CN106978407B - 一种β-葡萄糖醛酸苷酶及其基因与应用 - Google Patents

一种β-葡萄糖醛酸苷酶及其基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种β‑葡萄糖醛酸苷酶及其基因、表达载体和转化体及在制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸(GAMG)中的应用。该β‑葡萄糖醛酸苷酶的基因序列如SEQ ID No.1所示。将该基因与表达载体连接后，转化进毕赤酵母中，获得毕赤酵母工程菌。将该工程菌表达的β‑葡萄糖醛酸苷酶重组酶用于GAMG的生产时，发现该酶具有底物特异性高，无副产物甘草次酸的生成，GAMG的产率为95％左右，显示了该β‑葡萄糖醛酸苷酶及其基因在生产GAMG中的良好应用前景。

Description

一种β-葡萄糖醛酸苷酶及其基因与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种β-葡萄糖醛酸苷酶及其基因和应用。
背景技术
β-葡萄糖醛酸苷酶(β-glucuronidase)是一类能催化β-葡萄糖醛酸酸苷水解的糖苷酶，广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。β-葡萄糖醛酸苷酶最早被发现存在于人体和动物的各种组织和体液中，尤其在肝、脾和肾上腺中的含量较高，早期人们发现该酶与肿瘤的侵袭和转移有关，目前通过检测该酶在特定部位的水平已成为肿瘤诊断治疗的一种重要手段。细菌来源的β-葡萄糖醛酸苷酶自发现以来已得到很好的应用。例如大肠杆菌来源的β-葡萄糖醛酸苷酶可水解底物形成荧光或有色物质，因此可利用这一特性检测饮用水或各种食品中大肠杆菌的污染。此外基于这一特性，β-葡萄糖醛酸苷酶常被作为报告基因，用于转基因生物标记和目的基因表达定位，成为相关科学研究工作的工具酶。随着人们对天然化合物的认识和研究，国内外已利用β-葡萄糖醛酸苷酶进行含糖苷类天然药物的改性研究。
甘草酸(Glycyrrhizin，GL)是甘草(Glycyrrhiza uralensis)的主要有效成分之一，是一种三萜皂苷类化合物，可作为天然的甜味剂，具有消炎、抗癌，抗肿瘤、保肝护肝及增强细胞免疫调节的功效，此外还具有良好的美白作用，结合其消炎的功能，能起到润肤和清除自由基等多种功效，因此也被广泛应用于化妆品领域。但是由于甘草酸极性较强，不易透过细胞膜进入细胞内发挥药理作用，不仅限制其功能的发挥，也造成药物的浪费。单葡萄糖醛酸基甘草次酸(Glycyrrhetinic acid monoglucuronide，GAMG)是甘草酸最外侧糖苷键裂解后，水解去除一分子葡萄糖醛酸后生成的产物，在保留甘草酸功效的同时因其具有极性适中，易于透过细胞膜，生物利用度高，且具有更高的甜度，更好的生物安全性等优点被认为是甘草酸良好的替代品。利用化学法生产GAMG时，存在低选择性、高耗能、高污染等缺点。相比于化学法生物法改性具有反应效率高、反应条件温和及底物特异性高等特点，而受到广泛的关注。
动物来源的β-葡萄糖醛酸苷酶的底物特异性差，甘草酸被其水解成GAMG时，会进一步作为底物被水解掉一个葡萄糖醛酸基(GlcA)，形成甘草酸次酸(Glycyrrhetinicacid，GA)，如图1所示，因此产物为GA和GAMG的混合物，且酶的制备过程复杂，成本高。而大部分微生物产生的β-葡萄糖醛酸苷酶也同样存在底物专一性差的问题，且野生菌产生的β-葡萄糖醛酸苷酶酶活较低。利用基因工程重组蛋白表达技术可以解决野生菌酶表达酶活低的问题，但是β-葡萄糖醛酸苷酶基因在模式菌株进行重组表达后，失去了底物特异性，仍然难获得单一的GAMG产物(邹树平，天津大学博士论文，2010年)。因此寻找新的β-葡萄糖醛酸苷酶基因，构建基因工程菌对其重组表达，获取表达量高、酶活高、底物特异性强的重组酶可以实现以单一GAMG为产物的规模化生产，且方便后续GAMG的提取和纯化，降低了生产成本。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点和不足，提供一种β-葡萄糖醛酸苷酶基因，工程菌及其应用。该基因能够在毕赤酵母中高效表达β-葡萄糖醛酸苷酶，且表达量及酶活均较高。
本发明的技术方案如下：
一种β-葡萄糖醛酸苷酶，其特征在于，其氨基酸序列由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列所编码。
编码所述β-葡萄糖醛酸苷酶的基因片段。
所述的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
包含所述基因片段的表达载体。可采用任何现有已知的空白表达载体，按照常规的连接步骤或商品表达载体的使用说明进行操作，将所述基因片段与空白表达载体即可获得本发明所述的表达载体。在本发明的一些实施例中，优选pGAPZα空白质粒载体，因为该质粒是强组成型表达质粒，不需要定时添加诱导剂的繁琐过程，且该质粒上含有信号肽，可将表达的蛋白分泌到胞外，方便酶的收集；该实施例中构建的所述表达载体是pGAPZα-Tpgus。
一种转化体，其特征在于，包含所述的表达载体。可采用任何现有已知的表达宿主菌，按照常规的转化步骤或商品宿主菌的使用说明进行操作，将所述表达载体转化至宿主菌中。本发明的一些实施例优选采用毕赤酵母作为表达宿主，因为毕赤酵母是食品安全级菌株，具有非常强的蛋白质分泌能力，并能进行高密度发酵。这些实施例中的所述转化体是包含上述表达载体pGAPZα-Tpgus的毕赤酵母工程菌。
具有β-葡萄糖醛酸苷酶功能的重组蛋白，其功能区的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列所编码。
用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品，其特征在于，其活性成分包括所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或
所述的基因片段，和/或
所述的表达载体，和/或
所述的转化体，和/或
所述的重组蛋白。
所述制品还包括用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的常规成分，和/或
连接转化所述的基因片段的常规试剂，和/或
构建所述的表达载体的常规试剂，和/或
扩繁所述的转化体的常规培养成分，和/或
转化表达所述的重组蛋白的常规试剂。
一种用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品的制备方法，其特征在于，采用所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或，
所述的基因片段，和/或
所述的表达载体，和/或
所述的转化体，和/或
所述的重组蛋白
作为制备所述制品的活性成分之一；和/或
在标有制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包装盒内放置有所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或
所述的基因片段，和/或
所述的表达载体，和/或
所述的转化体，和/或
所述的重组蛋白。
一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于，在制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的过程中添加和/或使用所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或
所述的基因片段，和/或
所述的表达载体，和/或
所述的转化体，和/或
所述的重组蛋白。
所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，其特征在于，来自保藏号为CGMCC No.11765的嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93。
本发明提供的β-葡萄糖醛酸苷酶来源于一株嗜松篮状菌(Talaromycespinophilum)Li-93(保藏号为CGMCC No:11765)，该基因能够在毕赤酵母中高效表达嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶，且表达量及酶活均较高。将上述工程菌表达的嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶用于单葡萄糖甘草次酸的生产时，发现底物特异性好，无副产物甘草次酸的生成，GAMG的产率为95％左右，高于本领域的现有水平。
所述嗜松篮状菌(Talaromyces pinophilum)菌株Li-93已送保藏，其保藏信息如下：
菌种保藏名称：Li-93
保藏号：CGMCC No.11765
分类命名：嗜松篮状菌
拉丁名：Talaromyces pinophilum
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年11月30日
附图说明
图1是β-葡萄糖醛酸苷酶水解甘草酸反应示意图；
图2是嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因扩增电泳图；1：目标片段，M:DNA分子量标准；
图3是嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因插入毕赤酵母基因组中验证电泳图；1：以阳性克隆
基因组为模板扩增Tpgus基因，2：对照，以GS115菌株基因组为模板扩增Tpgus基因，M：DNA分子量标准；
图4是嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因(Tpgus)表达载体pGAPZα-Tpgus图谱；
图5是毕赤酵母工程菌表达重组嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶转化甘草酸单铵盐生成单葡萄
糖醛酸基甘草次酸(GAMG)的高效液相色谱分析图，1：甘草酸(GL)的标准品，2：甘草次酸(GA)的标准品，3：GAMG的标准品，4：转化前，5转化后。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中使用的PCR引物序列：
Figure BDA0001141267160000041
实施例6中的甘草酸单铵盐纯度为75％，购自新疆天山制药厂。
本发明中β-葡萄糖醛酸苷酶酶活定义：每分钟生成1nmol GAMG所需的酶量为一个活力单位(U)。
本发明中GAMG的产率定义为：
Figure BDA0001141267160000051
实施例1：嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因的扩增
提取嗜松篮状菌Li-93的总RNA，反转录成cDNA后以此为模板，采用上游引物Tpgus-F和下游Tpgus-R扩增嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因Tpgus，得到长度1554bp的Tpgus基因片段，如图2所示。将上述所得基因片段与克隆载体pMD19-T连接，转化大肠杆菌DH5α菌株，提取质粒pMD19-T-Tpgus，对质粒上Tpgus基因进行测序验证，其序列如SEQ IDNo.1所示，结果表明正确无误。
实施例2：嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因表达载体构建
以实施例1中的pMD19-T-Tpgus为模板，采用上游引物Tpgus-F-KpnI和下游引物Tpgus-R-NotI扩增嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因Tpgus，琼脂糖电泳验证扩增结果，并切胶回收目的片段。采用DNA胶回收试剂盒回收目的片段后，采用内切酶Kpn I和Not I进行双酶切后，与同样采用内切酶KpnI和NotI进行双酶切后的pGAPZα质粒连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，涂布于含有抗生素Zeocin的LB筛选平板上。采用引物Tpgus-F-KpnI和3’AOX进行菌落PCR验证。将阳性克隆接于含有抗生素Zeocin的LB液体培养基内，37℃培养过夜，提取质粒，对Tpgus基因进行测序验证，结果表明正确无误。因此上述提取获得的质粒即为嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶的表达载体，见图4。
实施例3：嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶基因表达工程菌的构建
采用内切酶AvrII处理实施例2中构建的表达载体，使其线性化后采用电转法将其转入毕赤酵母菌株中。将电转产物涂布于含有博来霉素的YPD筛选平板上，30℃培养2-5天。从筛选平板上随机挑选6-10个阳性克隆，分别提取其基因组。以提取的各克隆的基因组为模板，采用上游引物Tpgus-F和下游引物3’AOX扩增目标片段，以GS115菌株的基因组为模板的扩增结果作为对照，验证转化结果，如图3所示，与对照相比，获得了目的条带，进一步对PCR产物进行测序验证，结果显示Tpgus基因已成功插入毕赤酵母基因组中。采用高浓度的博来霉素YPD平板进一步筛选包含多拷贝数Tpgus基因的工程菌。
实施例4：利用毕赤酵母工程菌制备嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶
挑取实施例2中具有多拷贝Tpgus基因的毕赤酵母工程菌的单菌落接于YPD液体培养基中，30℃振荡培养24小时后，以体积比5％的接种量接于新的YPD液体培养基，30℃振荡培养，每24小时添加葡萄糖至2g/L，培养过程中所述具有多拷贝Tpgus基因的毕赤酵母工程菌分泌出的重组蛋白即嗜松篮状菌β-葡萄糖醛酸苷酶；每12小时取样检测酶活。取酶活达到最大时的发酵液、离心、收集发酵液上清，即为重组β-葡萄糖醛酸苷酶的粗酶液，测得酶活为66.24U/mL。
实施例5、本发明所述的用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品及方法
本实施例提供一种用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品，其活性成分可以是SEQ ID No.1所示核苷酸序列所编码的所述β-葡萄糖醛酸苷酶，也可以是实施例1所述的基因片段经连接转化而得的产物，也可以是实施例2所述的表达载体转化表达而得的产物，或者是实施例3中所述的转化体经培养后获得的产物，或者是功能区氨基酸由SEQ ID No.1所示核苷酸序列编码的重组蛋白。
所述制品的活性成分优选为实施例4中具有多拷贝Tpgus基因的毕赤酵母工程菌分泌的重组蛋白
所述制品还包括用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的常规成分，和/或
连接转化所述的基因片段的常规试剂，和/或
构建所述的表达载体的常规试剂，和/或
扩繁所述的转化体的常规培养成分，和/或
转化表达所述的重组蛋白的常规试剂。
本实施例还提供一种用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品的制备方法，步骤包括，采用所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或，所述的基因片段，和/或所述的表达载体，和/或所述的转化体，和/或所述的重组蛋白作为制备所述制品的活性成分之一；和/或
在标有制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包装盒内放置有所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或所述的基因片段，和/或所述的表达载体，和/或所述的转化体，和/或所述的重组蛋白。
优选地，所述制备方法的步骤包括，采用实施例4中具有多拷贝Tpgus基因的毕赤酵母工程菌分泌的重组蛋白作为所述制品的活性成分之一，和/或
在标有制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包装盒内放置有实施例4中具有多拷贝Tpgus基因的毕赤酵母工程菌分泌的重组蛋白。
实施例6：采用本发明所述制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法制备GAMG
本实施例提供一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，步骤包括，在制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的过程中添加和/或使用SEQ ID No.1所示核苷酸序列所编码的所述β-葡萄糖醛酸苷酶，也可以是实施例1所述的基因片段经连接转化而得的产物，也可以是实施例2所述的表达载体转化表达而得的产物，或者是实施例3中所述的转化体经培养后获得的产物，或者是功能区氨基酸由SEQ ID No.1所示核苷酸序列编码的重组蛋白。
优选地，本实施例具体采用实施例4中具有多拷贝Tpgus基因的毕赤酵母工程菌分泌的重组蛋白进行GAMG的制备。取实施例4中粗酶液100mL，向其中加入甘草酸单铵盐至2g/L，于45℃，150rpm反应1-2小时，每15min取样，采用高效液相检测底物的消耗量和产物生成量。反应1.5小时后，90％以上的GL转化完毕，GAMG的增加量不再明显，如图5所示，计算GAMG的产率为95.21％。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京理工大学
南京精微生物科技有限公司
<120> 一种β-葡萄糖醛酸苷酶及其基因与应用
<130> 2
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1554
<212> DNA
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<220>
<223> 嗜松篮状菌（Talaromyces pinophilum）β-葡萄糖醛酸苷酶基因Tpgus全长序列
<400> 1
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gactacgccg gaaacaacac caacccgaat aaattctcca gacaagtagt ccaaaacctc 240
tacgacattt ccggcacata ccccatcttc cgtgtcggcg gcagcacgca aaattcagct 300
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<223> 嗜松篮状菌（Talaromyces pinophilum）β-葡萄糖醛酸苷酶基因Tpgus扩增引物Tpgus-R
<400> 3
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<400> 6
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Claims (12)

1.一种β-葡萄糖醛酸苷酶，其特征在于，其氨基酸序列由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列所编码。
2.编码权利要求1所述的β-葡萄糖醛酸苷酶的基因片段。
3.根据权利要求2所述的基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
4.包含权利要求2或3所述基因片段的表达载体。
5.一种转化体，其特征在于，包含权利要求4所述的表达载体。
6.具有β-葡萄糖醛酸苷酶功能的重组蛋白，其功能区的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列所编码。
7.用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品，其特征在于，其活性成分包括权利要求1所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或
权利要求2或3所述的基因片段，和/或
权利要求4所述的表达载体，和/或
权利要求5所述的转化体，和/或
权利要求6所述的重组蛋白。
8.根据权利要求7所述的制品，其特征在于，所述制品还包括用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的常规成分，和/或
连接转化权利要求2或3所述的基因片段的常规试剂，和/或
构建权利要求4所述的表达载体的常规试剂，和/或
扩繁权利要求5所述的转化体的常规培养成分，和/或
转化表达权利要求6所述的重组蛋白的常规试剂。
9.一种用于制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的制品的制备方法，其特征在于，采用权利要求1所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或，
权利要求2或3所述的基因片段，和/或
权利要求4所述的表达载体，和/或
权利要求5所述的转化体，和/或
权利要求6所述的重组蛋白
作为制备所述制品的活性成分之一；和/或
在标有制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸用途的包装盒内放置有权利要求1所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或
权利要求2或3所述的基因片段，和/或
权利要求4所述的表达载体，和/或
权利要求5所述的转化体，和/或
权利要求6所述的重组蛋白。
10.一种制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的方法，其特征在于，在制备单葡萄糖醛酸基甘草次酸的过程中添加和/或使用权利要求1所述的β-葡萄糖醛酸苷酶，和/或
权利要求2或3所述的基因片段，和/或
权利要求4所述的表达载体，和/或
权利要求5所述的转化体，和/或
权利要求6所述的重组蛋白。
11.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，为在pGAPZα载体上插入权利要求2或3所述的基因片段。
12.根据权利要求5所述的转化体，其特征在于，为包含权利要求11所述的表达载体的毕赤酵母工程菌。
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