CN105274153B - 一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法 - Google Patents

一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法 Download PDF

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本发明公开了一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法,属于生物工程技术领域。本发明方法利用黑曲霉来源的酸诱导的启动子,在土曲霉中引入黑曲霉的侧呼吸链蛋白AOX,增强胞内NAD+库的供给,进而增强糖酵解途径,从而提高衣康酸的产量。本发明方法得到的重组土曲霉菌株,其衣康酸产量提高了20%左右,达到60g/L。本发明为衣康酸的生产提供了新思路。

Description

一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法
技术领域
本发明涉及一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
衣康酸是一种五碳二元羧酸,含有一个亚甲基,这个不饱和键赋予衣康酸行使聚合反应的功能,因此衣康酸被广泛应用于树脂和合成纤维的生产,此外,衣康酸作为生物活性成分可以应用于农业和医药行业,作为酶法转化的初始化合物用于合成多功能的平台化合物。
目前衣康酸的生产主要依赖于利用土曲霉进行深层有氧发酵。土曲霉产衣康酸的代谢途径为葡萄糖通过糖酵解途径和TCA循环合成柠檬酸,并进而合成顺乌头酸,顺乌头酸进入细胞质在乌头酸脱羧酶的催化下合成衣康酸。糖酵解途径和TCA循环的调控严谨,而乌头酸脱羧酶的活性在衣康酸发酵中保持很高的水平,表达单一的蛋白难以达到增强代谢途径的目的,但有文献报道表达解除反馈抑制的截短的pfkA蛋白,可以提高衣康酸产量。
衣康酸发酵需要很高的溶氧,随着溶氧的增加,衣康酸产量增加。这和黑曲霉产柠檬酸需要高溶氧相似。在黑曲霉中由于糖酵解途径的加强,合成过量的NADH,如果通过氧化磷酸化途径使NADH通过产生ATP来形成NAD+,会造成ATP的过剩。土曲霉合成衣康酸的途径与黑曲霉产柠檬酸相比,仅增加了2步反应,且都是不需要能量的反应,因此,衣康酸发酵同样面临NAD+库的补充和ATP形成解偶联的问题。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供了一种利用酸诱导的启动子在产酸阶段启动AOX表达,进而提高土曲霉衣康酸产量的方法。由于黑曲霉通过侧呼吸链蛋白AOX来行使NADH到NAD+的转变,不产生能量,借鉴这一原理,本发明实现AOX在土曲霉中的表达,以实现NAD+库的补充。然而,在菌体生长需要ATP供能的阶段需要AOX蛋白表达沉默,因此本发明进一步利用酸诱导的启动子Pgas,使AOX仅在产酸阶段表达。
本发明的第一个目的是一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法,所述方法是将黑曲霉的AOX基因整合到土曲霉基因组上得到重组土曲霉菌株,利用重组菌发酵生产衣康酸;所述AOX基因的表达受酸诱导型启动子的调控,在酸性条件下诱导表达。
所述AOX基因是a)或者b):
a)编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的序列;
b)具有使NADH在与ATP产生解偶联的条件下生成NAD+的功能,其编码的氨基酸序列是在a)的基础上发生1个或多个氨基酸的取代、缺失、插入而得到的。
在本发明的一种实施方式中,所述AOX基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中,所述土曲霉菌株是Aspergillus terreus HAT418,或者购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的编号为CICC 2433、CICC 40205或CICC40832的土曲霉菌株。
在本发明的一种实施方式中,所述酸诱导型启动子是Pgas,其核苷酸序列是SEQID NO.3所示的序列。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵是在35℃、250r/min下发酵96h。
在本发明的一种实施方式中,所述发酵使用的发酵培养基,每L含有:180g葡萄糖,0.1g KH2PO4,3g NH4NO3,1g MgSO4·7H2O,5g CaCl2·2H2O,0.00167g FeCl3·6H2O,0.008gZnSO4·7H2O和0.015g CuSO4·7H2O;培养基pH 3.1。
本发明的第二个目的是提供一种重组土曲霉菌株。
所述重组土曲霉菌株基因组上含有AOX基因,且AOX基因的表达受到酸诱导型启动子Pgas的调控;所述AOX基因在酸性条件下诱导表达。
在本发明的一种实施方式中,所述Pgas启动子的核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列;所述AOX基因编码的的氨基酸序列是SEQ ID NO.2所示的序列。
在本发明的一种实施方式中,所述重组土曲霉菌株还整合表达了潮霉素抗性基因,以便转化子的筛选。
本发明的第三个目的是提供一种所述重组土曲霉菌株的构建方法,包括:
(1)构建AOX蛋白表达框Pgas-AOX-trp,所述AOX蛋白表达框包含Pgas启动子、AOX蛋白编码基因和trp终止子;构建抗性基因表达框gpdA-hph-trp,包含元件gpdA启动子、hph基因和trp终止子,便于阳性克隆子的筛选;
(2)将AOX蛋白表达框和抗性基因表达框一起转化到土曲霉中,得到2个表达框同时整合到土曲霉基因组中的重组土曲霉。
在本发明的一种实施方式中,所述构建方法中,步骤(1)具体是:将trp终止子序列通过Pst I和Hin dIII酶切,连接到pUC19上,得到pUC-trp载体;将Pgas启动子序列通过EcoRI和Kpn I酶切,连接到pUC-trp载体上,得到pUC-Pgas-trp载体;再将AOX序列用Kpn I和Pst I双酶切,片段连接到pUC-Pgas-trp载体上,得到pUC-Pgas-AOX-trp表达框;抗性基因表达框以pAN7-1为模板克隆得到。
在本发明的一种实施方式中,所述构建方法中,步骤(2)具体是:将AOX蛋白表达框和抗性基因表达框经PEG介导法转入土曲霉原生质体中,在潮霉素抗性的高渗软琼脂PDA平板上培养得到阳性克隆,再将经培养4-7天的阳性克隆转移至含1g/L潮霉素的平板上进一步培养得到阳性克隆,验证正确的即为重组土曲霉。
在本发明的一种实施方式中,所述trp终止子的序列如SEQ ID NO.6所示。
在本发明的一种实施方式中,所述gpdA启动子的序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中,所述hph的序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第四个目的是提供一种AOX蛋白表达框,所述AOX蛋白表达框包含Pgas启动子、AOX蛋白编码基因和trp终止子,按照Pgas-AOX-trp的顺序排布。
本发明还要求保护含有所述AOX蛋白表达框的菌株以及所述AOX蛋白表达框在提高衣康酸产量方面的应用。
本发明的有益效果:
本发明利用酸诱导型启动子启动AOX蛋白在土曲霉中表达,通过增强胞内NAD+库的供给,增强糖酵解途径,从而提高衣康酸的产量。本发明方法对产衣康酸的土曲霉菌株具有普遍适用性,可使土曲霉发酵生产衣康酸产量提高近20%,利用Aspergillus terreusHAT418作为宿主,衣康酸产量提高了20%、产量达到60g/L以上。
附图说明
图1所示为土曲霉中衣康酸的产量;■为AOX转化子的衣康酸产量,□为野生型的衣康酸产量,▲为AOX转化子的葡萄糖浓度,△为野生型的葡萄糖浓度。
具体实施方式
实施例1:黑曲霉RNA的提取
将黑曲霉孢子接种到柠檬酸发酵培养基中,35℃250r/min培养48h,用mirocloth收集菌球,用无菌超纯水洗涤3遍,滤干水分,迅速液氮冷冻。用液氮研磨的方法将组织充分磨碎,采用QIAGEN公司RNeasy Plant Mini Kit提取黑曲霉总RNA。用TAKARA公司PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser将RNA反转录成cDNA。
实施例2:黑曲霉基因组DNA的提取
将黑曲霉孢子接种到ME液体培养基(3%麦芽提取物,0.5%胰蛋白胨)中,35℃250r/min培养48h,用mirocloth收集菌球,用无菌超纯水洗涤3遍,滤干水分,迅速液氮冷冻。用液氮研磨的方法将组织充分磨碎,采用QIAGEN公司DNeasy Plant Mini Kit提取丝状真菌基因组。
实施例3:AOX蛋白表达框的构建
利用引物trp-F(序列如SEQ ID NO.7所示)和trp-R(序列如SEQ ID NO.8所示)以pAN7-1为模板扩增trp终止子,序列上下游含Pst I和Hin dIII位点,连接到pMD19上测序,用这两个限制性内切酶酶切,将该序列连接到同样酶切的pUC19上,得到pUC19-trp。利用引物Pgas-F(序列如SEQ ID NO.9所示)和Pgas-R(序列如SEQ ID NO.10所示)从黑曲霉基因组DNA中扩增Pgas启动子,序列两头含Eco RI和Kpn I酶切位点,酶切,将该序列连接到同样酶切的pUC19-trp,得到pUC-Pgas-trp。利用引物AOX-F(序列如SEQ ID NO.11所示)和AOX-R(序列如SEQ ID NO.12所示)从黑曲霉cDNA中扩增AOX基因,基因两头含Kpn I和Pst I酶切位点,连接到同样酶切的pUC-Pgas-trp,形成gas-AOX-trp表达框。潮霉素抗性表达框通过引物gpd-F(序列如SEQ ID NO.13所示)和Ttrp-R-2(序列如SEQ ID NO.14所示)从质粒pAN7-1中扩增得到。
用到的引物如下:
trp-F:ctgcagGATCCACTTAAACGTTACTGAAATC
trp-R:aagcttCTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG
Pgas-F:gaattcCTGCTCTCTCTCTGCTCTCTTTCT
Pgas-R:ggtaccGTGAGGAGGTGAACGAAAGAAGAC
AOX-F:ggtaccATGAACTCGTTAACAGCC
AOX-R:ctgcagTCAGATCACCTCCTCCC
gpd-F:CAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG
Ttrp-R-2:CTCGAGTGGAGATGTGGAGTGG
实施例4:土曲霉原生质体的制备和转化
按3×105/ml的浓度接种土曲霉孢子至PDA液体培养基,30℃、200r/min培养过夜。用mirocloth收集菌球,并用无菌水清洗菌球。称取一定量的Caylase-4,并用渗透压稳定剂KMC溶解,用无菌滤膜过滤除菌。称取一定量菌球,加入到酶解液中,37℃、100r/min震荡培养约3h直至菌丝完全消化为原生质体,4℃、1000rpm离心10min,弃上清,加入相同体积预冷的STC,4℃、1000rpm离心10min,弃上清,洗涤2次,加入100μL STC,混匀。100μL土曲霉原生质体中加入10μL线性化核酸片段和330μL PEG缓冲液,冰上放置20min,加入2mL PEG,室温放置10min,依次加入4mL STC和4mL于48℃预热的上层培养基,铺板于含有1g/L潮霉素的下层培养基上。平板在35℃倒置培养4-7天,直至出现菌落,挑取单菌落继代。每个菌落进行3次单孢子继代。
实施例5:土曲霉转化子产量的验证
土曲霉接种于PDA培养基上35℃生孢培养5-7天,刮取孢子,以107/mL的接种量接种于种子培养基,37℃、250r/min培养16h,以1/10接种量转接发酵培养基,35℃、250r/min发酵96h。发酵液离心去除菌体,稀释10倍,用滤膜过滤后用HPLC检测衣康酸含量。
衣康酸酸的含量用高效液相色谱(HPLC)进行检测。仪器:Agilent 1200高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、示差检测器和工作站);色谱条件:HPX87H色谱柱(4.6×250mm,5μm),流动相为5mM硫酸溶液,流量为0.6mL/min,进样量为10μL,柱温为30℃,210nm波长紫外光检测。
结果表明,与野生型土曲霉菌株相比,本发明的重组土曲霉菌株的衣康酸产量提高了20%左右,产量达到60g/L。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Figure IDA0000853041350000011
Figure IDA0000853041350000021
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Figure IDA0000853041350000071
Figure IDA0000853041350000091
Figure IDA0000853041350000101

Claims (6)

1.一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法,其特征在于,所述方法是将黑曲霉的AOX基因整合到土曲霉基因组上得到重组土曲霉菌株,利用重组菌发酵生产衣康酸;所述AOX基因的表达受酸诱导型启动子的调控,在酸性条件下诱导表达;
所述重组土曲霉菌株的构建方法是:(1)构建AOX蛋白表达框Pgas-AOX-trp,所述AOX蛋白表达框包含Pgas启动子、AOX蛋白编码基因和trp终止子;构建抗性基因表达框gpdA-hph-trp,包含元件gpdA启动子、hph基因和trp终止子;(2)将AOX蛋白表达框和抗性基因表达框一起转化到土曲霉中,得到2个表达框同时整合到土曲霉基因组中的重组土曲霉。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述AOX基因是编码的氨基酸序列如SEQID NO.2所示的序列。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述酸诱导型启动子为Pgas,核苷酸序列是SEQ ID NO.3所示的序列。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述发酵是在35oC 250r/min下发酵96h。
5.一种衣康酸产量提高的重组土曲霉菌株,其特征在于,所述重组土曲霉菌株基因组上含有AOX基因,且AOX基因的表达受到酸诱导型启动子Pgas的调控;所述AOX基因在酸性条件下诱导表达;
所述重组土曲霉菌株的构建方法是:(1)构建AOX蛋白表达框Pgas-AOX-trp,所述AOX蛋白表达框包含Pgas启动子、AOX蛋白编码基因和trp终止子;构建抗性基因表达框gpdA-hph-trp,包含元件gpdA启动子、hph基因和trp终止子;(2)将AOX蛋白表达框和抗性基因表达框一起转化到土曲霉中,得到2个表达框同时整合到土曲霉基因组中的重组土曲霉。
6.权利要求1-4任一所述的一种提高土曲霉发酵生产衣康酸产量的方法或权利要求5所述的一种衣康酸产量提高的重组土曲霉菌株在提高衣康酸产量方面的应用。
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