菌的装填脱脂棉的针筒过滤除去残留的菌丝体；(7)3000rpm离心5min，P Buffer洗涤2次，将原生质体悬浮于适量P Buffer中，使原生质体浓度>10⁸ CFU；(8)将产黄枝顶头孢霉菌ATCC11550的原生质体分装于1.5mL离心管中，每管100μL。

B .产黄枝顶头孢霉原生质体转化及鉴定

采用PEG-CaCl₂介导的原生质体转化法将构建的质粒转化产黄枝顶头孢霉，实验步骤如下：(1)加入10 μg的质粒DNA，轻轻混匀，冰浴30min；(2)加入900μL 30％的PEG4000/CaCl₂溶液，25℃孵育15min。(3)6000rpm×5min，尽量吸出PEG4000溶液，用P Buffer洗涤1次；(4)将上述步骤A制备的原生质体分别重悬于100μL的P Buffer中，加入于45℃保温的上层软琼脂培养基中，于旋涡振荡器上轻轻振荡混匀，然后倾倒在再生平板上，迅速转动平板使软琼脂均匀覆盖在下层培养基表面；于28℃培养36h，覆盖含有潮霉素的NaCl软琼脂，使平板中潮霉素终浓度为5 μg/mL，软琼脂凝固后，于28℃培养；(5)培养7d后分别挑取两种菌株博来霉素抗性转化子斜面培养，7d后提取基因组DNA进行PCR验证。

四、产黄枝顶头孢霉脂肪酶基因转录和表达水平分析

A .转录水平分析

产黄枝顶头孢霉总RNA的提取：将固体种子培养基（液体种子培养基+2.0%琼脂粉）斜面上刮下的产黄枝顶头孢霉ATCC11550的孢子用玻璃珠或匀浆器打散后接种于液体种子培养基中，28℃、230rpm培养72h；以10％的接种量转接至发酵培养基中，同样条件培养4~7d，12000rpm离心10min收获菌体，生理盐水洗涤2次。微量元素溶液的配方为FeSO₄·7H₂O0.8％，MnSO₄·H₂O 0.2％，ZnSO₄·7H₂O 0.2％，CuSO₄·5H₂O 0.2％，pH=1.0。离心收集的菌体用UNIQ-10柱式Trizol总RNA提取试剂盒提取总RNA。

总RNA中DNA的去除：在微量离心管中配制下列反应液：RNA样品20～50μg，10×DNase I 5μL，Recombinant DNase I 2μL，RNase Inhibitor(40 U/μL)20 Units，DEPC-treated water (RNase-free, 5U/μL)Buffer至总体积50 μL。反应条件为：(1)37℃反应20～30min后，使用热处理法使Recombinant DNase I失活：加入2.5 μL 0.5M EDTA，混匀后80℃加热处理2 min，用RNase Free dH₂O定容至100μL。 (2)加入10μL 3M 乙酸钠和250 μL冷乙醇，-80℃放置2 min，4℃、12000 rpm离心10min，弃上清。(3)加入70％冷乙醇洗净，4℃、12000rpm离心5min，弃上清后沉淀干燥，用适量的RNase Free dH₂O溶解后，进行Agarose电泳确认是否除去基因组DNA，同时测定RNA浓度。

RNA逆转录合成cDNA：使用Takara公司的PrimeScript RT Reagent Kit逆转录合成cDNAR，以β-actin基因作为内参。反应体系为 (10μL)：5×PrimeScript Buffer 2μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL，Oligo dT Primer(50μM) 0.5μL，Total RNA。反应条件为：37℃×15min(反转录反应)，85℃×5 s (反转录酶的失活反应)。采用Pfaffl’s方法计算脂肪酶基因的相对表达量，同时设置没有cDNA的反应体系作为阴性对照。

实时荧光定量PCR：设计的qPCR引物为qLIP-F(5’-TGGTCAGAGCGAAGATTGTC-3’，SEQID:No5)和 qLIP-R(5’- CATCGTTCTCGATCTCCT-3’，SEQ ID:No6)。检测β-actin基因的引物为qActin-F（5′-AGTCCAAGCGTGGTATCC-3′，SEQ ID:No7）和qActin-R（5′-TAGAAGGCAGGGGCGTTG-3′，SEQ ID:No8）。

本实施例采用的引物列表

按下列组分配制PCR反应体系(冰浴进行)：SYBR Premix Ex Taq(2×) 12.5μL，5’-qLIP-F (10μM) 0.5μL，3’-qLIP-R(10μM) 0.5μL，cDNA模板2.0 μL，补加ddH₂O至反应体系总体积25μL。在25μL的反应体系中，cDNA模板的添加量通常在100 ng以下。采用三步法进行PCR反应：95℃×10min，95℃×10 s，61℃×15 s，72℃×20 s，荧光检测一次，共40个循环。图2 为本实施例以ATCC11550基因组为模板AclipA基因PCR扩增结果图；如图3所示，发现在发酵第3天到第5天高产突变菌中编码脂肪酶AclipA的基因转录水平比对照菌中高，说明高产菌在发酵3~5d脂肪酶基因AclipA得到持续过表达，有助于产黄枝顶头孢霉脂肪酶活性提高，从而强化CPC发酵液中豆油酶解效率的提升。

B .脂肪酶基因过表达效果的检测

将转化后的产黄枝顶头孢霉ATCC11550原生质体细胞与软琼脂混合后涂布于再生培养基上生长。根据菌落的生长状况（菌落生长3~5d后，可以看见较稀疏单菌落），在平板铺上含有潮霉素的上层软琼脂使其终浓度为5.0 μg/ml。铺完抗生素后，28℃培养，期间应每天都注意观察转化子是否出现以及生长状况。若有转化子一般10-15d后其基本生长良好，可挑取至含有5.0 μg/ml潮霉素的分单培养基上，28℃恒温培养5-7d。将得到的所有转化子进行摇瓶发酵培养，发酵5天后经HPLC检测得到发酵结果，发现CPC发酵单位显著提高，证明了过表达脂肪酶基因对CPC产量起到上调作用。

五、产黄枝顶头孢霉的发酵和发酵产物CPC的检测

本实施例中的三角瓶的规格均为500mL，三角瓶底部带有直挡板，每个实验菌株有三个摇瓶重复。

从培养10d的斜面上刮下适量产黄枝顶头孢霉孢子，以野生型出发菌株ATCC11550为对照，含转化子的菌株为实验组，其中转化子1为转有空质粒pBARGPE1-Hygro的产黄枝顶头孢霉菌菌株ATCC11550-pBRGPE1-Hygro，转化子2为转有脂肪酶基因过表达质粒pBARGPE1-ACLipaseOE的产黄枝顶头孢霉菌菌株ATCC11550-pBARGPE1-ACLipaseOE，分别接种于装有30mL种子培养基的 500mL摇瓶中，于旋转式摇床培养3d，转速为230rpmn，温度28℃。再以10％(v/v)的接种量转接至装量为30mL种子培养基的250mL摇瓶中，25℃，230rpm，培养7d。发酵液经普通滤纸、0.22μm过滤，收集滤液，稀释20倍后进行HPLC检测。使用的是美国Agilent 1260HPLC检测器，C18色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇：0.2％(w/v)磷酸二氢钠＝5:95，流速为1.0mL/min，检测波长为254nm，进样量10μL，分析时间9min。根据峰面积和标准品的有效含量计算出样品中CPC含量。图4为本发明的野生型菌株ATCC11550和脂肪酶基因AclipA过表达突变株ATCC11550-pBARGPE1-ACLipaseOE脂肪酶基因AclipA表达水平差异图；图5为野生型菌株ATCC11550和ATCC11550-pBARGPE1-ACLipaseOE的发酵及其CPC产量的测定图；检测结果为，野生型出发对照菌株ATCC11550的CPC产量为3465.7±324.5 mg/L，转有空质粒pBARGPE1-Hygro转化子的突变型对照菌株ATCC11550-pBRGPE1-Hygro的CPC产量为3379±404.6 mg/mL，转有脂肪酶过表达质粒pBARGPE1-ACLipaseOE转化子的突变型菌株ATCC11550-pBARGPE1-ACLipaseOE的CPC产量为5782.7±238.9 mg/mL。对数据进行统计分析后可知，野生型对照菌株ATCC11550与转有空质粒pBRGPE1-Hygro的对照菌株ATCC11550-pBRGPE1-Hygro的CPC产量无显著性差异，而与转有脂肪酶基因过表达质粒pBARGPE1-ACLipaseOE的实验突变菌株ATCC11550-pBARGPE1-ACLipaseOE有显著性差异（p=0.012），转有空质粒pBRGPE1-Hygro的对照菌株ATCC11550-pBRGPE1-Hygro与转有脂肪酶基因过表达质粒pBARGPE1-ACLipaseOE的实验突变菌株ATCC11550-pBARGPE1-ACLipaseOE之间同样有显著性差异（p=0.024）。上述实验结果证明，对产黄枝顶头孢霉内源性脂肪酶基因进行过表达，能够有效促进CPC产量的提高。

本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 河南省健康元生物医药研究院有限公司

<120> 高产头孢菌素C的基因工程菌构建方法及其应用

<130> 2021.5.11

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1803

<212> DNA

<213> 顶头孢霉(Acremonium chrysogenum.)

<400> 1

atggtgtccc tcactcgagc agcctcatgg cttctgccta tcactggtgc cctcgccgtt 60

cccactgcca cggtggtgga acgagctgtg aggacggcca ccgtcgtaat tccttcgccg 120

gatgcgacgg ttctgggtaa tgtgatgaac aaggtcgagt cttttggagg catcccctat 180

gctgagccac ccgtcggaca gttgcggatg agacctccca agcgactgtc taagtcgctc 240

ggcacattcg acggcaccgg ccccgcaggg gcatgcccgc agttcctgtc ttccaccgag 300

agcaacaatt tcctatttga tatactgggt gatatcgcca acattccgtg ggtccaggat 360

gtcactggtc agagcgaaga ttgtctcagc atcacggttg cgcgacccca aggtaccaag 420

gccggggaca agctgcctgt gctgtactgg atttttggcg gcggattcga ggtattcact 480

atttcccccc tcaccgtgcg tcccaggcga aggcgtgcgc agctgacatt atctctcgtg 540

tccaccttgc agattggctg gtcttccatg tatgacggga cagggctcgt gaactacggg 600

gtcgagattg gcaaaccgtt tgtctttgtg gccgtcaact accgtgttgg tgggttcggg 660

tttatgcctg ggaaggagat cgagaacgat gggtccggta atgctgggct cctcgatcag 720

cggatgggcc tggagtgggt tgccgacaat atcgctgcct ttgggggcga ccccgacaag 780

gttaccatat ggggcgagtc ggccggcgcc atatccgtgt gcgctcagat ggcccttttc 840

gacggcaaca acacctacaa cgacaaacct ctcttccggg gtgccatcat gagctccggg 900

agcatcatcc caaccaaccc cctatcgtcc agcaaggggc aagcagtgta cgatcaagtc 960

gtcaaggccg gcggctgcag cgatgccgct gattccttgg aatgtcttcg aggtctcagt 1020

tacgacaagt ttctcaacgc cgccaactcg gtaccccatc tgctgtccta caactcgctg 1080

gcgctctcgt acctaccacg tccggacggc cgtaccctaa ccgactcacc cgatgccctc 1140

atcctggccg gcaagtatgc cgccgtgccc atgatcattg gtgaccagga ggacgaggga 1200

accctttttg gactcttcca gccagccttg accacaaccg agaaactcgc cagctatctg 1260

aaagactact acttcgacgg cgcaacaaag caggagctca cggcgctgat caacacctac 1320

ggatcgggac tcggcgctgt gggcgagggt agcccacacc gcaccggtct ctcgaatgag 1380

atcttccccg ggttcaagag acgggctgcc attctgggtg atctcgtctt caccctctcc 1440

aggaggctgt ttttgatggc caccacagga gtcaacgccg acgtgccgtc gtggtcgtac 1500

ctcatgtccc aaaactatgg tacccctatc ttgggcacct tccacggcgc cgacatcctc 1560

caagtctttt tcggaatcca caacaattat gcggccaaga gcatgaggtc gtactttatc 1620

aactttgtcc actcacttga ccccaacggc cagggggaca ctggattccc cgagtggccg 1680

cgttggtccg atggtcacaa gttggcccag gtattttctc ggaggtcggc cctgctggat 1740

gataatttca gggaggacag cttccactgg ttggctggac atattgagaa gctaaggttc 1800

taa 1803

<210> 2

<211> 600

<212> PRT

<213> 顶头孢霉(Acremonium chrysogenum.)

<400> 2

Met Val Ser Leu Thr Arg Ala Ala Ser Trp Leu Leu Pro Ile Thr Gly

1 5 10 15

Ala Leu Ala Val Pro Thr Ala Thr Val Val Glu Arg Ala Val Arg Thr

20 25 30

Ala Thr Val Val Ile Pro Ser Pro Asp Ala Thr Val Leu Gly Asn Val

35 40 45

Met Asn Lys Val Glu Ser Phe Gly Gly Ile Pro Tyr Ala Glu Pro Pro

50 55 60

Val Gly Gln Leu Arg Met Arg Pro Pro Lys Arg Leu Ser Lys Ser Leu

65 70 75 80

Gly Thr Phe Asp Gly Thr Gly Pro Ala Gly Ala Cys Pro Gln Phe Leu

85 90 95

Ser Ser Thr Glu Ser Asn Asn Phe Leu Phe Asp Ile Leu Gly Asp Ile

100 105 110

Ala Asn Ile Pro Trp Val Gln Asp Val Thr Gly Gln Ser Glu Asp Cys

115 120 125

Leu Ser Ile Thr Val Ala Arg Pro Gln Gly Thr Lys Ala Gly Asp Lys

130 135 140

Leu Pro Val Leu Tyr Trp Ile Phe Gly Gly Gly Phe Glu Val Phe Thr

145 150 155 160

Ile Ser Pro Leu Thr Val Arg Pro Arg Arg Arg Arg Ala Gln Leu Thr

165 170 175

Leu Ser Leu Val Ser Thr Leu Gln Ile Gly Trp Ser Ser Met Tyr Asp

180 185 190

Gly Thr Gly Leu Val Asn Tyr Gly Val Glu Ile Gly Lys Pro Phe Val

195 200 205

Phe Val Ala Val Asn Tyr Arg Val Gly Gly Phe Gly Phe Met Pro Gly

210 215 220

Lys Glu Ile Glu Asn Asp Gly Ser Gly Asn Ala Gly Leu Leu Asp Gln

225 230 235 240

Arg Met Gly Leu Glu Trp Val Ala Asp Asn Ile Ala Ala Phe Gly Gly

245 250 255

Asp Pro Asp Lys Val Thr Ile Trp Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser

260 265 270

Val Cys Ala Gln Met Ala Leu Phe Asp Gly Asn Asn Thr Tyr Asn Asp

275 280 285

Lys Pro Leu Phe Arg Gly Ala Ile Met Ser Ser Gly Ser Ile Ile Pro

290 295 300

Thr Asn Pro Leu Ser Ser Ser Lys Gly Gln Ala Val Tyr Asp Gln Val

305 310 315 320

Val Lys Ala Gly Gly Cys Ser Asp Ala Ala Asp Ser Leu Glu Cys Leu

325 330 335

Arg Gly Leu Ser Tyr Asp Lys Phe Leu Asn Ala Ala Asn Ser Val Pro

340 345 350

His Leu Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Ala Leu Ser Tyr Leu Pro Arg Pro

355 360 365

Asp Gly Arg Thr Leu Thr Asp Ser Pro Asp Ala Leu Ile Leu Ala Gly

370 375 380

Lys Tyr Ala Ala Val Pro Met Ile Ile Gly Asp Gln Glu Asp Glu Gly

385 390 395 400

Thr Leu Phe Gly Leu Phe Gln Pro Ala Leu Thr Thr Thr Glu Lys Leu

405 410 415

Ala Ser Tyr Leu Lys Asp Tyr Tyr Phe Asp Gly Ala Thr Lys Gln Glu

420 425 430

Leu Thr Ala Leu Ile Asn Thr Tyr Gly Ser Gly Leu Gly Ala Val Gly

435 440 445

Glu Gly Ser Pro His Arg Thr Gly Leu Ser Asn Glu Ile Phe Pro Gly

450 455 460

Phe Lys Arg Arg Ala Ala Ile Leu Gly Asp Leu Val Phe Thr Leu Ser

465 470 475 480

Arg Arg Leu Phe Leu Met Ala Thr Thr Gly Val Asn Ala Asp Val Pro

485 490 495

Ser Trp Ser Tyr Leu Met Ser Gln Asn Tyr Gly Thr Pro Ile Leu Gly

500 505 510

Thr Phe His Gly Ala Asp Ile Leu Gln Val Phe Phe Gly Ile His Asn

515 520 525

Asn Tyr Ala Ala Lys Ser Met Arg Ser Tyr Phe Ile Asn Phe Val His

530 535 540

Ser Leu Asp Pro Asn Gly Gln Gly Asp Thr Gly Phe Pro Glu Trp Pro

545 550 555 560

Arg Trp Ser Asp Gly His Lys Leu Ala Gln Val Phe Ser Arg Arg Ser

565 570 575

Ala Leu Leu Asp Asp Asn Phe Arg Glu Asp Ser Phe His Trp Leu Ala

580 585 590

Gly His Ile Glu Lys Leu Arg Phe

595 600

Claims

1.高产头孢菌素C的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是通过对产黄枝顶头孢霉的内源性脂肪酶AclipA基因进行过量表达获得，所述脂肪酶AclipA的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID:No1 所示。

2.如权利要求1所述的高产头孢菌素C的基因工程菌，其特征在于，所述脂肪酶AclipA的氨基酸序列如SEQ ID:No2 所示。

3.权利要求1或2所述的高产头孢菌素C的基因工程菌中脂肪酶AclipA的核酸分子。

4.权利要求2所述的高产头孢菌素C的基因工程菌中脂肪酶AclipA的蛋白质。

5.含有权利要求3所述核酸分子的重组表达载体。

6.含有权利要求5所述重组表达载体的重组表达转化子。

7.权利要求1或2所述高产头孢菌素C的基因工程菌、或权利要求3所述核酸分子、或权利要求4所述蛋白质、或权利要求5所述重组表达载体、或权利要求6所述重组表达转化子在制备头孢菌素C中的应用。

8.高产头孢菌素C的基因工程菌的构建方法，包含权利要求1或2所述的基因工程菌，得到头孢菌素C的步骤。