CN112795569B - 一种新型组成型启动子、重组地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一种新型组成型启动子、重组地衣芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

发明公开了一种新型组成型启动子、重组地衣芽孢杆菌及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明通过PCR获得Bacillus licheniformis来源的强组成型启动子P2以及Thermobifida fusca NTU22来源的麦芽三糖淀粉酶目的基因，构建重组质粒pHY‑P2‑tfa，并转化至地衣芽抱杆菌Bacillus licheniformis，得到重组地衣芽抱杆菌。本发明以食品安全的地衣芽孢杆菌为表达宿主，利用新型高活性启动子P2实现麦芽三糖淀粉酶的重组表达。混合碳源麦芽糊精60g/L，葡萄糖10g/L以及42℃的发酵条件更有利于产酶，重组菌发酵的最高酶活达到578.47U/mL。

Description

一种新型组成型启动子、重组地衣芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和酶工程技术领域，尤其是涉及一种新型组成型启动子、重组地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术
启动子是合成生物学的基本表达元件之一，在调控合成代谢中起着重要作用。在基因的表达过程中，RNA聚合酶能特异性识别并结合启动子的特定序列，从而控制基因转录表达的起始时间和表达强度。在工业微生物表达合成高附加值化合物时，启动子对合成途径的调控作用往往决定着生产效率。
启动子在真核和原核表达系统中的研究和应用已经比较成熟。在酵母中，组成型的PTEF、PHXT7和PGPD等启动子已应用于代谢工程在原核微生物中，大肠杆菌表达系统研究的最早，最成熟的是采用启动子T7、lac,tac的表达系统。随着分子生物学的发展，革兰氏阳性细菌芽孢杆菌逐渐被开发成为一类重要的原核表达系统。在枯草芽孢杆菌中应用最为广泛的是P43、Pxyl等启动子。
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)作为一种有效的外源基因表达系统，具有发酵周期短，热稳定性好，蛋白分泌能力强等优势，被认定为生物安全GRAS(Generallyregarded as safe)菌株。地衣芽孢杆菌在酶表达、代谢产物合成方面有着很好的应用前景，用于生产蛋白酶，淀粉酶，果胶酶等工业酶以及抗生素、柠檬酸、谷氨酸等物质。
麦芽三糖淀粉酶(maltotriose-producingα-amylase)属于糖苷水解酶GH13家族。可作用于淀粉及相关多聚糖，生成的主要产物为麦芽三糖。麦芽三糖能抑制人体肠道里有害菌的生长和淀粉的老化，是一种具有营养保健功能的糖源。
发明内容
针对目前重要工业微生物地衣芽孢杆菌十分缺乏合成生物学标准化元件，现有启动子主要来源于枯草芽孢杆菌等模式微生物，表达异源基因效果不甚理想以及缺乏生产麦芽三糖淀粉酶的高效方法，本发明提供了一种来源于地衣芽孢杆菌的新型组成型P2启动子和麦芽三糖淀粉酶基因的重组质粒，可实现麦芽三糖淀粉酶在地衣芽孢杆菌食品安全型微生物宿主中的高效制备。
本发明的技术方案如下：
一种新型组成型启动子P2，所述组成型启动子P2来源于保藏编号为Bacilluslicheniformis ATCC14580，Bacillus licheniformis ATCC12759，Bacilluslicheniformis ATCC9945，Bacillus licheniformis ATCC13438或Bacilluslicheniformis ATCC9259的地衣芽孢杆菌中。
进一步的，所述新型组成型启动子P2的核苷酸序列见SEQ ID NO:1。
进一步的，一种重组地衣芽孢杆菌，所述重组地衣芽孢杆菌启动子为新型组成型启动子P2，且所述重组地衣芽孢杆菌含有麦芽三糖淀粉酶基因片段。
进一步的，所述重组地衣芽孢杆菌的重组表达载体为pHY-P2-tfa。
进一步的，所述pHY-P2-tfa是通过将权利要求1中所述新型组成型启动子P2克隆到pHY300-PLK质粒，并将权利要求3中所述麦芽三糖淀粉酶基因片段克隆到上述所得质粒中得到。
进一步的，一种重组地衣芽孢杆菌的构建方法，所述构建方法为：
进一步的，将地衣芽孢杆菌中提取得新型组成型启动子P2基因克隆到pHY300-PLK质粒上，并将麦芽三糖淀粉酶基因片段克隆到重组表达载体pHY-P2-tfa上，最后转入地衣芽孢杆菌中得到重组地衣芽孢杆菌。
进一步的，所述地衣芽孢杆菌保藏编号为Bacillus licheniformis ATCC14580,Bacillus licheniformis ATCC12759,Bacillus licheniformis ATCC9945,Bacilluslicheniformis ATCC13438或Bacillus licheniformis ATCC9259中的至少一种。
进一步的，重组地衣芽孢杆菌用于发酵生产麦芽三糖淀粉酶。
进一步的一种重组地衣芽孢杆菌生产麦芽三糖淀粉酶的方法，发酵培养基为：20g/L蛋白胨FP321，10g/L酵母粉FM408，5g/L玉米浆干粉，70-90g/L碳源，9.12g/L K2HPO4·3H2O，1.36g/L KH2PO4，0.50g/L CaCl2，0.50g/L MgSO4·7H2O，10g/L(NH4)2HPO4，发酵温度为25-42℃，发酵时间12-72h。
进一步的，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、木糖或麦芽糊精中的至少一种。
本发明有益的技术效果在于：
本发明基于新启动子构建的表达质粒转化入地衣芽孢杆菌，实现了麦芽三糖淀粉酶的分泌表达。新的组成型强启动子的鉴定和应用为地衣芽孢杆菌表达系统的开发和完善奠定了基础。在混合碳源麦芽糊精60g/L，葡萄糖10g/L以及42℃的发酵条件下，重组菌发酵的最高酶活达到578.47U/mL。
附图说明
图1为本发明重组表达质粒PHY-P2-tfa酶切电泳图；
图2为本发明重组菌的酶活及生长曲线；
图3为本发明重组蛋白SDS-PAGE电泳图；
图4为本发明不同碳源对酶活的影响；
图中：a:使用葡萄糖碳源时的OD600和酶活；b:使用蔗糖碳源时的OD600和酶活；c:使用木糖碳源时的OD600和酶活；d:使用葡萄糖和麦芽糊精时的OD600和酶活；
图5为本发明不同温度对酶活的影响；
图中：a:25℃时的OD600和酶活；b:30℃时的OD600和酶活；c:37℃时的OD600和酶活；d:42℃时的OD600和酶活；
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。
实施例1
P2启动子的克隆
以地衣芽孢杆菌B.licheniformis CICIM B1391基因组为模板，PH2-F/PH2-R为引物PCR扩增，酶切纯化得到启动子片段，克隆到pHY300-PLK质粒上，得到P2启动子表达载体。
PH2-F:CCCAAGCTTCATCTCAATTATACAAAGAAGGAA
PH2-R:GCGTCGACTTTCCTTCACCTCTTAATTAATTTT
实施例2
启动子P2表达麦芽三糖淀粉酶载体的构建
将PCR融合的果聚糖合酶信号肽和终止子的麦芽三糖淀粉酶基因片段sacBss-tfa-ter，经过BamHI、SmaI双酶切回收目的片段，克隆到P2表达载体上，转化E.coli JM109实现表达载体的构建。质粒命名为pHY-P2-tfa。
实施例3
重组质粒pHY-P2-tfa的转化
将地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC14580，Bacillus licheniformisATCC12759，Bacillus licheniformis ATCC9945，Bacillus licheniformis ATCC13438与Bacillus licheniformis ATCC9259分别平板活化后接种于15mL的LB培养基中，37℃，250rpm过夜培养。取1mL培养液转接到30mL培养基I中，37℃，250rpm，培养4.5h后冰浴10min,6000rpm离心10min收集菌体，用缓冲液BW洗涤菌体4次。用750μL缓冲液悬浮菌体，分装80μL于1.5mL离心管中。在地衣芽孢杆菌感受态中加入质粒，将细胞转至电转杯中，冰上放置5min，使用电转化仪2000V电击一次，立即加入800μL复苏培养基BR。37℃，100rpm培养3h，涂布于筛选平板上。实现重组质粒pHY-P2-tfa的地衣芽孢杆菌转化，重组地衣芽孢杆菌命名为PH2A。
LB培养基(g/L):蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。
培养基I：LB培养基加入0.5M山梨醇。
缓冲液BW：0.5M山梨醇、0.5M甘露醇、10％甘油。
复苏培养基BR：LB添加0.50M山梨醇和0.38M甘露醇。
实施例4摇瓶发酵产酶
取地衣芽孢杆菌重组菌株PH2A平板活化，用接种环取一环接种至LB培养基中，于37℃，250r/min条件下培养16h。再转接至40/250mL发酵培养基中挡板摇瓶发酵，培养72h。收集发酵液，4℃，12000r/min条件下离心，上清液即为粗酶液。
发酵培养基(g/L):蛋白胨FP321 20，酵母粉FM408 10，玉米浆干粉5，麦芽糊精60，葡萄糖10，K2HPO4·3H2O 9.12，KH2PO4 1.36，CaCl2 0.50，MgSO4·7H2O 0.50，(NH4)2HPO4 10。
实施例5检测酶活
取1mL发酵液12000rpm冷冻离心10min，上清即为粗酶液。取950μL 1％可溶性淀粉作为底物，40℃预热。然后加入50μL粗酶液，于40℃反应30min，作为反应组。对照组取950μL底物，于40℃预热后加入沸水浴灭活的酶液50μL。采用DNS法分别从反应组和对照组取500μL反应液，加入至1.5mL的DNS中煮沸5min。冷却定容至25mL，在540nm处测定吸光值。反应组减去对照组的吸光值后，根据测定的标准曲线，计算还原糖含量。最后根据酶活定义计算酶活。酶活单位定义：每小时分解可溶性淀粉生成相当于1μmol还原糖所需的酶量。
实施例6
不同发酵条件对酶活的影响
1、不同碳源对酶活的影响
碳源是微生物代谢的重要能源物质，不同的碳源影响着菌体的生长和酶的产量。本发明通过试验比较了发酵培养基中等量葡萄糖、蔗糖、木糖、麦芽糊精等碳源对菌体生长量和产酶的影响。由图4可知，当培养基中只有葡萄糖和蔗糖时不利于重组菌体生长，所得到的麦芽三糖淀粉酶酶活相比较也较低。当发酵过程中只有木糖作为碳源时，菌体后期生长状态稳定，但麦芽三糖淀粉酶酶活力也不高，可能原因是木糖也为还原糖，可能会影响酶活检测。当使用发酵培养基中采用混合碳源麦芽糊精60g/L，葡萄糖10g/L时，菌体生长趋势较为稳定，酶活随着菌体生长稳定升高。发酵48h时酶活达到428.5U/mL。
2、不同温度对酶活的影响
对地衣芽孢杆菌启动子表达麦芽三糖淀粉酶发酵温度进行了优化，比较了25℃，30℃，37℃，42℃不同发酵温度条件下的麦芽三糖淀粉酶酶活。由图5可知，当发酵温度为25℃不利于重组菌体生长，菌体量不稳定，酶产量不高。当发酵温度为42℃相比其他温度发酵时菌体生长曲线稳定，而且当发酵时间为36h的OD600达到36.3，最高酶活达到578.47U/mL，之后酶活力也维持在较高的稳定水平。
本发明中新型组成型启动子P2的核苷酸序列为：CATCTCAATT ATACAAAGAAGGAAAGTTTATGTATAGATA TTTTCGAATA TTTAACTTATTGGACACAAT AATTTTGAAA TAGGGCATTTTGCACAAGAA ATAATCCAAA ATAGCCCAAA AATAATCCAA CAATTCTAAT TATTGTTATA ATAATGCTGAGCTCCCAAAA TTAATTAAGA GGTGAAGGAA A。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种新型组成型启动子、重组地衣芽孢杆菌及其应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 191
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
catctcaatt atacaaagaa ggaaagttta tgtatagata ttttcgaata tttaacttat 60
tggacacaat aattttgaaa tagggcattt tgcacaagaa ataatccaaa atagcccaaa 120
aataatccaa caattctaat tattgttata ataatgctga gctcccaaaa ttaattaaga 180
ggtgaaggaa a 191

Claims (8)

1.一种新型组成型启动子P2，其特征在于，所述组成型启动子P2来源于保藏编号为Bacillus licheniformis ATCC14580，Bacillus licheniformis ATCC12759，Bacillus licheniformis ATCC9945，Bacillus licheniformis ATCC13438或Bacillus licheniformis ATCC9259的地衣芽孢杆菌中；
所述新型组成型启动子P2的核苷酸序列见SEQ ID NO:1。
2.一种重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述重组地衣芽孢杆菌启动子为权利要求1中所述的组成型启动子P2，且所述重组地衣芽孢杆菌含有麦芽三糖淀粉酶基因片段。
3.根据权利要求2所述的重组地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述重组地衣芽孢杆菌的重组表达载体为pHY-P2-tfa；
所述pHY-P2-tfa是通过将权利要求1中所述新型组成型启动子P2克隆到pHY300-PLK质粒，并将权利要求2中所述麦芽三糖淀粉酶基因片段克隆到上述所得质粒中得到。
4.一种如权利要求2所述的重组地衣芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法为：
将地衣芽孢杆菌中提取得新型组成型启动子P2基因克隆到pHY300-PLK质粒上，并将麦芽三糖淀粉酶基因片段克隆到重组表达载体pHY-P2-tfa上，最后转入地衣芽孢杆菌中得到重组地衣芽孢杆菌。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌保藏编号为Bacillus licheniformis ATCC14580, Bacillus licheniformis ATCC12759, Bacillus licheniformis ATCC9945, Bacillus licheniformis ATCC13438或Bacillus licheniformis ATCC9259中得至少一种。
6.一种如权利要求2所述的重组地衣芽孢杆菌应用，其特征在于，用于发酵生产麦芽三糖淀粉酶。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵培养基为：20g /L蛋白胨FP321，10 g/L酵母粉FM408，5g /L玉米浆干粉，70-90g /L碳源，9.12g /L K2HPO4·3H2O，1.36g /LKH2PO4，0.50g /L CaCl2，0.50g /L MgSO4·7H2O，10g /L (NH4)2HPO4；发酵温度为25-42℃，发酵时间12-72h。
8.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于，所述碳源为葡萄糖、蔗糖、木糖或麦芽糊精中的至少一种。
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