CN113817736B - 一种具有群体感应特征的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有群体感应特征的启动子及其应用，具有与SEQ ID NO.1所示的序列同源性≥95％的核酸序列，本发明提供的启动子Ptr1来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis BL2)。本发明所述启动子具有前期(1‑5h)表达极弱，后期(16‑48h)表达脉冲型增长的特性，是响应群体密度的自诱导高效表达系统。本发明提供的启动子确保细菌种群达到一定数量后才产生目标产物，无需添加诱导剂，保证了细胞在“生长”与“生产”两相之间进行适时的转变。

Description

一种具有群体感应特征的启动子及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种具有群体感应特征的启动子及其应用。

背景技术

地衣芽孢杆菌是工业产品的重要生产菌株，它能够高效合成蛋白，培养条件较为简单，且是食品安全菌株，自1972年起，它就已经被安全地用于淀粉酶的大规模工业生产。同时地衣芽孢杆菌还能产生丰富的次级代谢产物，如脂肽类化合物、羊毛硫抗生素等，极具研究价值和潜力。但地衣芽孢杆菌中高效表达元件严重匮乏等问题，也限制了其应用价值。目前对地衣芽孢杆菌等芽孢杆菌的表达元件开发主要集中在高效启动子的筛选方面。目前芽孢杆菌中常见的诱导型启动子有Pgrac(IPTG诱导)、PspaS(枯草菌素诱导)、PxylA(木糖诱导)、Pglv(麦芽糖诱导)和PsacB(蔗糖诱导)，常见的组成型启动子有P43、 Pshuttle-09等。

由于发酵过程的多样性和复杂性，目前的组成型启动子和诱导型启动子在应用中仍存在如：诱导剂成本较高，组成型启动子无法在特定条件下开启等问题。已有研究挖掘和开发具有更多样化的启动子，如Yu.等采用基于基因组规模微阵列的方法来鉴定启动子，鉴定出在不存在诱导剂的情况下，能够在平衡期高水平表达靶基因的启动子Pylb，以实现平衡期目标产物的高效生产；Yule Yue Wang 等在枯草芽孢杆菌发现了高效启动子vegGP，并实现了该启动子在大肠杆菌中异源基因的分级表达；Lu Xiao等克隆了解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因的启动子和信号肽编码序列，并将其融合到编码枯草杆菌蛋白酶DFE的前肽和成熟肽的序列上，实现了枯草杆菌蛋白酶的高效表达。

群体感应是细胞种间的一种交流方式，能够使细胞在达到一定种群数量后改变群体的基因表达，即在低细胞密度时目的基因不表达，高细胞密度时目的基因开启表达，是一种基于细胞密度的自诱导系统。群体感应系统的调控与表达与发酵工程对动态代谢产物调控的需求相契合，且其开启表达不需要诱导剂。与组成型启动子不同，这类表达元件确保细菌种群达到一定数量后才产生目标产物，保证了细胞在“生长”与“生产”两相之间进行适时的转变。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均存在QS系统，如费氏弧菌(Vibrio fischeri)中的LuxI/LuxR系统，和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的Agr系统，都是较为典型的QS系统。QS系统常常包括一个操纵子(包含四个基因)和一个多个受调控的启动子。如金黄色葡萄球菌中Agr QS系统调控元件为agrABCD四个基因，其中agrD编码自诱导肽，agrB编码加工、转运蛋白，使自诱导肽成为成熟的AIP信号分子，agrCA是双组分磷酸激酶系统(TCS)，当胞外信号分子达到一定浓度时识别并传递信号，从而结合在启动子P2和P3上，从而开启调控元件自身的表达和毒力基因的表达。

ComP-ComA系统和Phr-Rap系统是枯草芽孢杆菌内源的QS系统，其中 ComP-ComA系统参与调控多个细胞行为，包括菌体感受态形成、生物膜的形成、胞外降解酶产生、抗生素和胞外多糖的产生、脂肪酸的代谢和运输等行为。在 ComP-ComA系统中，随着细胞的生长，两种信号肽ComX和CSF积累到阈值水平，以激活由双组分调节蛋白ComP和ComA组成的信号转导系统。最后，磷酸化的ComA与srf操纵子(PsrfA)的启动子结合以启动下游基因的转录。近年来，群体感应系统中的启动子作为一种新型表达元件，引入到合成生物学的工程应用研究，并且将其广泛运用在医学、工业、环境等应用领域，如 Chengran Guan等开发了一种包含srfA启动子(PsrfA)的自动诱导表达系统，并P23启动子表达系统，使其在不能形成孢子的枯草芽孢杆菌突变株中实现高细胞密度发酵。

目前地衣芽孢杆菌内源具有群体感应特性的启动子未见报道。地衣芽孢杆菌作为一种优良的工业菌株，开发其内源表达元件，扩展其启动子文库具有较大意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种具有群体感应特征的启动子及其应用。本发明启动子是一种不依赖诱导剂，可以自发动态调节目的基因表达的群体感应表达元件。本发明通过将具有群体感应特征的启动子构建到表达载体上，构建地衣芽孢杆菌群体感应表达系统，当细胞到达一定密度时表达元件才开始表达，避免诱导剂的添加，节约发酵成本，简化发酵流程。

本发明的技术方案如下：

一种具有群体感应特征的启动子，具有与SEQ ID NO.1所示的序列同源性≥ 95％的核酸序列。

具体的，SEQ ID NO.1的序列为:

5’-TTTATGTATAGATATTTTCGAATATTTAACTTATTGGACACAATAATTTT GAAATAGGGCATTTTGCACAAGAAATAATCCAAAATAGCCCAAAAATAA TCCAACAATTCTAATTATTGTTATAATAATGCTGAGCTCCCAAAATTAATTAA GAGGTGAAGGAAA-3’。

进一步的，上述具有群体感应特征的启动子，来源于地衣芽孢杆菌基因组。

进一步的，所述地衣芽孢杆菌为Bacillus licheniformis BL-2。

进一步的，上述具有群体感应特征的启动子，所述启动子具有前期表达弱，后期表达脉冲型增长的特性。

进一步的，上述具有群体感应特征的启动子，所述前期为菌体培养≤5h，所述后期为菌体培养≥16h，所述启动子的表达强度峰值不低于组成型启动子 Pshuttle-09的30倍。

一种表达载体，包含所述的具有群体感应特征的启动子。

优选的，所述的表达载体将基于一种具有群体感应特征的启动子构建到表达载体上便于在微生物体内复制以及表达。

优选的，表达载体为pHY300。

一种基因工程菌，包含上述具有群体感应特征的启动子或者上述表达载体。

进一步的，上述基因工程菌利用具有群体感应特征的启动子实现当细胞达到一定密度后，开启绿色荧光蛋白表达的功能。

优选的，所述绿色荧光蛋白为eGFP。

进一步的，上述一定密度为菌体OD600值≥6。

进一步的，上述基因工程菌来源于地衣芽孢杆菌。

进一步的，上述具有群体感应特征的启动子在无诱导剂的高密度发酵中的应用。

本发明有益的技术效果在于：

本发明克服现有发酵过程中对诱导剂的依赖，提供一种地衣芽孢杆菌内源的具有群体感应特征的启动子及其应用。本发明提供了Ptr1启动子基因序列、各组件构建方法与转入工程菌的方法、基于地衣芽孢杆菌表达系统的工作途径与具体应用；具体为：

1.本发明具体通过一种具有群体感应特征的启动子和表达载体pHY300，构建优良的高表达系统。

2.本发明所述一种具有群体感应特征的启动子，具有前期(0-5h)表达极弱，后期(16-48h)表达脉冲型增长的细胞密度依赖型特性。

3.本发明所述一种具有群体感应特征的启动子，具有前期(5h)相对转录强度极弱，达到一定密度后(16h)开始转录，且转录强度在30h、48h持续较高的特性。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明首次在地衣芽孢杆菌中发现了内源的具有群体感应特征的启动子，并将其开发成表达系统，增加了对地衣芽孢杆菌群体感应系统调控的认知，为优良标准化生物元件的开发提供了一定的基础。

本发明构建了一种基于地衣芽孢杆菌群体感应系统的表达系统。该表达系统是响应群体密度的自诱导高效表达系统，其确保细菌种群达到一定数量后才产生目标产物，无需添加诱导剂，保证了细胞在“生长”与“生产”两相之间进行适时的转变。

附图说明

图1为重组质粒Ptr1-eGFP(图中为PIIY-300)和Pshuttle-09-eGFP(图中为 PHY-300)重组质粒图谱及酶切验证；

图2为四个时间点(5h、16h、30h、48h)Ptr1表达系统荧光蛋白相对转录强度测定；

图3为四个时间点(5h、16h、30h、48h)Ptr1表达系统荧光蛋白表达强度测定。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。本发明中所述的适量，为本领域内普通技术人员根据国家技术规范和生产实际情况所决定的用量。本发明中所述的原料如无特殊说明，均为商业购得。

实施例1

以荧光蛋白作为报告基因的表达系统构建

1.菌株、质粒和培养条件

Bacillus licheniformis BL-2(实施例1-2所述的地衣芽孢杆菌BL-2，公开于发明专利CN201210551735.4一株具有絮凝作用的高产纤维素酶地衣芽孢杆菌及其应用，所述菌株一直保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，可供公众获得，保藏编号：CCTCC M2012458，保藏地址：中国，武汉，武汉大学。)；Escherichia coli BL21(DE3)；质粒pET28a、质粒pHY300。所涉及到的重组菌株均在37℃， 250rpm培养。

抗生素终浓度为：卡那霉素(Kana)100μg/mL，氨苄青霉素(Amp)100μg/mL，四环素(Tet)20μg/mL。

2.培养基

种子培养基:10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母膏。

发酵培养基：12g/L蛋白胨，24g/L酵母膏，16.427g/L NaH₂PO₃·3H₂O， 2.31g/LNa₂HPO₃。

地衣芽孢杆菌电转化用培养基：

培养基A：10g/L蛋白胨，10g/L NaCl，5g/L酵母膏，0.5mol/L山梨醇。

培养基BR：LB培养基加入0.5molL-1山梨醇和0.38mol/L甘露醇。

3.pHY300-eGFP报告载体的构建

引物设计：

rpHY-F 5’-GTCGACGGATCCCCGGG-3’＝SEQ ID NO.2

rpHY-R 5’-GGGCAAAGCGTTTTTCCATAGGC-3’＝SEQ ID NO.3

eGFP-F 5’-TATGGAAAAACGCTTTGCCCATGGGTCGCGGATCCATGG-3’＝SEQ ID NO.4

eGFP-R 5’ATTCCCGGGGATCCGTCGACTCACACGTGGTGGTGGTGGT-3’＝SEQ ID NO.5

利用常规PCR扩增pHY质粒骨架以及eGFP基因片段，使用ClonExpress II OneStep Cloning Kit(Vazyme，南京)将上一步骤中扩增获得的EGFP基因片重组至pHY载体片段上，获得质粒pHY eGFP。

4.Ptr1启动子及对照组成型启动子Pshuttle-09重组质粒构建

引物设计：

TR1-F 5’-CCGCTCGAGTTTATGTATAGATATTTTCGAATATTTAACTTATTGGACA-3’＝SEQ IDNO.6

TR1-R 5’-CCCAAGCTTTTTCCTTCACCTCTTAATTAATTTTGGG-3’＝SEQ ID NO.7

S09-F 5’-TCGACGGATCCCCGCTCTAGAGATCGTCACAATGCGCCATCAAA-3’＝SEQ ID NO.8

S09-R 5’-TGAACTTAACCATGCTCTAGAGGATCCCACTTTATGGACGCCG-3’＝SEQ ID NO.9

利用常规PCR扩增来源于地衣芽孢杆菌的启动子Ptr1基因片段及组成型启动子Pshuttle-09基因片段：使用引物TR1-F/TR1-FR扩增Ptr1基因片段，使用引物S09-F/S09-R扩增Pshuttle-09基因片段。纯化回收得到目的片段。

使用ClonExpress II One Step Cloning Kit(Vazyme，南京)同源重组反应， 37℃金属浴反应45min,将扩增的启动子片段连接到线性化的载体pHY-egfp 上。放置于冰上冷却，转化E.coliJM109，涂布Amp抗性平板，挑取阳性转化子。接菌到15mL的LB培养基中，提取质粒，酶切验证，送测序，结果正确。获得重组表达质粒pHY Ptr1-eGFP和pHYPshuttle09-eGFP。(见图1)。

5.重组菌株构建

将地衣芽孢杆菌平板活化后接种于15mL的LB培养基中，37℃，250rpm 条件下过夜培养。取1mL种子液转接到30mL培养基A中，同样的条件下培养4.5h，冰浴15min，6 000rpm离心10min收集菌体。用缓冲液BW洗涤菌体3次,用750μL缓冲液重悬菌体，分装并且低温保存。将重组质粒加到地衣芽孢杆菌感受态中，将细胞转至电转杯中。使用电转化仪2 000V开始电击，电击后立即加入800μL的培养基BR。37℃，100rpm后培养，涂布平板。挑取转化子，PCR验证正确后，获得重组菌株。

实施例2

Ptr1启动子特性研究(表达菌株为Bacillus licheniformis BL-2)

以荧光蛋白基因eGFP作为报告基因，对照为芽孢杆菌中典型的强组成型启动子Pshuttle-09，考察表达元件Ptr1荧光蛋白转录表达特性。选定细胞生长阶段的重要时间点5h、16h、30h和48h，测定其荧光蛋白的转录特性和表达特性。

1.荧光蛋白转录强度测定

相对转录强度测定方法为：采用BioFlux SimplyP总RNA提取试剂盒提取总RNA；然后，将提取好的RNA用反转录试剂Gdna Eraser消除可能残余的基因组DNA后，反转录成cDNA，经微量紫外分光光度计定量，使浓度约在200ng/ μL左右；以cDNA为模板，以rspE为内参基因，eGFP为目的基因，之后采用 SYBR Premix ExTaq II在荧光定量PCR仪检测系统CFX96上进行qPCR。其中退火温度为60℃，条件如下：循环1次(95℃，30s)，循环39次(95℃，5s；60℃，30s)，结束时采集数据。采用Bio-Rad CFX Manager分析RT-qPCR 数据。采用2-ΔΔCq法计算启动子基因的相对表达量。相对表达量＝2-[(A-B)-(C-D)]，式中，A为待测组目标基因，B为待测组目标基因，C为对照组目标基因，D为对照组内参基因.分别为平均Cq值。

其转录特性为(见图2)：在5h时，Ptr1几乎没有转录，而Pshuttle-09转录较高；到16h时，Ptr1开始表现出极强的转录强度，而Pshuttle-09保持较高的转录强度；到30h之后，Ptr1仍保持较高的转录强度，而Pshuttle-09转录强度逐渐下降，直至几乎没有转录强度。

2.荧光蛋白表达强度测定

荧光蛋白表达测定方法为：摇瓶培养到某时间点时，取样于1.5ml EP管中，12000g离心弃上清，加入0.9％NaCl溶液重悬菌体。重复两次。处理后的样品吸取200uL于黑色96孔板，立即于酶标仪测量其荧光强度。测量时，激发波长设为485nm，发射波长设为535nm，增益值设为100，检测获得总荧光强度，其单位荧光强度＝总荧光强度/OD600，通过单位荧光强度的大小来表征荧光蛋白的表达情况。

其荧光蛋白表达特性为(图3)：与细胞密度(OD600)变化相对照可以看出，Ptr1在0-16h几乎没有荧光强度，16h后，荧光强度开始持续上升，30h后出现极为显著的增长，48h后荧光强度达到一个极高的数值，增长变缓，表明细胞需生长到OD600＝6时，启动子Ptr1才开启表达。而对于对照Pshuttle-09，则在对数增长期5h就能检测到较强荧光强度，且荧光持续增长，在30h后开始呈现下降趋势。启动子Ptr1的表达与细胞密度有关，当细胞达到一定密度时才会开启表达，并呈现后期脉冲表达特点。

综合上述实施例1-2，可以发现，本发明克服现有发酵过程中对诱导剂的依赖，提供一种地衣芽孢杆菌内源的具有群体感应特征的启动子及其应用。本发明提供了Ptr1启动子基因序列、各组件构建方法与转入工程菌的方法、基于地衣芽孢杆菌表达系统的工作途径与具体应用；具体为：

1.本发明具体通过一种具有群体感应特征的启动子和表达载体pHY300，构建优良的高表达系统。

2.本发明所述一种具有群体感应特征的启动子，具有前期(0-5h)表达极弱，后期(16-48h)表达脉冲型增长的细胞密度依赖型特性。

3.本发明所述一种具有群体感应特征的启动子，具有前期(5h)相对转录强度极弱，达到一定密度后(16h)开始转录，且转录强度在30h,48h持续较高的特性。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，不能以此限定本发明的保护范围，即大凡依本发明权利要求书及发明内容所做的简单的等效变化与修改，皆仍属于本发明专利申请的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种具有群体感应特征的启动子及其应用

<130> 2021

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

tttatgtata gatattttcg aatatttaac ttattggaca caataatttt gaaatagggc 60

attttgcaca agaaataatc caaaatagcc caaaaataat ccaacaattc taattattgt 120

tataataatg ctgagctccc aaaattaatt aagaggtgaa ggaaa 165

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工

<400> 2

gtcgacggat ccccggg 17

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工

<400> 3

gggcaaagcg tttttccata ggc 23

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工

<400> 4

tatggaaaaa cgctttgccc atgggtcgcg gatccatgg 39

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工

<400> 5

attcccgggg atccgtcgac tcacacgtgg tggtggtggt 40

<210> 6

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工

<400> 6

ccgctcgagt ttatgtatag atattttcga atatttaact tattggaca 49

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工

<400> 7

cccaagcttt ttccttcacc tcttaattaa ttttggg 37

<210> 8

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工

<400> 8

tcgacggatc cccgctctag agatcgtcac aatgcgccat caaa 44

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工

<400> 9

tgaacttaac catgctctag aggatcccac tttatggacg ccg 43

Claims (9)

1.一种具有群体感应特征的启动子，其特征在于，所述启动子的核酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一种具有群体感应特征的启动子，其特征在于，所述启动子来源于地衣芽孢杆菌基因组。

3.根据权利要求1所述的一种具有群体感应特征的启动子，其特征在于，所述启动子具有前期表达弱，后期表达脉冲型增长的特性。

4.根据权利要求3所述的一种具有群体感应特征的启动子，其特征在于，所述前期为菌体培养≤5h，所述后期为菌体培养≥16h，所述启动子的表达强度峰值不低于组成型启动子Pshuttle-09的30倍，所述菌体为地衣芽孢杆菌。

5.一种表达载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的具有群体感应特征的启动子。

6.一种基因工程菌，其特征在于，包含如权利要求1所述的具有群体感应特征的启动子或者如权利要求5所述的表达载体。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌利用具有群体感应特征的启动子实现当细胞达到一定密度后，开启绿色荧光蛋白表达的功能。

8.根据权利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述一定密度为菌体OD600值≥6，所述基因工程菌来源于地衣芽孢杆菌。

9.如权利要求1-4任一项所述的具有群体感应特征的启动子在无诱导剂的高密度发酵中的应用。