CN104531733A - 一种α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆和表达方法，该编码α-L-鼠李糖苷酶的基因从黑曲霉中获得，在毕赤酵母GS115中进行表达，具体是以黑曲霉总RNA为模板，通过RT-PCR和RACE技术克隆α-L-鼠李糖苷酶的cDNA，采用pPIC9K作为表达载体在毕赤酵母GS115中进行分泌表达。本发明首次公开了毕赤酵母GS115基因工程菌，该菌株在甲醇的诱导下分泌的产物可以水解柚皮苷、橘皮苷、杨梅苷、pNPR及芸香苷。本发明为微生物发酵法生产α-L-鼠李糖苷酶提供了积极的指导作用，可以在较短的时间内获得大量的α-L-鼠李糖苷酶，以满足工业化生产的需要。

Description

一种α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及应用

技术领域

本发明属于基因工程和酶工程的技术领域，尤其涉及一种α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及应用。

背景技术

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC 3.2.1.40))属于转化糖苷水解酶类，能够专一、高效地水解许多糖苷类物质如柚皮苷(naringin)、芦丁(rutin)、橘皮苷(hesperidin)等末端的α-L-鼠李糖基。CAZy(http://www.cazy.org/)数据库中糖苷水解酶的分类依据是氨基酸序列的相似性，α-L-鼠李糖苷酶包含在四个糖苷水解酶家族(glycoside hydrolase family，GH)，分别是GH13、GH28、GH78和GH106。

α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橘皮苷酶的主要活性成分，是去除柑桔类果汁苦味的有效物质。果汁中的苦味物质主要是柚皮苷，该苦味物质被柚苷酶水解的过程共有两步反应，首先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮苷中的α-1,2糖苷键生成普鲁宁，接着在β-D-葡萄糖苷酶的作用下，脱去D-葡萄糖生成柚皮素。在果汁酶法脱苦工艺中，α-L-鼠李糖苷酶参与的第一步反应是脱苦的关键，仅有柚苷酶的另一组份β-D-葡萄糖苷酶存在时，不能与苦味物质柚皮苷发生水解反应。有研究报道，对琯溪蜜柚果汁进行脱苦时，向果汁中以10U/mL加酶量添加α-L-鼠李糖苷酶，置于40℃条件下处理1h，果汁的苦味就能降低到阈值以下。除了在饮料行业中用来去除柑橘类果汁的苦味，在其他行业也具有很多潜在的应用价值，如通过水解柚皮苷生产L-鼠李糖和普鲁宁，降低这类化合物的生产成本；增加酿造酒的香味，改善葡萄汁和饮料的香气成分；切除一些糖苷类药物原料末端的L-鼠李糖等。

由于α-L-鼠李糖苷酶的重要应用价值，越来越多的国内外学者致力于该酶的研究开发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种克隆和表达α-L-鼠李糖苷酶的方法，通过从黑曲霉JMU-TS528中克隆一种α-L-鼠李糖苷酶基因并导入至毕赤酵母GS115中，以得到一种高效表达α-L-鼠李糖苷酶的基因工程菌。

为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：

一种编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。该基因包含2062bp，最大开放阅读框的碱基数为1968，终止密码子为TAA，3’非编码区共有94bp，登录号为KC750908.1。

一种α-L-鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。该酶由655个氨基酸残基组成，其分子量是70.1kDa。

一种含有编码α-L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒。

作为实施例的优选方式，所述的α-L-鼠李糖苷酶基因连接在pPIC9K上。

一种含有重组质粒的基因工程菌。

作为实施例的优选方式，所述的基因工程菌为生产α-L-鼠李糖苷酶的毕赤酵母GS115。

一种编码α-L-鼠李糖苷酶的基因的克隆及表达方法，所述方法为将所述α-L-鼠李糖苷酶的基因进行真核表达。

作为实施例的优选方式，所述方法包括以下步骤：

步骤一、将所述α-L-鼠李糖苷酶的基因与表达载体pPIC9K连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α中，得到重组表达载体，挑取阳性克隆，测序；提取重组表达载体，经SalI线性化后，采用电转化法将其导入毕赤酵母GS115中，筛选出阳性克隆进行诱导表达；

步骤二、将含有重组表达载体的毕赤酵母GS115接种在YPD培养基中进行活化后，转入BMGY培养基中继续活化，收集OD600为2.0-3.0的菌体，转入到BMMY培养基中，置于30℃，220rpm摇床进行α-L-鼠李糖苷酶的诱导表达；每隔24h按照体积比0.5％向诱导的菌液中补加无菌的甲醇；同时将含有空白载体pPIC9K的菌株作为空白对照；通过电泳分析，判断有无特异性条带出现。

一种所述的基因工程菌所制备的α-L-鼠李糖苷酶在食品医药行业的应用，包括以下应用领域：1)制备普鲁宁；2)果汁脱苦；3)改善葡萄汁和饮料的香气成分；4)增加酿造酒的香味；5)提高果汁的抗氧化性。

本发明采用上述技术方案后，具有以下有益效果：

1.从黑曲霉JMU-TS528中获取了编码α-L-鼠李糖苷酶的基因；

2.涉及到α-L-鼠李糖苷酶基因的cDNA序列及克隆、与之对应的蛋白质序列及其在毕赤酵母GS115中的表达，并且该重组酶可以水解柚皮苷、橘皮苷、pNPR、杨梅苷和芸香苷等多种物质，扩大了该酶的在工业中应用范围。

3.该方法可以在短时间内获得大量的且不含其他酶酶活性的α-L-鼠李糖苷酶，降低了α-L-鼠李糖苷酶的生产成本。

附图说明

图1黑曲霉JMU-TS528菌株α-L-鼠李糖苷酶三级结构预测图；

图2为毕赤酵母工程菌GS115诱导产物电泳图，泳道1为marker，泳道泳道2为毕赤酵母GS115菌株的产物，泳道3为毕赤酵母GS115菌株经甲醇诱导后的产物，泳道4为毕赤酵母工程菌GS115未经诱导的产物，泳道5为毕赤酵母工程菌GS115经甲醇诱导后的产物；

图3为重组α-L-鼠李糖苷酶的最适作用pH曲线图；

图4为重组α-L-鼠李糖苷酶的pH稳定性曲线图；

图5为重组α-L-鼠李糖苷酶的最适作用温度曲线图；

图6为重组α-L-鼠李糖苷酶的温度稳定性曲线图。

具体实施方式

实施例一、基因的克隆及表达

1.主要试剂

DNA聚合酶、T₄DNA连接酶、DNA marker、克隆载体pMD-18T、限制性内切酶(EcoRI、XhoI和BlnI)、感受态细胞制备试剂盒均购于大连宝生物公司；PCR产物回收试剂盒、酶解产物回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒等购自上海生工；RNA提取试剂盒、cDNA逆转录试剂盒购于北京全式金。PCR引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成；IPTG、氨苄青霉素、十二烷基硫酸钠(SDS)购自上海生工；其它常规试剂均为化学分析纯。

2.质粒和菌株

黑曲霉JMU-TS528、大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、和pPIC9K为本实验室保存。

3.方法

3.1基因的克隆与测序

从黑曲霉JMU-TS528中获取总RNA，逆转录成cDNA，通过第一引物对进行PCR扩增，PCR反应体系如下(20.0μL)：依次加入灭菌后的超纯水15.7μL、10×PCR Buffer 2.0μL、dNTP(10mmol/L each)0.4μL、上游引物(10μmol/L)0.3μL、下游引物(10μmol/L)0.3μL、模板cDNA 1.0μL、Tap酶(2.5U/μL)0.3μL。PCR反应条件：94℃预变性4min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸50s，30个循环，72℃后延伸10min。通过1.0％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增的产物，并进行割胶回收，标记为L-rha-1。

所述的第一引物对：

上游引物(SEQ ID NO:3)为：5’-AATGACAACGCACCCATC-3’；

下游引物(SEQ ID NO:4)为：5’-CATCCAGCATGAATCCCCAC-3’。

以L-rha-1作为模板，通过第二引物对及第三引物对分别进行PCR扩增，回收产物。第二引物对进行扩增的体系(50.0μL)是灭菌后的超纯水33.0μL、5×Prime STAR Buffer 10.0μL、dNTP Mixture(2.5mmol/L each)4.0μL、上游引物(10μmol/L)0.75μL、下游引物(10μmol/L)0.75μL、模板1.0μL、Prime STAR^HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL；条件是94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，32个循环，72℃后延伸10min。第三引物对扩增的体系(50.0μL)是H₂O(灭菌后的超纯水)33.0μL、5×Prime STAR Buffer 10.0μL、dNTP Mixture(2.5mmol/Leach)4.0μL、3race F1(10μmol/L)0.75μL、3’RACE R2(10μmol/L)0.75μL、模板1.0μL、Prime STAR^HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL；条件是94℃预变性4min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸60s，32个循环，72℃后延伸10min。两对引物分别扩增后的产物经切胶回收，分别标记为L-rha-2和L-rha-3，并保存。

所述的第二引物对：

上游引物(SEQ ID NO:5)为：5’-ATGTGGTCTTCCTGGCTGCTGT-3’；

下游引物(SEQ ID NO:6)为：5’-AGCGGGCAGCGAGCGATTCAG-3’；

所述的第三引物对：

上游引物(SEQ ID NO:7)为：5’-ACAACGAGACCACCACCCTG-3’；

下游引物(SEQ ID NO:8)为：5’-GACCACGCGTATCGATGTCGAC-3’；

再以上述的三段回收产物为模板，进行重叠PCR扩增(RACE技术)，得到α-L-鼠李糖苷酶的cDNA，将其连接到pMD-18T载体，导入大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆，测序。重叠PCR的体系是灭菌后的超纯水33.0μL、5×Prime STAR Buffer 10.0μL、dNTP Mixture(2.5mmol/L each)4.0μL、上游引物(10μmol/L)0.75μL、下游引物(10μmol/L)0.75μL、L-rha-2片段4.4μL、L-rha-3片段2.3μL、Prime STAR^HS DNA Polymerase(2.5U/μL)0.5μL；条件是94℃预变性4min，94℃变性1min，57℃退火1min，72℃延伸2.5min，35个循环，72℃后延伸10min。

3.2表达载体的构建

提取重组克隆载体作为模板，采用自己设计的特异性第四引物对进行PCR扩增，引物如下：

上游引物(SEQ ID NO:9)为：5’-CCGGAATTCGTACCCTACGAGGAGTACATTCTAG-3’

下游引物(SEQ ID NO:10)为：5’-CGCCCTAGGTTACACATTCAACCGCCATTTC-3’

回收扩增产物，与表达载体pPIC9K进行连接，将连接产物导入E.coli DH5 α感受态细胞，利用氨苄青霉素的抗性平板筛选阳性转化子，通过菌液PCR进行阳性转化子的验证，然后提取阳性转化子的质粒，再用双酶切法和PCR的方法检验构建的重组质粒pPIC9K-rha。

3.3α-L-鼠李糖苷酶的诱导表达

利用“同源建模”法预测黑曲霉JMU-TS528中α-L-鼠李糖苷酶的结构，结果如图1所示。

提取重组表达质粒，经SalI线性化后，采用电转化法将其导入毕赤酵母GS115中，筛选阳性克隆。接种在YPD培养基中进行活化后，转入BMGY培养基中继续活化，收集OD600为2.0-3.0的菌体，转入到BMMY培养基中，置于30℃，220rpm摇床进行α-L-鼠李糖苷酶的诱导表达。每隔24h按照体积比0.5％向诱导的菌液中补加无菌的甲醇。同时将含有空白载体pPIC9K的菌株作为空白对照，并对表达产物进行电泳分析，结果如图2所示。

实施例二、重组α-L-鼠李糖苷酶的酶学性质

1.重组α-L-鼠李糖苷酶最适pH值及pH值稳定性的测定

最适pH：将重组酶与底物柚皮苷混合后，分别置于pH为3、4、5、6、7和8的反应体系，于50℃进行酶反应，空白组以100℃失活的重组酶进行同样条件的酶反应，按照酶活测定方法进行酶活的检测，结果如图3所示。结果表明该重组α-L-鼠李糖苷酶以柚皮苷为底物时，最适作用pH为6.0。

pH稳定性：将重组酶在pH为3、4、5、6、7和8的条件下于层析柜4℃放置24h，再进行酶活的检测，结果如图4所示。结果表明该重组酶酶活的在pH3-8范围内有良好的稳定性。

2.重组α-L-鼠李糖苷酶最适温度及温度稳定性的测定

最适温度：向底物柚皮苷中加入重组酶液，混匀后，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃的温度下进行水解反应，空白组以100℃失活的重组酶进行同样条件的酶反应，按照酶活测定方法进行酶活的检测，结果如图5所示。结果表明，该重组α-L-鼠李糖苷酶以柚皮苷为底物时，最适作用温度为60℃。

温度稳定性：将重组酶分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃条件下处理30min、60min、90min和120min，然后取处理后的酶液进行酶活的检测，结果如图6所示。结果表明，在不大于60℃的条件下保温1h后，酶活变化不大，相对酶活保持在93％以上，保温2h后酶活达到初始酶活的89.5％以上。当其在60℃水浴处理1h后，相对酶活为初始酶活的73％，在60℃处理2h后，酶的活力迅速下降到初始酶活的48％。

3.重组α-L-鼠李糖苷酶底物特异性的测定

将同一重组酶，在同一反应体系和条件与不同的底物进行酶反应，底物分别是杨梅苷、柚皮苷、橘皮苷、芸香苷以及pNPR。反应结束后，采用HPLC对底物的分解和产物的生成情况进行检测，结果如表1所述。结果表明，该重组酶能够分解底物柚皮苷、橘皮苷、芸香苷、杨梅苷以及pNPR，对橘皮苷和芦丁的转化率大于柚皮苷、pNPR和杨梅苷。

表1 重组酶α-L-鼠李糖苷酶的底物特异性

4.重组α-L-鼠李糖苷酶的动力学研究

配制不同浓度的柚皮苷溶液，将同一酶活力的重组酶酶液与不同浓度的柚皮苷溶液进行水解反应，利用高效液相色谱法对柚皮苷的水解情况以及普鲁宁的生成情况进行检测，从而测得重组α-L-鼠李糖苷酶的酶活力。然后绘制重组α-L-鼠李糖苷酶的Lineweaver-Burk双倒数曲线图，图的横坐标是底物浓度的倒数，纵坐标是酶反应的速率，通过该图计算出重组α-L-鼠李糖苷酶的Km和Vmax。结果表明，在以柚皮苷为底物时，重组α-L-鼠李糖苷酶的Km为0.04mM，Vmax为811.93U/mg。

5.金属离子对重组α-L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷的影响

将同一重组α-L-鼠李糖苷酶等量分装，然后与不同金属离子混合，置于30℃水浴处理1h，通过高效液相色谱测定酶活力来研究不同金属离子对重组α-L-鼠李糖苷酶的影响，结果如表2所述。选用的金属离子有MgCl₂、ZnSO₄、CaCl₂、CuCl₂、CoCl₂、MnCl₂、NiSO₄、FeCl₂、NaCl、KCl和FeCl₃，它们的终浓度为1mM、10mM和100mM。

结果表明，1mM、10mM和100mM的Mg²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Ni²⁺和K⁺能够提高重组α-L-鼠李糖苷酶酶活，特别是100mM的Zn²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺对该重组酶酶活有强烈的促进作用。Fe³⁺(10mM和100mM)、Na⁺(1mM和10mM)和Mn²⁺(1mM)对该酶有抑制作用，Fe³⁺对该重组酶的抑制作用随着浓度的增加而增强，当重组酶在30℃条件下经100mM的FeCl₃处理1h后，酶活仅为初始酶活的9.35％，经100mM的FeCl₂处理后，重组酶完全失活。

表2 金属离子对重组α-L-鼠李糖苷酶的影响

6.效应物对重组α-L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷的影响

将同一重组α-L-鼠李糖苷酶等量分装后，与不同效应物混匀，于30℃保温处理1h，然后采用高效液相色谱测定酶活力来研究不同效应物对重组α-L-鼠李糖苷酶的影响，结果如表3所述。选用的效应物中葡萄糖、L-鼠李糖、SDS、DTT和EDTA的终浓度分别是1mM和10mM，β-巯基乙醇的终浓度为1％和0.1％(v/v)。

结果表明，1mM和10mM的葡萄糖、L-鼠李糖、EDTA、DTT对该酶具有抑制作用，SDS在1mM的浓度下对该酶酶活没有明显的影响，当其浓度上升到10mM时对重组α-L-鼠李糖苷酶酶活有较强烈的抑制作用。

表3 不同效应物对重组α-L-鼠李糖苷酶的影响

综上所述，本发明首次公开了毕赤酵母GS115基因工程菌，该菌株在甲醇的诱导下分泌的产物可以水解柚皮苷、橘皮苷、杨梅苷、pNPR及芸香苷。本发明为微生物发酵法生产α-L-鼠李糖苷酶提供了积极的指导作用，可以在较短的时间内获得大量的α-L-鼠李糖苷酶，以满足工业化生产的需要。

本领域的普通技术人员能从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种如权利要求1所述的编码α-L-鼠李糖苷酶的基因所编码的α-L-鼠李糖苷酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种含有权利要求1所述的编码α-L-鼠李糖苷酶基因的重组质粒。

4.一种如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：所述的α-L-鼠李糖苷酶基因连接在pPIC9K上。

5.一种含有权利要求3或4所述的重组质粒的基因工程菌。

6.一种如权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于：所述的基因工程菌为生产α-L-鼠李糖苷酶的毕赤酵母GS115。

7.一种如权利要求1所述的编码α-L-鼠李糖苷酶的基因的克隆及表达方法，其特征在于：所述方法为将所述α-L-鼠李糖苷酶的基因进行真核表达。

8.如权利要求7所述的一种编码α-L-鼠李糖苷酶的基因的克隆及表达方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一、将所述α-L-鼠李糖苷酶的基因与表达载体pPIC9K连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α中，得到重组表达载体，挑取阳性克隆，测序；提取重组表达载体，经SalI线性化后，采用电转化法将其导入毕赤酵母GS115中，筛选出阳性克隆进行诱导表达；

步骤二、将含有重组表达载体的毕赤酵母GS115接种在YPD培养基中进行活化后，转入BMGY培养基中继续活化，收集OD600为2.0-3.0的菌体，转入到BMMY培养基中，置于30℃，220 rpm摇床进行α-L-鼠李糖苷酶的诱导表达；每隔24 h按照体积比0.5%向诱导的菌液中补加无菌的甲醇；同时将含有空白载体pPIC9K的菌株作为空白对照；通过电泳分析，判断有无特异性条带出现。

9.一种如权利要求5或6所述的基因工程菌所制备的α-L-鼠李糖苷酶在食品医药行业的应用，其特征在于：包括以下应用领域：1）制备普鲁宁；2）果汁脱苦；3）改善葡萄汁和饮料的香气成分；4）增加酿造酒的香味；5）提高果汁的抗氧化性。