CN108587926B

CN108587926B - 黑曲霉、其α-L-鼠李糖苷酶制备方法及质粒载体及重组菌

Info

Publication number: CN108587926B
Application number: CN201810437103.2A
Authority: CN
Inventors: 郑璞; 王德庆; 陈鹏程
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2018-05-09
Filing date: 2018-05-09
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2038-05-09
Also published as: CN108587926A

Abstract

本发明公开了黑曲霉、其α‑L‑鼠李糖苷酶制备方法及质粒载体及重组菌，所述α‑L‑鼠李糖苷酶来源于所述黑曲霉，所述α‑L‑鼠李糖苷酶核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过筛选获得水解柚皮苷的菌株黑曲霉WDQ‑1，并从其中获取了编码α‑L‑鼠李糖苷酶的基因，通过毕赤酵母高密度发酵，获得大量的α‑L‑鼠李糖苷酶，本发明构建重组菌毕赤酵母GS115/pPIC9K‑rha和GS115‑rha+vgb‑3，在3‑L发酵罐高密度发酵，发酵液产酶活性达到19000U/mL以上，展现良好的工业化前景。

Description

黑曲霉、其α-L-鼠李糖苷酶制备方法及质粒载体及重组菌

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及黑曲霉、其α-L-鼠李糖苷酶制备方法及质粒载体及重组菌。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(EC 3.2.1.40)是一种水解酶，可以水解柚皮苷、橙皮苷、芦丁以及萜烯类糖苷等末端的鼠李糖基，并释放出L-鼠李糖和次级苷，在果汁脱苦，饮料风味改善，生产甜味剂、药物中间体，黄酮苷等天然化合物结构改性等方面有广泛应用，是生物技术中一种重要的糖苷酶。α-L-鼠李糖苷酶广泛分布于动物组织、植物、酵母、细菌和真菌中，可以通过芽孢杆菌、拟杆菌、乳杆菌、单胞菌等细菌，和曲霉属、青霉属、犁头霉属等真菌发酵获得。但是，由细菌和真菌发酵得到的α-L-鼠李糖苷酶是与β-葡萄糖苷酶结合在一起的混合酶，通常称为柚苷酶。要获得纯的α-L-鼠李糖苷酶，操作难度大，分离纯化的成本较高，目前还没有工业化生产。目前市场上销售的α-L-鼠李糖苷酶粗酶液一般都是含有α-L-鼠李糖苷酶的柚苷酶，纯的α-L-鼠李糖苷酶从国外进口，价格昂贵。

中国专利CN101914451A公布了一种产α-L-鼠李糖苷酶的链格孢菌，链格孢菌所产的α-L-鼠李糖苷酶为胞内酶，需要从细胞中分离提取，才能得到纯酶。中国专利CN102321645A公布了一种来源于链格孢菌的α-L-鼠李糖苷酶基因及其氨基酸序列，并将其在毕赤酵母中表达，但产酶量不高，仅426mg/L。

中国专利105176843A公布了一株产α-L-鼠李糖苷酶的互隔交链孢 SK.37.002，菌株发酵，获得菌丝体，再经菌丝体破碎、分离、纯化可以得到α-L-鼠李糖苷酶。中国专利105441410A公布了一种细丽毛壳菌发酵产鼠李糖苷酶的方法，通过发酵过程中流加鼠李糖的方法，使发酵液产酶达到500U/ml。

综上所述，近年来α-L-鼠李糖苷酶的研究深受人们的关注，但多数研究还集中于产酶微生物的获得、不同来源α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及其酶学性质、和水解应用验证的研究上，对于如何发酵制备高活性的α-L-鼠李糖苷酶很少涉及。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供黑曲霉CCTCC NO：M 2018240(Aspergillus niger，WDQ-1)，于2018年04月28 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2018240。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供α-L- 鼠李糖苷酶质粒。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：α-L-鼠李糖苷酶质粒，其中：所述α-L-鼠李糖苷酶来源于所述黑曲霉CCTCC NO：M 2018240，所述α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明所述α-L-鼠李糖苷酶质粒的一种优选方案：所述α-L-鼠李糖苷酶质粒，其载体包括pPIC9K。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供α-L- 鼠李糖苷酶重组菌。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：α-L-鼠李糖苷酶重组菌，其中：所述α-L-鼠李糖苷酶来源于所述黑曲霉CCTCC NO：M 2018240，所述重组菌包括毕赤酵母。

作为本发明所述的α-L-鼠李糖苷酶重组菌的一种优选方案：所述α-L-鼠李糖苷酶重组菌中含有权利要求2或3所述的α-L-鼠李糖苷酶质粒，所述毕赤酵母包括毕赤酵母GS115。

作为本发明所述的α-L-鼠李糖苷酶重组菌的一种优选方案：所述重组菌含有α-L-鼠李糖苷酶与透明颤菌血红蛋白共表达的重组质粒。

作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供α-L- 鼠李糖苷酶的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，其包括，构建重组菌：构建权利要求4～6任一所述的重组菌；发酵：重组菌发酵产α-L-鼠李糖苷酶。

作为本发明所述的α-L-鼠李糖苷酶的制备方法的一种优选方案：所述构建重组菌，包括，以黑曲霉CCTCC NO：M 2018240的mRNA反转录得到的cDNA，以 cDNA为模板进行PCR扩增，得到α-L-鼠李糖苷酶基因rha，纯化PCR扩增产物，并与载体pMD19-T连接，然后将连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板，获得阳性克隆，提取质粒获得重组质粒 pMD19-T-rha；以重组质粒pMD19-T-rha为模板进行PCR扩增，将回收的扩增产物与经EcoR I、Avr II酶双酶切后的质粒pPIC9K进行同源重组，将得到的质粒导入大肠杆菌JM109感受态细胞，菌落PCR挑取阳性克隆，获得表达载体pPIC9K-rha。

作为本发明所述的α-L-鼠李糖苷酶的制备方法的一种优选方案：所述构建重组菌还包括，将所述表达载体pPIC9K-rha，用Sal I酶线性化，并导入毕赤酵母GS115感受态细胞，筛选高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-rha-14；构建表达载体pPICZαA-vgb，并线性化后导入毕赤酵母GS115/pPIC9K-rha-14感受态细胞，筛选重组菌株。

作为本发明所述的α-L-鼠李糖苷酶的制备方法的一种优选方案：所述发酵，其种子培养基为YPD，培养温度28～33℃，时间18～30h，发酵接种量为 5～10％，发酵培养基为BSM，采用分批发酵阶段，当发酵液中甘油耗尽时，流加补料生长培养基，在OD600达到100～150以上停止流，饥饿培养0.5～2h，然后再流加甲醇诱导，诱导温度为25～28℃，DO保持在20～30％。

本发明的有益效果：本发明通过筛选获得水解柚皮苷的菌株黑曲霉 WDQ-1，并从其中获取了编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，通过毕赤酵母高密度发酵，获得大量的α-L-鼠李糖苷酶，本发明构建重组菌毕赤酵母 GS115/pPIC9K-rha和GS115-rha+vgb-3，在3-L发酵罐高密度发酵，发酵液产酶活性达到19000U/mL以上，展现良好的工业化前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为目的基因rha的PCR扩增电泳图。

图2为pPIC9K-rha双酶切验证图。

图3为3-L发酵罐发酵产α-L-鼠李糖苷酶曲线图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1：

水解柚皮苷菌株筛选与鉴定：

平板筛选培养基：MgSO₄·7H₂O 3-5.0g/L，K₂HPO₄ 5-10.0g/L，KCl 2-5.0g/L，FeSO₄·7H₂O0.5-0.1g/L，琼脂20g，蔗糖2-10g/L，柚皮苷2.5-5g/L，蒸馏水1L，自然pH值，121℃蒸汽灭菌20-30min。

产酶发酵培养基：MgSO₄·7H₂O 0.5-2g/L，KH₂PO₄ 1.5-2.5g/L，(NH₄)₂SO₄ 2-4.0g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.05-0.1g/L，CaCl₂ 0.05-0.1g/L，酵母膏0.5-1g/L，柚皮苷5-8g/L，蔗糖10-20g/L，蛋白胨1-2g/L，pH 6.0-7.0，115℃20min

将腐烂的柑橘皮在盛有玻璃珠的摇瓶中打碎，然后稀释涂布平板筛选培养基，25-28℃培养3-5天，在培养基中加入70-90％的一缩二乙二醇溶液，利用一缩二乙二醇与柚皮苷反应形成黄色，不与柚皮苷水解产物柚配质发生呈色反应的原理，有透明圈产生，说明菌株能水解柚皮苷，即可产α-L-鼠李糖苷酶。挑选透明圈大的菌株于发酵培养基中，进行摇瓶发酵复筛，酶活最高的菌株命名为WDQ-1。

实施例2：

WDQ-1菌株的鉴定：

形态学鉴定：菌株WDQ-1在PDA平板上生长，第一天：中间产生黄色凸起，凸起及四周产生白色绒毛，边缘整齐。第二天：黄色凸起上面开始产生白色孢子，从凸起中央向四周产生褶皱。第三天：凸起四周的孢子开始变灰，形成一圈灰色孢子，褶皱形成的沟壑中的孢子也开始变灰。第四天：凸起四周白色孢子开始变灰，中间灰色孢子孢子颜色开始变为褐色。第五天：产生多个同心圆，中间凸起向外孢子开始变为褐色。第六天：最靠近外圈白色绒毛的一圈孢子开始变为褐色。第七天：整体颜色为褐色，中间凸起颜色最深，凸起往外颜色变浅，快到达最外围白色绒毛的孢子颜色也为褐色。根据背面的情况，中间凸起向四周有褶皱，褶皱到达黄色同心圆为止。

在显微镜下观察，菌丝无隔膜，菌丝顶端连接球形顶囊，顶囊表面产生小梗，小梗自顶囊全部表面呈放射状生出，表面有大量孢子，属于曲霉属细胞形态。

分子生物学鉴定：将菌株WDQ-1在PDA平板上培养2-4d，收集菌丝体，液氮研磨，取50-100mg粉末至1.5mL离心管中，按Ezup柱式真菌基因组DNA 抽提试剂盒提取菌株基因组，送至上海生工进行ITS测序，核苷酸序列如SEQ ID NO.2。测得的ITS序列与Aspergilusniger CMXY25845、PHCT-FS11、JC-A3 的ITS序列相似性为100％，与Aspergilus awamoriSRRC 332、13/51、Aspergilus welwitschiae CBS 139.54的ITS序列一致性为99％。因此，基于上述比对结果，根据形态学与分子生物学鉴定，将菌株WDQ-1鉴定为黑曲霉Aspergilusniger WDQ-1，将其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2018.04.28，保藏编号CCTCCNO：M 2018240。

表1：菌株WDQ-1ITS序列比对

实施例3：

α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆：

将黑曲霉菌株WDQ-1接种于PDA液体培养基中25-28℃培养1-3天，收集菌丝体，用液氮研磨成白色粉末，提取总RNA，然后反转录成cDNA。以 cDNA为模板，F0，R3为引物进行PCR扩增。PCR反应条件为：90-95℃预变性3-5min，94℃变性30-45sec，55℃退火30-45sec，70-72℃延伸2.5min，30 个循环，70-72℃总延伸5-10min。

PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1所示，切胶回收α-L-鼠李糖苷酶基因rha。所述引物为：

F0：5’-ATGTGGTCTTCCTGGCTGCTG-3’

R3：5’-CTAATTATTACTCAACTTCCACTTTCCACCCTGC-3’

将上述步骤获得α-L-鼠李糖苷酶基因rha与载体pMD19-T连接，在10-16℃连接30-60min，导入大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含有氨苄青霉素抗性的LB平板，挑取阳性克隆，菌落PCR验证阳性克隆，获得重组质粒 pMD19-T-rha，送苏州金唯智生物科技有限公司测序。

实施例4：

α-L-鼠李糖苷酶核苷酸和氨基酸序列比对：

将得L-鼠李糖苷酶基因核苷酸序列SEQ ID NO.1，与NCBI中的核苷酸序列和氨基酸的进行序列比对，结果如下表：

表2α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列比对

菌株WDQ-1的α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列与Aspergilus niger CBS 513.88、Aspergilus kawachi Akrhm78、Aspergilus niger TS528的α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列SEQ ID NO.1相似性分别为99％、94％、91％。

表3α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列比对

菌株WDQ-1的α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列与Aspergilus niger ATCC 1015一个预测蛋白的氨基酸序列相似性为100％，与Aspergilus tubingensis CBS 134.48 一个预测蛋白的氨基酸序列相似性为97％；与Aspergilus niger CBS 513.88、 Aspergiluskawachi和一株Aspergilus nige的α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列相似性分别为99％、98％和97；与Aspergilus luchuensis CBS 106.47的糖苷水解酶GH78 家族蛋白的相似性为98％。本发明α-L-鼠李糖苷酶氨基酸序列见序列SEQ ID NO.3。

说明从黑曲霉菌株WDQ-1中成功克隆到一种α-L-鼠李糖苷酶的基因rha。

实施例5：

构建表达载体pPIC9K-rha：

以重组质粒pMD19-T-rha为模板，F-EcoR I、R-Avr II为引物，PCR扩增 rha，PCR反应条件为：90-95℃预变性5min，95-98℃变性10sec，55℃退火5-10 sec，70-72℃延伸20-30sec，30个循环，70-72℃总延伸10min。

切胶回收基因rha。用EcoR I、Avr II酶双酶切质粒pPIC9K，将纯化的酶切产物与加上酶切位点的基因rha同源重组，构建表达载体pPIC9K-rha。将表达载体导入大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含有卡那霉素(25-50mg/L)抗性的LB平板，挑取阳性克隆，进行菌落PCR、双酶切验证，结果如图2所示。所述引物为：

F-EcoR I：5’-gctgaagcttacgtagaattcGTGCCCTACGAGGAGTACATCC-3’，下划线表示EcoR I酶切位点；

R-Avr II：5’-ttaattcgcggccgccctaggCTAATTATTACTCAACTTCCACTTTCCAC -3’，下划线表示Avr II酶切位点。

实施例6：

重组毕赤酵母构建与表达：

提取重组质粒pPIC9K-rha，用Sal I酶进行线性化，乙醇沉淀回收线性化质粒，取5-10μL(约3-5μg)线性化pPIC9K-rha质粒与80μL毕赤酵母GS115 感受态细胞混合，1.2-1.5kV电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞，转化液涂布 MD平板，25-30℃培养2-4d，获得单菌落。

MD平板培养基：800mL水中加入20g琼脂粉，121℃灭菌20min，待温度降至60℃以下，在超净台加入10×YNB(无氨基酸酵母氮源)80-100mL， 10×D(20％葡萄糖)80-100mL，500×生物素1.5-2mL，混匀倒平板。

实施例7：

高拷贝重组毕赤酵母菌株GS115/pPIC9K-rha-14的筛选：

挑取在MD平板上生长的单菌落，转接到含有0mg/mL、0.5mg/mL、 1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、5mg/mL浓度G418的YPD抗性平板上筛选高拷贝毕赤酵母，25-30℃培养2-5d。挑取在1mg/mL G418以上浓度的抗性平板上生长良好的5个单菌落，接种于BMGY培养基中，28-33℃、180-220rpm 培养至OD₆₀₀＝2-6。室温下1500g离心5-10min，收集菌体，用BMMY培养基重悬菌体，28-30℃、180-220rpm培养。每12-24h取样一次，同时向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5-1％。发酵结束，获得一株拷贝数最高的菌株 GS115/pPIC9K-rha-14发酵7天，酶活达到191.29U/mL(如表4)。

表4，不同菌落摇瓶发酵产酶情况

BMMY培养基：酵母粉5-10g，蛋白胨15-20g，溶于700mL水中，12l℃灭菌20min，待温度降至60℃以下，在超净台加入10×YNB 80-100mL，10×M (5％的甲醇)60-100mL，1M的磷酸钾缓冲液(pH6.0)80-100mL，500×生物素1-2mL，混匀。

实施例8：

3-L发酵罐高密度发酵产α-L-鼠李糖苷酶：

挑取斜面上的GS115/pPIC9K-rha-14菌苔一环于YPD培养基中，28-33℃培养18-30h。将生长12-24h的种子液按5-10％的接种量接种于含有BSM培养基的3-L发酵罐，分批发酵阶段，控制温度28-30℃，pH5.5-6.0，调转速为 300-500rpm。待甘油耗尽后，开始流加补料生长培养基。流加速度为10-20mL/L ·h，OD₆₀₀达到100-150以上停止流加，饥饿培养0.5-2h将甘油耗尽，转入甲醇诱导阶段。诱导温度为25-28℃，流加100％甲醇(含6-12mL/LPTM1)，根据培养情况调节流速，DO保持在20-30％，结果如图3所示，在3-L发酵罐高密度发酵，发酵液产酶活性达到19000U/mL以上。

实施例9：

共表达Rha与VHb菌株构建及表达：

通过人工合成透明颤菌血红蛋白VHb的基因vgb，以F-EcoR I、R-Xba I 为引物进行PCR扩增，扩增产物与质粒pPICZαA同源重组。将重组载体导入大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布含有博来霉素抗性的LB平板，筛选阳性克隆。提取重组载体pPICZαA-vgb，线性化后电转导入重组菌株 GS115/pPIC9K-rha-14感受态细胞，涂布含有博来霉素抗性的YPDS平板， 25-30℃培养2-5d，筛选阳性克隆。将阳性克隆转接到含有300-500μg/mL以上的博来霉素抗性的YPDS平板，28-30℃培养2-5d，筛选到5株高拷贝菌株，按实施例6中摇瓶发酵方法，将5株高拷贝菌株进行摇瓶筛选，最终获得一株酶活最高的菌株，命名为GS115-rha+vgb-3，酶活达到208.98U/mL，比菌株 Gs115/pPIC9K-rha-14酶活提高了9.25％。重组菌株GS115-rha+vgb-3在3-L发酵罐上发酵，诱导3.5天，酶活可以达到25000U/mL(柚苷底物消耗计)以上，比菌株Gs115/pPIC9K-rha-14的酶活提高了30％以上。

所述引物为：

F-EcoR I：5’-agagaggctgaagctgaattcATGTTAGACCAGCAAACCATTAACA-3’，下划线表示EcoR I酶切位点；

R-Xba I：5’-gagatgagtttttgttctagaTTATTCAACCGCTTGAGCGTAC-3’，下划线表示Xba I酶切位点。

YPDS培养基：800mL去离子水中加入酵母粉8-10g，蛋白胨15-20g，D- 山梨醇163-185g，定容至900mL，121℃灭菌20min，加入100mL 10xD(20％葡萄糖)。配制固体培养基时加入2％琼脂。

BMGY培养基：酵母粉5-10g，蛋白胨15-20g，溶于700mL水中，12l℃灭菌20min，待温度降至60℃以下，在超净台加入10×YNB 80-100mL，10×GY (10％的甘油)60-100mL，1M的磷酸钾缓冲液(pH6.0)80-100mL，500×生物素1-2mL，混匀。

YPD培养基：酵母提取物8-10g/L，蛋白胨15-20g/L，葡萄糖15-20g/L。

BSM发酵培养基：85％磷酸26.7mL/L，CaSO₄ 0.93g/L，K₂SO₄ 18.2g/L， MgSO₄·7H₂O14.9g/L，KOH 4.13g/L，甘油30-60g/L，PTM1 2-5mL/L，25％氨水调节pH 5.5。

PTM1：CuSO₄·5H₂O 6.0g/L、KI 0.08g/L、MnSO₄·H₂O 3.0g/L、 Na₂MoO₄·2H₂O0.2g/L、H₃BO₃ 0.02g/L、CoCl₂ 0.5g/L、ZnCl₂ 20g/L、FeSO₄·7H₂O 65g/L、Biotin 0.25g/L、H₂SO₄ 5.0mL/L。过滤除菌，4℃保存。

本发明产物分析方法：

柚苷酶活(α-L-鼠李糖苷酶)测定方法：

酶活测定方法：取0.5g/L的柚皮苷溶液(溶解于0.1mol/L，pH 4.0柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液)2mL，加入2.9mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0.1mol/L， pH 4.0)和0.1mL酶液，50℃水浴震荡5min，随即100℃沸水浴15min使酶失活，HPLC(高效液相色谱)检测柚皮苷的消耗量。对照所用的酶为0.1mL 100℃灭活15min的酶液。HPLC测定柚皮苷的消耗量。

酶活定义：上述条件下每分钟每毫升酶液分解柚皮苷的微克数定义为一个酶

色谱条件为：

HPLC测定柚皮苷：

Waters高效液相色谱，采用Amethyst C18-H(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流速1.0mL/min，进样量20μL，柱温35℃，Waters 2487UV，检测波长280 nm，流动相水：甲醇：乙腈＝62:12:26(v/v/v)。

纯α-L-鼠李糖苷酶的测定：

在400μL柠檬酸缓冲液(50mM，pH 5.0)中，加入50μL 4mM pNP-a-L-鼠李糖和50μL酶液，50℃恒温水浴5min，立即加入1mL 0.5M Na₂CO₃溶液终止反应，405nm下测定吸光值。

酶活定义：上述条件下每分钟反应产生1μmol对硝基苯酚定义为一个酶活单位。

本发明通过筛选获得水解柚皮苷的菌株黑曲霉WDQ-1，并从其中获取了编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，通过毕赤酵母高密度发酵，获得大量的α-L-鼠李糖苷酶，本发明构建重组菌毕赤酵母GS115/pPIC9K-rha和GS115-rha+vgb-3，在3-L发酵罐高密度发酵，发酵液产酶活性达到19000U/mL以上，展现良好的工业化前景。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 江南大学

<120> 黑曲霉CCTCCM2018240、其α-L-鼠李糖苷酶制备方法及质粒载体及重组菌

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1971

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 1

atgtggtctt cctggctgct gtcggcctta ctggccactg aggcgttggc cgtgccctac 60

gaggagtaca tcctagcccc gagctctcgc gacttggctc ctgcgtccgt tcgccaggtg 120

aacggttccg tcaccaatgc ggccgccttg acgggtgccg gtgggcaggc cacttttaac 180

ggcgtctctt cggtgacata cgactttggc atcaatgttg ctggtatcgt gtctgtggat 240

gtcgcttccg cctcctccga gtccgccttt atcggcgtga cattcaccga gtctagtatg 300

tggatcagta gcgaggcatg cgatgctact caggatgcgg gccttgatac tccgctctgg 360

ttcgctgtcg gtcagggagc gggcctgtat acagtggaaa agaagtacaa ccggggcgcc 420

ttccggtata tgacggttgt tagcaacacc accgccacgg tctctctcaa cagcgtcaag 480

atcaactata cggcatctcc cacacaggac cttcgtgcgt acacggggta cttccacagc 540

aacgatgagc tcctcaaccg catttggtat gccggtgcct ataccctgca attatgcagt 600

atcgatccca ctacgggaga tgctttggtg ggcctgggcg ttatcacctc gtctgagacc 660

atctcacttc cgcagacgga caagtggtgg acaaactaca ccatcaccaa tggcagcagt 720

accttgactg atggagccaa gcgtgaccga cttgtctggc caggtgatat gtccattgcc 780

ttagagagcg tggctgtcag taccgaggat ctgtatagtg tccgcacggc attggaatcc 840

ttgtatgctc tccagaaacc cgatggcaga cttccctatg ccgggaaacc attcttcgac 900

acggttagct tcacctacca tctccacagc ctggttggcg cggcatccta ttatcagtac 960

actggggacc gcgcgtggtt gacccggtac tggggtcaat acaagaaggg tgtgcaatgg 1020

gcgttgtcga gcgtggacag cacgggcctg gccaatatca cagcaagtgc tgactggctg 1080

aggtttggca tgggggcaca taacatcgaa gccaacgcga ttctgtacta cgtcctcaac 1140

gatgccatct ctctcgccca gaccctcaat gacaacgcac ccatcaggaa ctggaccacc 1200

actgcggccc ggatcaagac tgtagcaaac gaacttctct gggacgacaa gaacggtctc 1260

tacaccgaca acgagaccac caccctgcac ccgcaagatg gcaactcctg ggctgtcaag 1320

gcaaacctta ccctctctgc caaccagagt gccatcgttt ctgaatcgct cgctgcccgc 1380

tggggacctt acggcgcacc cgccccggag gcgggtgcaa cggtgtcgcc tttcatcggc 1440

ggcttcgagc tgcaagccca ctaccaggct ggccagcctg atcgcgccct cgatctcctc 1500

cggctgcagt ggggattcat gctggatgac ccgcggatga ccaactccac cttcatcgag 1560

gggtactcca cggacggatc gctggcctac gcaccgtaca ccaatacgcc gcgggtgtcg 1620

cacgcgcacg gctgggccac gggaccgacg tccgcgctga ccatctacac ggccgggttg 1680

cgtgtgacag gaccggcggg tgcgacctgg ctgtataagc cacaaccggg caatttgacc 1740

caggtcgagg ctgggtttag tacccgactg gggtcgttcg cgtcaagctt cagcagatcg 1800

gggggtagat atcaggaact gtcgttcagc acgccgaacg ggacgactgg atcggtggag 1860

ctgggggatg tgagcggaca gctggtgtcg gaccggggag tgaaggtgca gttggtggga 1920

ggtaaggcga gtggactgca gggtggaaag tggaagttga gtaataatta g 1971

<210> 2

<211> 598

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 2

ccgtagggtg aacctgcgga aggatcatta ccgagtgcgg gtcctttggg cccaacctcc 60

catccgtgtc tattgtaccc tgttgcttcg gcgggcccgc cgcttgtcgg ccgccggggg 120

ggcgcctctg ccccccgggc ccgtgcccgc cggagacccc aacacgaaca ctgtctgaaa 180

gcgtgcagtc tgagttgatt gaatgcaatc agttaaaact ttcaacaatg gatctcttgg 240

ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgataacta atgtgaattg cagaattcag 300

tgaatcatcg agtctttgaa cgcacattgc gccccctggt attccggggg gcatgcctgt 360

ccgagcgtca ttgctgccct caagcccggc ttgtgtgttg ggtcgccgtc cccctctccg 420

gggggacggg cccgaaaggc agcggcggca ccgcgtccga tcctcgagcg tatggggctt 480

tgtcacatgc tctgtaggat tggccggcgc ctgccgacgt tttccaacca ttctttccag 540

gttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag catatcaata agcggagg 598

<210> 3

<211> 656

<212> PRT

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 3

Met Trp Ser Ser Trp Leu Leu Ser Ala Leu Leu Ala Thr Glu Ala Leu

1 5 10 15

Ala Val Pro Tyr Glu Glu Tyr Ile Leu Ala Pro Ser Ser Arg Asp Leu

20 25 30

Ala Pro Ala Ser Val Arg Gln Val Asn Gly Ser Val Thr Asn Ala Ala

35 40 45

Ala Leu Thr Gly Ala Gly Gly Gln Ala Thr Phe Asn Gly Val Ser Ser

50 55 60

Val Thr Tyr Asp Phe Gly Ile Asn Val Ala Gly Ile Val Ser Val Asp

65 70 75 80

Val Ala Ser Ala Ser Ser Glu Ser Ala Phe Ile Gly Val Thr Phe Thr

85 90 95

Glu Ser Ser Met Trp Ile Ser Ser Glu Ala Cys Asp Ala Thr Gln Asp

100 105 110

Ala Gly Leu Asp Thr Pro Leu Trp Phe Ala Val Gly Gln Gly Ala Gly

115 120 125

Leu Tyr Thr Val Glu Lys Lys Tyr Asn Arg Gly Ala Phe Arg Tyr Met

130 135 140

Thr Val Val Ser Asn Thr Thr Ala Thr Val Ser Leu Asn Ser Val Lys

145 150 155 160

Ile Asn Tyr Thr Ala Ser Pro Thr Gln Asp Leu Arg Ala Tyr Thr Gly

165 170 175

Tyr Phe His Ser Asn Asp Glu Leu Leu Asn Arg Ile Trp Tyr Ala Gly

180 185 190

Ala Tyr Thr Leu Gln Leu Cys Ser Ile Asp Pro Thr Thr Gly Asp Ala

195 200 205

Leu Val Gly Leu Gly Val Ile Thr Ser Ser Glu Thr Ile Ser Leu Pro

210 215 220

Gln Thr Asp Lys Trp Trp Thr Asn Tyr Thr Ile Thr Asn Gly Ser Ser

225 230 235 240

Thr Leu Thr Asp Gly Ala Lys Arg Asp Arg Leu Val Trp Pro Gly Asp

245 250 255

Met Ser Ile Ala Leu Glu Ser Val Ala Val Ser Thr Glu Asp Leu Tyr

260 265 270

Ser Val Arg Thr Ala Leu Glu Ser Leu Tyr Ala Leu Gln Lys Pro Asp

275 280 285

Gly Arg Leu Pro Tyr Ala Gly Lys Pro Phe Phe Asp Thr Val Ser Phe

290 295 300

Thr Tyr His Leu His Ser Leu Val Gly Ala Ala Ser Tyr Tyr Gln Tyr

305 310 315 320

Thr Gly Asp Arg Ala Trp Leu Thr Arg Tyr Trp Gly Gln Tyr Lys Lys

325 330 335

Gly Val Gln Trp Ala Leu Ser Ser Val Asp Ser Thr Gly Leu Ala Asn

340 345 350

Ile Thr Ala Ser Ala Asp Trp Leu Arg Phe Gly Met Gly Ala His Asn

355 360 365

Ile Glu Ala Asn Ala Ile Leu Tyr Tyr Val Leu Asn Asp Ala Ile Ser

370 375 380

Leu Ala Gln Thr Leu Asn Asp Asn Ala Pro Ile Arg Asn Trp Thr Thr

385 390 395 400

Thr Ala Ala Arg Ile Lys Thr Val Ala Asn Glu Leu Leu Trp Asp Asp

405 410 415

Lys Asn Gly Leu Tyr Thr Asp Asn Glu Thr Thr Thr Leu His Pro Gln

420 425 430

Asp Gly Asn Ser Trp Ala Val Lys Ala Asn Leu Thr Leu Ser Ala Asn

435 440 445

Gln Ser Ala Ile Val Ser Glu Ser Leu Ala Ala Arg Trp Gly Pro Tyr

450 455 460

Gly Ala Pro Ala Pro Glu Ala Gly Ala Thr Val Ser Pro Phe Ile Gly

465 470 475 480

Gly Phe Glu Leu Gln Ala His Tyr Gln Ala Gly Gln Pro Asp Arg Ala

485 490 495

Leu Asp Leu Leu Arg Leu Gln Trp Gly Phe Met Leu Asp Asp Pro Arg

500 505 510

Met Thr Asn Ser Thr Phe Ile Glu Gly Tyr Ser Thr Asp Gly Ser Leu

515 520 525

Ala Tyr Ala Pro Tyr Thr Asn Thr Pro Arg Val Ser His Ala His Gly

530 535 540

Trp Ala Thr Gly Pro Thr Ser Ala Leu Thr Ile Tyr Thr Ala Gly Leu

545 550 555 560

Arg Val Thr Gly Pro Ala Gly Ala Thr Trp Leu Tyr Lys Pro Gln Pro

565 570 575

Gly Asn Leu Thr Gln Val Glu Ala Gly Phe Ser Thr Arg Leu Gly Ser

580 585 590

Phe Ala Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Gly Arg Tyr Gln Glu Leu Ser

595 600 605

Phe Ser Thr Pro Asn Gly Thr Thr Gly Ser Val Glu Leu Gly Asp Val

610 615 620

Ser Gly Gln Leu Val Ser Asp Arg Gly Val Lys Val Gln Leu Val Gly

625 630 635 640

Gly Lys Ala Ser Gly Leu Gln Gly Gly Lys Trp Lys Leu Ser Asn Asn

645 650 655

Claims

1.黑曲霉(Aspergilus niger)，于2018年04月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO：M 2018240。

2.α-L-鼠李糖苷酶质粒，其特征在于：所述α-L-鼠李糖苷酶来源于黑曲霉，其中，所述黑曲霉(Aspergilus niger)于2018年04月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO：M 2018240；

所述α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。

3.α-L-鼠李糖苷酶重组菌，其特征在于：所述α-L-鼠李糖苷酶来源于黑曲霉，其中，所述黑曲霉(Aspergilus niger)于2018年04月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO：M 2018240；

所述α-L-鼠李糖苷酶核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示；

所述重组菌包括毕赤酵母。

4.如权利要求3所述的α-L-鼠李糖苷酶重组菌，其特征在于：所述α-L-鼠李糖苷酶重组菌中含有权利要求2所述的α-L-鼠李糖苷酶质粒，所述毕赤酵母包括毕赤酵母GS115。

5.α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，其特征在于：包括，

构建重组菌：构建权利要求3～4中任一所述的重组菌；

发酵：重组菌发酵产α-L-鼠李糖苷酶。

6.如权利要求5所述的α-L-鼠李糖苷酶的制备方法，其特征在于：所述构建重组菌，包括，

以黑曲霉的mRNA反转录得到的cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，得到α-L-鼠李糖苷酶基因rha，纯化PCR扩增产物，并与载体pMD19-T连接，然后将连接产物转入大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布于氨苄青霉素抗性平板，获得阳性克隆，提取质粒获得重组质粒pMD19-T-rha，其中，所述黑曲霉(Aspergilus niger)于2018年04月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCC NO：M 2018240；

以重组质粒pMD19-T-rha为模板进行PCR扩增，将回收的扩增产物与经EcoR I、Avr II酶双酶切后的质粒pPIC9K进行同源重组，将得到的质粒导入大肠杆菌 JM109感受态细胞，菌落PCR挑取阳性克隆，获得表达载体pPIC9K-rha。