CN115896059B

CN115896059B - 一种制备莱鲍迪苷rm的环糊精糖基转移酶突变体、编码基因及其应用

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Publication number: CN115896059B
Application number: CN202211305080.2A
Authority: CN
Inventors: 甄杰; 李清华; 史利平; 聂在建; 程保华
Original assignee: Shandong Sanyuan Biotechnology Co ltd; Sanyuan Bioengineering Research Tianjin Co ltd
Current assignee: Sanyuan Bioengineering Research Tianjin Co ltd; Shandong Sanyuan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-10-24
Filing date: 2022-10-24
Publication date: 2023-10-10
Anticipated expiration: 2042-10-24
Also published as: CN115896059A

Abstract

本发明提供了一种环糊精糖基转移酶突变体及其在合成莱鲍迪苷RM中的应用，所述制备方法包括以为莱鲍迪苷RE原料，以环糊精为糖基供体，在环糊精糖基转移酶突变体作用下一锅催化合成莱鲍迪苷RM。本发明采用提供的环糊精糖基转移酶突变体以廉价易得的环糊精作为糖基供体，替换成本高昂的UDP‑葡萄糖，并且催化效率有了较大的提升。该反应为制备莱鲍迪苷RM开辟了新的途径，反应的产物得率高，制备工艺简单，适用于工业化生产，具有广阔的应用前景。

Description

一种制备莱鲍迪苷RM的环糊精糖基转移酶突变体、编码基因及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及到一种糖基转移酶突变体催化合成莱鲍迪苷RM的方法。

背景技术

甜菊糖苷是一种二萜类化合物，以二萜类甜菊醇为基本骨架。甜菊糖苷主要存在于甜叶菊叶片中，其叶片中含有甜菊苷、莱鲍迪苷RA、莱鲍迪苷RB、莱鲍迪苷RD、莱鲍迪苷RE、莱鲍迪苷RI、莱鲍迪苷RM等多种天然甜菊糖苷，其中甜菊苷(Stevioside)应用广泛，虽然该类产品甜度达到蔗糖的300～600倍，仍然存在苦涩后味等不利缺点，口感有待改进。莱鲍迪苷RM其甜度和口感皆佳，并且热量低，是目前公认最理想的甜菊糖苷产品。莱鲍迪苷RM在原植物中含量非常低，通过植物提取纯化的方式成本巨大，目前的产量远远不能够满足市场需求。

中国专利202110967784 .5描述了一种糖基转移酶突变体及其催化合成莱鲍迪苷M的方法，其以糖基转移酶UGT76G1作为模板，进行了点突变，以莱鲍迪苷E和莱鲍迪苷D为底物，添加蔗糖和蔗糖合酶用于再生糖基供体UDPG，底物莱鲍迪苷E浓度为20g/L时，莱鲍迪苷M的最高产量为10 .270g/L，转化效率为42.2%（摩尔浓度比）。过程中需要糖基供体再生体系，体系复杂，同时转化效率过低，影响其实际应用。

中国专利202210253543.9公开了一种利用糖基转移酶UGT76G1突变体高效生物合成莱鲍迪苷M的方法，其同样以糖基转移酶UGT76G1作为模板，进行了点突变，同样在反应体系中添加蔗糖和蔗糖合酶用于再生糖基供体UDPG，其以22.58g/L的莱鲍迪苷D为底物，生成了23.37g/L的莱鲍迪苷M，转化效率为90.5%（摩尔浓度比）。需要糖基供体再生体系，体系复杂，且过程中需要添加昂贵的UDP用以生成糖基供体UDPG，成本高，难以实际应用。

中国专利202111393395 .2公开了一种利用枯草芽孢杆菌发酵催化制备莱鲍迪苷M的方法，其将将糖基转移酶UGT76G1和UGT11基因构建在枯草芽孢杆菌中，添加甜菊糖苷和UDPG，转化率88.4%。过程中需要添加昂贵的糖基供体UDPG，成本极高，难以实际应用。

中国专利202110376139.6公开了一种一锅法高效合成莱鲍迪苷M的方法，其在不添加UDPG的条件下，利用廉价底物ST在体外先经UGT76G1催化为莱鲍迪苷A，再经EUGT11催化产生莱鲍迪苷D，最终被UGT76G1转化为莱鲍迪苷M，其将10mM的ST转化为3.79mM的莱鲍迪苷M，转化效率37.9%。其尽管没有添加UDPG，但其利用了粗酶液中菌体本身的UDPG以及添加蔗糖和SUS酶构成糖基供体循环体系，体系复杂，转化率低，难以实际应用。

本发明人在2018年提交的中国专利201811228403.6公开了一种酶法制备莱鲍迪苷M的方法，其主要特征为以甜菊苷为原料，以乙酸乙酯和β-环糊精为糖基供体，以棕榈酰转移酶、环糊精糖基转移酶、UDP-糖基转移酶为主要工具酶，生成莱鲍迪苷M。尝试利用环糊精糖基转移酶作为转化用酶制备莱鲍迪苷M，但没有对环糊精糖基转移酶进行改造，而是采用多种酶和多种底物的方式，转化率只有40%左右，且需要添加多种酶和底物，不具备实际应用价值。

环糊精糖基转移酶(Cyclodextrin glycosyltransferase，简称CGTase，EC2.4.1.19)，属于α-环糊精酶家族，已被证实是一种多功能的酶，可催化四个反应，分别为水解反应、歧化反应、环化反应和偶联反应。CGTase转糖基反应显著，水解反应微弱，是典型的转苷酶。歧化反应和偶联反应是分子间转糖基反应，将麦芽低聚糖和环糊精转移至各种受体分子以产生糖基化衍生物，修饰受体分子，目前可以作为受体分子的包括醇类（肌醇、山梨醇、乳糖醇、木糖醇和麦芽糖醇）、糖类（蔗糖、果糖和鼠李糖）、苷类（芦丁、水杨苷和甜菊苷）、黄酮类化合物（芦丁、橙皮苷、柚皮苷和槲皮素）和一些其他小分子染料木素、对苯二酚、L-抗坏血酸等。莱鲍迪苷M是苷元甜菊醇(steviol)分别经过多步糖基化修饰形成的多糖苷，因此可以将环糊精糖基转移酶应用到莱鲍迪苷RM的合成当中。

挖掘的天然环糊精糖基转移酶往往很难满足生产要求。天然酶多数都存在酶活低，不稳定，底物混杂性差等问题。利用定向进化理论对酶分子进行改造，从而获得催化效率较高的酶分子。通过已报道的环糊精糖基转移酶晶体结构，进行同源建模，利用分子模拟手段，确定该酶的空间结构和可能的与活性相关的位点，通过定点突变技术提高了环糊精糖基转移酶的催化活力，将具有较强的工业应用价值。

发明内容

本发明针对现有莱鲍迪苷RM合成工艺存在的缺陷，通过获得环糊精糖基转移酶突变体，由此提供了生产莱鲍迪苷RM的方法，以莱鲍迪苷RE为底物，环糊精为辅助底物，利用环糊精糖基转移酶一锅催化莱鲍迪苷RE，得到莱鲍迪苷RM。

本发明人对解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)SY11（CGMCC No.22884）进行了全基因组测序和注释，发现了121个α-淀粉酶家族成员基因，进一步对其同源建模后发现，其中部分基因不仅具有α-淀粉酶的A，B，C结构域，还存在环糊精糖基转移酶特有的存在β-片层结构的D结构域和由110个氨基酸残基组成的E结构域，随后对其中部分基因进行了外源表达和功能验证。其中编号为A5024的基因确认具有β-环糊精糖基转移酶活性，序列长度为2133bp（基因序列如SEQ ID No.1所示），拷贝数为1，位于第一条染色体从1315393bp至1317526bp，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一种环糊精糖基转移酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第114位亮氨酸突变为丙氨酸，同时将第122位点丝氨酸突变为天冬酰胺，同时将223位点苯丙氨酸突变为甘氨酸获得的。

本发明还提供一种所述环糊精糖基转移酶突变体在催化生产莱鲍迪苷RM中的应用，所述应用的方法为：以环糊精糖基转移酶基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的粗酶液为催化剂，以莱鲍迪苷RE为底物，加辅助底物，以pH值为7-8（优选7.5）的缓冲液为反应介质构成反应体系，在40℃、500 rpm条件下反应，获得莱鲍迪苷RM，所述辅助底物为环糊精，所述反应体系中，催化剂的用量以湿菌体总重量计为5-20 g/L（优选20g/L），所述底物的初始浓度为20-100 mM（优选100mM），辅助底物添加量为50-250mM（优选250mM）。

本发明反应体系中，催化剂的使用形式为细胞破碎后的粗酶液，也可以为表达重组酶的工程菌静息细胞，还可以采用纯化后的纯酶，或者是经固定化后的酶。

本发明所述环糊精糖基转移酶突变体基因工程菌湿菌体按如下方法制备：将环糊精糖基转移酶突变体基因工程菌（优选为重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET22b-cgt1-L114A-S122N-F223G）接种至含有50 μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200 rpm下培养12 h，再以1%（v/v）接种量接种至新鲜的含有50 μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，150 rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24 μg/mL的IPTG，25℃下诱导培养16 h后，4℃、8000 rpm离心20 min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20 mM磷酸盐缓冲液洗涤两次，获得湿菌体；将湿菌体加入pH 7.5、100 mM的磷酸盐缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎5 min，超声破碎条件：功率为200 W，破碎1s，暂停2s，获得粗酶液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1) 本发明方法以莱鲍迪苷RE为底物，在辅助底物环糊精存在时，通过环糊精糖基转移酶一锅催化莱鲍迪苷RE得到莱鲍迪苷RM，最终环糊精糖基转移酶突变体完全催化100mM的莱鲍迪苷RE生产莱鲍迪苷RM仅需要12h。该方法原料转化率高、收率高易于分离提纯、转化时间短。在一个具体实施例中，最终糊精糖基转移酶突变体完全催化100mM的莱鲍迪苷RE生产莱鲍迪苷RM仅需要12 h，产生的莱鲍迪苷RM为98.2mM，转化效率高达98.2%。

本发明由此也克服目前生物酶法合成莱鲍迪苷RM的方法的缺陷。因为通常的方法都需要外加昂贵的UDP-葡萄糖为底物，通过UDP-葡萄糖基转移酶的作用，以莱鲍迪苷RE为底物，UDP-葡萄糖为糖基供体催化生成莱鲍迪苷RM，由于UDP-葡萄糖极高的售价，几乎完全限制了工业化制备莱鲍迪苷RM的可行性，经济性较差、缺乏市场竞争力。而利用环糊精糖基转移酶一锅催化莱鲍迪苷RE得到莱鲍迪苷RM，是以价格低廉的环糊精作为糖基供体，具有较好的经济效益。

附图说明

图1为E. coliBL21(DE3)/pET22b-cgt1催化合成莱鲍迪苷RM的反应式。

图2为E. coliBL21(DE3)/pET22b-cgt1-L114A-S122N-F223G催化合成莱鲍迪苷RM的反应进程图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步描述。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

实施例1表达载体和工程菌的构建

解脂亚罗酵母(Yarrowialipolytica)的β-环糊精糖基转移酶基因的核苷酸序列长度为2133b，如SEQ ID No.1所示：

ATGAAGAAAACGCTTAAACTTCTGTCGATTCTGTTGATAACCATTGCTCTTCTTTTCAGCTCAATTCCATCCGTACCGGCAGCACCGGATACTTCAGTTTCCAATGTTGTCAATTATTCAACAGATGTAATCTACCAGATAGTCACAGACCGTTTTTTAGATGGGAATCCCAGTAATAATCCAACAGGCGACTTATATGACCCTACCCATACTAGTTTAAAGAAATATTTTGGTGGCGATTGGCAGGGTATTATTAACAAAATTAATGATGGTTATCTTACTGGTATGGGAATTACAGCTATATGGATTTCGCAACCTGTAGAAAACATTTACGCAGTTTTGCCAGATTCCACTTTTGGCGGAAGCACATCCTATCATGGTTACTGGGCACGAGACTTCAAAAAGACAAATCCCTTTTTTGGAAGCTTTACAGATTTTCAAAATCTCATAGCAACAGCTCATGCTCACAATATAAAAGTTATAATAGACTTTGCACCAAATCATACATCTCCTGCATCAGAGACAGACCCTACCTATGGGGAAAATGGTAGATTATATGACAATGGAGTATTACTTGGTGGTTATACCAATGATACAAATGGATATTTCCATCATTATGGAGGAACTAATTTTTCATCATATGAAGATGGAATTTACCGTAATTTATTTGACTTAGCAGATTTAGATCAGCAGAATAGCACTATTGATTCATATTTAAAAGCGGCAATTAAACTATGGTTAGACATGGGGATTGATGGTATACGCATGGATGCAGTCAAACACATGGCATTTGGATGGCAAAAGAACTTTATGGATTCTATTTTAAGTTATAGACCAGTTTTTACATTTGGCGAGTGGTACCTTGGAACCAATGAAGTAGATCCT8AATAATACGTATTTTGCAAATGAAAGTGGTATGAGCCTTCTTGATTTTAGATTTGCTCAAAAAGTTCGTCAAGTATTCAGAGACAATACAGACACTATGTATGGACTTGATTCGATGATTCAGTCTACTGCAGCAGATTATAATTTCATAAATGATATGGTTACATTTATAGATAATCATGACATGGACAGATTTTATACAGGAGGCAGTACACGGCCTGTTGAGCAAGCGTTAGCATTTACTTTAACTTCTCGCGGTGTACCTGCTATATATTACGGTACAGAGCAATATATGACAGGTAATGGAGACCCTTATAATAGAGCTATGATGACGTCATTTGACACCACAACGACGGCATATAATGTGATAAAAAAGCTTGCTCCACTGCGTAAATCTAACCCTGCAATTGCTTACGGTACACAAAAACAGCGATGGATAAATAATGATGTTTACATTTATGAAAGACAATTTGGTAATAACGTTGCTCTTGTTGCTATTAATCGTAATCTTTCAACGAGCTATTACATTACCGGCTTGTACACCGCATTGCCTGCGGGAACATATTCTGACATGCTTGGCGGATTATTAAATGGCAGTAGTATTACAGTATCTAGTAATGGTTCTGTAACACCGTTTACCCTTGCGCCTGGTGAAGTTGCAGTATGGCAGTATGTCAGTACAACTAATCCTCCATTGATAGGACATGTAGGACCGACAATGACAAAGGCAGGGCAGACTATAACCATAGATGGAAGGGGATTTGGCACAACAGCAGGTCAAGTATTATTTGGGACAACTCCTGCAACTATTGTGTCATGGGAAGATACTGAAGTAAAAGTAAAAGTTCCTGCTTTAACTCCTGGAAAATATAACATTACATTAAAAACAGCATCAGGAGTTACAAGCAATAGCTATAACAATATCAATGTTTTAACGGGAAATCAGGTATGTGTTAGATTTGTAGTAAATAATGCTACAACCGTGTGGGGAGAAAATGTATATCTTACGGGCAATGTAGCTGAACTTGGCAACTGGGATACATCGAAGGCAATAGGACCAATGTTTAACCAGGTTGTGTATCAATATCCTACGTGGTATTACGATGTAAGTGTGCCTGCTGGTACTACTATAGTGTTTAAGTTTATAAAGAAAAATGGTAGTACTGTAACCTGGGAAGGTGGATACAACCACGTATATACTACACCCACTTCTGGTACAGCTACTGTAATTGTAGACTGGCAACCGTGA。

所编码的核苷酸序列如下：

MKKTLKLLSILLITIALLFSSIPSVPAAPDTSVSNVVNYSTDVIYQIVTDRFLDGNPSNNPTGDLYDPTHTSLKKYFGGDWQGIINKINDGYLTGMGITAIWISQPVENIYAVLPDSTFGGSTSYHGYWARDFKKTNPFFGSFTDFQNLIATAHAHNIKVIIDFAPNHTSPASETDPTYGENGRLYDNGVLLGGYTNDTNGYFHHYGGTNFSSYEDGIYRNLFDLADLDQQNSTIDSYLKAAIKLWLDMGIDGIRMDAVKHMAFGWQKNFMDSILSYRPVFTFGEWYLGTNEVDPNNTYFANESGMSLLDFRFAQKVRQVFRDNTDTMYGLDSMIQSTAADYNFINDMVTFIDNHDMDRFYTGGSTRPVEQALAFTLTSRGVPAIYYGTEQYMTGNGDPYNRAMMTSFDTTTTAYNVIKKLAPLRKSNPAIAYGTQKQRWINNDVYIYERQFGNNVALVAINRNLSTSYYITGLYTALPAGTYSDMLGGLLNGSSITVSSNGSVTPFTLAPGEVAVWQYVSTTNPPLIGHVGPTMTKAGQTITIDGRGFGTTAGQVLFGTTPATIVSWEDTEVKVKVPALTPGKYNITLKTASGVTSNSYNNINVLTGNQVCVRFVVNNATTVWGENVYLTGNVAELGNWDTSKAIGPMFNQVVYQYPTWYYDVSVPAGTTIVFKFIKKNGSTVTWEGGYNHVYTTPTSGTATVIVDWQP。

根据SEQ ID NO.1所示核苷酸序列设计引物，并分别在引物中引入了NdeI和NotI限制性酶切位点：

上游引物：5’-CATATGATGAAGAAAACGCTTAAACTT-3’；

下游引物：5’-GCGGCCGCTCACGGTTGCCAGTCTACA-3’；

以pET-22b质粒为表达载体，构建大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET22b-cgt1

表达质粒的构建：在上述引物的引发下，以目的基因为模板，利用高保真Pfu DNA聚合酶进行扩增，获得环糊精糖基转移酶基因序列，测序后利用NdeI和NotI限制性内切酶（TaKaRa）对扩增片段进行处理，并利用T4 DNA连接酶（TaKaRa）将该片段同用相同的限制性内切酶处理的载体pET-22b进行连接，构建表达载体pET22b-cgt1。

感受态细胞的制备：从-80℃冰箱中获得甘油管保藏的E. coliBL21(DE3)菌株，在无抗LB平板上划线，37℃培养10 h，获取单菌落；挑取LB平板的单菌落，接种至含5 mL的LB培养基的试管中，37℃、180 rpm培养9 h；从试管中取200 μL菌液，接种到50mL的LB培养基中，37℃、180 rpm培养OD600至0.4-0.6；将菌液在冰上预冷，取菌液至灭菌的离心管中，冰上放置10 min，4℃、5000 rpm离心10 min；将上清液倒出，注意防止染菌，用预冷的0.1mol/L 的CaCl₂水溶液重悬沉淀细胞，并在冰上放置30 min；4℃、5000 rpm离心10 min，弃上清，用预冷的含15%甘油的0.1 mol/L的CaCl₂水溶液重悬沉淀细胞，取100 μL重悬细胞分装至灭菌的1.5 mL离心管中，保藏于-80℃冰箱，需要时取出。

重组大肠杆菌的构建：首先将储藏于-80℃的大肠杆菌BL21（DE3）（Invitrogen）感受态细胞在0℃冰浴10min，然后在超净台内加入5µL的质粒pET22b-cgt1，0℃冰浴30min，42℃水浴中热击90s，0℃冰浴2min，加入600µL的LB培养基，在37℃、200rpm摇床培养1h；涂布于含有50 μg/ml氨苄霉素抗性的LB平板，37℃下培养8-12 h，随机挑取克隆抽提质粒进行测序鉴定，筛选获得含有表达重组质粒的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET22b-cgt1。

实施例2：环糊精糖基转移酶的诱导表达

含环糊精糖基转移酶基因的湿菌体：分别将实施例1获得的重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET22b-cgt1接种至含有50 μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200 rpm下培养12 h，再以1%（v/v）接种量接种至新鲜的含有50 μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，25℃下诱导培养16 h后，4℃、8000 rpm离心20 min，弃去上清液，收集沉淀，用pH7.5、20 mM磷酸盐缓冲液洗涤两次，即获得含环糊精糖基转移酶的重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET22b-cgt1的湿菌体；将湿菌体加入pH 7.5、100 mM的磷酸盐缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎5 min，超声破碎条件：功率为200 W，破碎1s，暂停2s，获得粗酶液。

LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L，溶剂为水，pH7.4。

LB平板：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L，18g/L琼脂，溶剂为水，pH7.4。

实施例3：高效液相检测方法

高效液相色谱(HPLC)检测产物莱鲍迪苷RM浓度，分析方法为：色谱柱型号：QS-C18，5μm，4.6×250mm。流动相为 A(水):B（乙腈）=68:32，进样量10 μL，检测波长210nm，检测时间为：18min，流速：0.5mL/min。柱温：40℃。

样品处理：取20μL反应结束的样品，稀释10倍，加入16 μL 2M的H₂SO₄溶液和160 μL60%的甲醇溶液终止反应，经0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC检测。

实施例4：环糊精糖基转移酶基因定点饱和突变文库的建立

以实施例2构建的E.coliBL21(DE3)/pET22b-cgt1为出发菌株。

通过定向进化理论方法进行改造，根据同源建模获得的环糊精糖基转移酶晶体结构并对接得到复合物模型。并对该结构中与底物莱鲍迪苷E周围内的氨基酸残基进行分析，选择114、122、171、223、224位点进行定点突变，引物设计如表1。

突变PCR体系(100μL)为：2*Phanta Max 缓冲液25 μL，dNTPs1 μL，突变上下引物各1 μL，模板（出发菌株）1 μL，Pfu DNA聚合酶0.5μL，补ddH2O至50 μL。PCR条件为：95℃预变性3min，经30个循环：95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 7min20s，最后72℃终延伸10min。PCR结果分别进行DNA琼脂糖凝胶电泳阳性验证，将PCR产物进行DpnI酶消化模板，37℃，1小时，200rpm，65℃，1分钟灭活，将PCR产物热击转化，并将大肠杆菌E. coliBL21( DE3 )活化，置于37℃、200rpm，培养1小时，涂布于含50 μg/mL氨苄霉素抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜。

表1环糊精糖基转移酶定点突变引物设计

引物名称	引物序列
		L114I-F	ATTTACGCAGTTATTCCAGATTCCACT
L114I-R	AGTGGAATCTGGAATAACTGCGTAAAT
		L114D-F	ATTTACGCAGTTGATCCAGATTCCACT
L114D-R	AGTGGAATCTGGATCAACTGCGTAAAT
		L114A-F	ATTTACGCAGTTGCTCCAGATTCCACT
L114A-R	AGTGGAATCTGGAGCAACTGCGTAAAT
		S122N-F	ACTTTTGGCGGAAATACATCCTATCAT
S122N-R	ATGATAGGATGTATTTCCGCCAAAAGT
		S122Y-F	ACTTTTGGCGGATATACATCCTATCAT
S122Y-R	ATGATAGGATGTATATCCGCCAAAAGT
		P171T-F	AATCATACATCTACTGCATCAGAGACA
P171T-R	TGTCTCTGATGCAGTAGATGTATGATT
		P171T-F	AATCATACATCTCGTGCATCAGAGACA
P171T-R	TGTCTCTGATGCACGAGATGTATGATT
		F223Y-F	TACCGTAATTTATATGACTTAGCAGAT
F223Y-R	ATCTGCTAAGTCATATAAATTACGGTA
		F223Y-F	TACCGTAATTTAGGTGACTTAGCAGAT
F223Y-R	ATCTGCTAAGTCACCTAAATTACGGTA
		F223Y-F	TACCGTAATTTAGCTGACTTAGCAGAT
F223Y-R	ATCTGCTAAGTCAGCTAAATTACGGTA
		D224G-F	CGTAATTTATTTGGTTTAGCAGATTTA
D224G-R	TAAATCTGCTAAACCAAATAAATTACG
		D224S-F	CGTAATTTATTTTCTTTAGCAGATTTA
D224S-R	TAAATCTGCTAAAGAAAATAAATTACG

实施例5：环糊精糖基转移酶基因突变文库的筛选

将实施例4获得的平板上挑取单克隆，接种至含有50 μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200 rpm下培养12 h，再以1%（v/v）接种量接种至新鲜的含有50 μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37 ℃，200 rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，25℃下诱导培养16 h后，4℃、8000 rpm离心20 min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20 mM磷酸盐缓冲液洗涤两次，即获得含环糊精糖基转移酶基因突变文库的的湿菌体；将湿菌体加入pH 7.5、100 mM的磷酸盐缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎5 min，超声破碎条件：功率为200 W，破碎1s，暂停2s，获得粗酶液。

1、初筛：

配置反应液（200μL）：终浓度20mM底物莱鲍迪苷RE，终浓度为50mM的环糊精，催化剂用量以破碎前湿菌体总重量计5g/L，以pH7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液。反应条件：40℃、500rpm的反应器上反应12小时后，反应结束后取20μL反应结束的样品，稀释10倍，加入16 μL 2M的H₂SO₄溶液和160 μL 60%的甲醇溶液终止反应，经0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC检测，检测结果如表2所示。

表2 初筛反应结果

突变体	莱鲍迪苷RM(mM)
		母本	3.32±0.33
L114I	2.51±0.45
		L114D	1.32±0.46
L114A	9.56±0.33
		S122N	4.35±0.71
S122Y	2.32±0.44
		P171T	1.01±0.33
P171R	1.23±0.86
		F223Y	2.65±0.14
F223G	8.85±0.31
		F223A	1.25±0.35
D224G	1.20±0.18
		D224S	2.25±1.25

2、复筛：

将初筛获得的菌株进行复筛，复筛配置反应液（10mL）：终浓度100mM底物莱鲍迪苷RE，终浓度为250mM的环糊精，催化剂用量以破碎前湿菌体总重量计20g/L，以pH7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液。反应条件：40℃、500rpm的反应器上反应12小时后，反应结束后取20μL反应结束的样品，稀释10倍，加入16 μL 2M的H₂SO₄溶液和160 μL 60%的甲醇溶液终止反应，经0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC检测，检测结果如表3所示。

表3.复筛反应结果

突变体	莱鲍迪苷RM(mM)
		母本	9.74±0.22
L114A	26.45±1.18
		S122N	17.35±0.62
F223G	25.85±0.71
		F223G+S122N	58.25±2.35
F223G+L114A	72.20±2.18
		S122N+L114A	51.25±0.65
S122N+L114A+F223G	95.54±3.65

实施例6：环糊精糖基转移酶在催化合成莱鲍迪苷M中的应用

将实施例5获得的活力最高的重组环糊精糖基转移酶突变体E. coliBL21(DE3)/pET22b-cgt1-L114A-S122N-F223G。接种到含终浓度50 μg/mL氨苄霉素的LB液体培养基中，37℃培养9小时，作为种子液，以体积浓度3.5%的接种量接入装有3L发酵培养基的5L的发酵罐培养。将配好的培养基加入其中，出气口进气口包扎密封好，安装密封好，接种口打开，并和配好的乳糖诱导剂一同放入灭菌锅中115℃、30min灭菌（乳糖不能121℃灭菌）。将灭好菌的发酵罐拧上接种口，并安装到操作系统上，通上冷凝水和空气（进气管要安装除菌膜），出气口插到锥形瓶液面以下，待灭菌锅降到37℃时，将火圈套在接种口上，将培养好的种子液接入到发酵罐中。在37℃，500rpm培养3-4h左右，菌种密度OD为6-8达到要求，将发酵罐温度降至25℃后，加入终浓度为16g/L的乳糖作为诱导剂加入，然后再25℃，500rpm培养12h。将养好的发酵液8000rpm离心10min，用pH 7.5、20 mM磷酸盐缓冲液洗涤两次，获得含环糊精糖基转移酶突变体E. coliBL21(DE3)/pET22b-cgt1-L114A-S122N-F223G的湿菌体，所获得的湿菌体利用高压匀浆机进行破碎。

所述发酵罐培养基组成：胰蛋白胨45g、酵母提取物36g、氯化钠30g、磷酸二氢钾4.08g、丙三醇（甘油）45g、三水合磷酸氢二钾6.84g、硫酸铵15g、硫酸镁1.125g、消泡剂4g，加入蒸馏水定容至3 L进行溶解。

催化剂用量高压匀浆之前湿菌体总重量计20 g/L，终浓度100mM底物莱鲍迪苷RE，终浓度为250mM的环糊精，以pH7.5的磷酸缓冲液为反应介质构成反应液总体积为1L。反应条件：40℃、500rpm反应12小时，反应结束后取20μL反应结束的样品，稀释10倍，加入16 μL2M的H₂SO₄溶液和160 μL 60%的甲醇溶液终止反应，经0.22 μm滤膜过滤，进行HPLC检测，反应进程曲线如图2所示，反应结束后莱鲍迪苷RM的浓度达到98.2 mM。

Claims

1.一种环糊精糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第114、122、223位点之一处或两处或三处进行突变获得的；所述突变体是将第114位亮氨酸突变为丙氨酸，或者将第122位点丝氨酸突变为天冬酰胺、或者将223位点苯丙氨酸突变为甘氨酸，

或者将第114位亮氨酸突变为丙氨酸且第122位点丝氨酸突变为天冬酰胺，

或者将第114位亮氨酸突变为丙氨酸223位点苯丙氨酸突变为甘氨酸，

或者将第122位点丝氨酸突变为天冬酰胺且223位点苯丙氨酸突变为甘氨酸，

或者将第114位亮氨酸突变为丙氨酸、第122位点丝氨酸突变为天冬酰胺以及第223位点苯丙氨酸突变为甘氨酸获得的。

2.一种权利要求1所述环糊精糖基转移酶突变体的编码基因。

3.一种含有权利要求2所述编码基因的工程菌。

4.一种权利要求1所述环糊精糖基转移酶突变体在催化合成莱鲍迪苷RM中的应用。

5.一种催化合成莱鲍迪苷RM的方法，其特征在于，以编码权利要求1所述环糊精糖基转移酶突变体的基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体超声破碎提取的粗酶液，纯化后的纯酶，或者是经固定化后的权利要求1所述环糊精糖基转移酶突变体为催化剂，以莱鲍迪苷RE为底物，加入环糊精为辅助底物，进行催反应得到莱鲍迪苷RM。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，以pH值为7-8缓冲液为反应介质构成反应体系，在35-45℃、300-800rpm条件下反应，反应完全，获得莱鲍迪苷RM。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，催化剂的用量以湿菌体总重量计为5-20 g/L，所述底物的初始浓度为10-80 mM，辅助底物添加量为50-300mM。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌是重组大肠杆菌。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述基因工程菌湿菌体按如下方法制备：将所述基因工程菌接种至含有50 μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基，37℃，200 rpm下培养12 h，再以体积浓度1%接种量接种至新鲜的含有50 μg/mL氨苄霉素抗性的LB液体培养基中，于37℃，200 rpm下培养至菌体OD600达0.6-0.8，加入终浓度为24 μg/mL的IPTG，25℃下诱导培养16 h后，4℃、8000 rpm离心20 min，弃去上清液，收集沉淀，用pH 7.5、20 mM磷酸盐缓冲液洗涤两次，获得湿菌体；将湿菌体加入pH 7.5、100 mM的磷酸盐缓冲液中重悬，在冰水混合物上超声破碎 5 min，超声破碎条件：功率为200 W，破碎1s，暂停2s，获得粗酶液。