KR20210144816A - 키메라 플라스미드 라이브러리의 구축 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 장쇄 DNA의 조합 라이브러리를 효율적으로 구축할 수 있고, 얻어진 클론의 유전자형 확인이 용이한 신규 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법을 제공하는 것을 과제로 한다. 본 발명은, 숙주 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA와, 단위 DNA가 연결된 삽입 DNA를 포함하는 삽입 DNA 유닛을 적어도 하나 갖는 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법으로서, (A) 특정한 연결 순서로 연결할 수 있는 복수 종류의 단위 DNA를 연결시킨 삽입 DNA 유닛을 포함하는 플라스미드를 OGAB법에 의해 복수 종류 조제하는 공정, (B) 공정 (A)에서 조제한 복수 종류의 플라스미드를 각각에게 적합한 제한 효소로 처리하여, 단위 DNA로 분해하고, 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 조제하는 공정, 및 (C) 공정 (B)에서 얻어진 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 사용하여, OGAB법에 의해 단위 DNA를 재집적시켜, 장쇄 DNA 단편을 조제하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법이다.

Description

키메라 플라스미드 라이브러리의 구축 방법

본 발명은, 신규 키메라 플라스미드 라이브러리의 구축 방법에 관한 것이다.

합성 생물학의 진전에 따라, 복수의 유전자를 연결한 장쇄 DNA의 수요가 증가하고 있다. 장쇄 DNA의 서열 설계에 있어서는, 사용하는 유전자 종류의 선택지나 그 유전자의 발현 강도의 선택지 등, 필연적으로 다수의 발현 파라미터를 검토할 필요가 있기 때문에, 한번의 서열 설계에 의해 목적으로 하는 결과를 달성할 수 있는 가능성은 낮다. 그래서, 대부분의 경우, 최초에 설계(Design)하고, 구축(Build)한 장쇄 DNA를 평가(Test)하고, 그 내용에 대해서 검토(Learn)를 행하고, 이 발견에 기초한 새로운 DNA를 구축한다고 하는 DBTL 사이클(Design-Build-Test-Learn 사이클)을 실행하는 것이 전제가 된다. 이 DBTL 사이클에서 다수의 발현 파라미터를 동시에 검토하기 위해서는, 각 발현 파라미터에 대해서 복수의 선택지가 존재하는 것 중에서 하나를 선택하고, 각각을 연결하여 다종의 장쇄 DNA를 구축하는 조합 라이브러리 기술이 효율성의 관점에서 바람직하다. 즉, 단일의 장쇄 DNA만을 구축하여 평가하는 것 보다, 각 발현 파라미터에 다양성이 있는 복수 종류의 장쇄 DNA를 동시 병행으로 구축하여 비교하는 것이, 각 발현 파라미터에 대한 DNA 설계의 방향성을 짧은 사이클로 유도하기 쉽다.

그러나, 일반적으로 장쇄 DNA의 합성에는, 금전 비용, 시간 비용이 들어 복수의 장쇄 DNA를 구축하는 것이 곤란한 경우가 많다. 장쇄 DNA 구축에 있어서는, 화학 합성에 의해 조달할 수 있는 DNA의 길이가 200 염기 정도로 짧은 것 등의 이유에 의해, 유전자의 기능 단위 등을 지표로 한 짧은 DNA 단편을 다수 준비하고, 이것을 연결(집적)함으로써 구축하는 다중 유전자 단편 집적 기술이 사용되고 있다. 이러한 DNA 단편의 집적 방법으로서는, OGAB법(특허문헌 1:일본 특허 공개 제2004-129654호 공보, 비특허문헌 1: Tsuge,K.,et al.,Nucleic Acids Res.31,e133(2003))), SLIC법(비특허문헌 2: Li MZ, Elledge SJ(2007) Nature Methods 4:251-256), Golden Gate법(비특허문헌 3: Engler,C.et al. PLoS ONE(2008)), Gibson Assembly법(비특허문헌 4: Gibson, D. G.,et al. Nat. Methods,6,343-345.(2009)), LCR법(비특허문헌 5: de Kok,S.et al.ACS Synth.Biol.(2014)), 출아 효모의 유전자 집적법(비특허문헌 6: Gibson, D. G., et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 6, 105, 20404-20409, 2008)등 다양한 방법이 개발되어 있다.

복수 종류의 장쇄 DNA를 저비용으로 간편하게 조달하기 위해서는, 이 유전자 집적 시에 사용하는 짧은 DNA 단편에 발현 파라미터가 다른 것을 동시에 복수개 준비하고, 이것을 조합적으로 연결하는 조합 라이브러리를 제작하는 것을 생각할 수 있다. 상기의 유전자 집적법에서도, 조합 라이브러리를 구축하는 방법이 개발되어 있다.

또한, 이들 방법에 의해 조달된 장쇄 DNA의 조합 라이브러리를 Test하고, 발현 파라미터의 설계 방향성을 Learn할 때에는, 장쇄 DNA의 유전자형과 그 표현형을 대응지을 필요가 있다. 종래의 조합 라이브러리의 구축에 있어서는, 크게 구별하면 2개의 방법이 있다. 첫번째는, 하나의 유전자 집적에 있어서, 1종류의 장쇄 DNA를 구축하는 방법이다. 이 경우, 각각 재료가 다른 유전자 집적을 조합 라이브러리의 규모 수만큼 개별적으로 행하게 된다. 어느 유전자 집적이 어느 유전자형이 되는지를 사전에 파악할 수 있기 때문에, TEST에서 유전자형을 다시 확인하지 않아도 표현형과의 대응을 신속하게 취할 수 있다고 하는 장점은 있지만, 대규모화가 곤란하다고 하는 단점이 있다. 두번째는, 조합 라이브러리에 사용하는 모든 재료를 혼합하고, 1회의 유전자 집적에 의해 라이브러리를 구축하는 방법이다. 이 방법에서는, 대규모 조합 라이브러리가 얻어지기 쉽다고 하는 장점이 있다. 그러나, 이 라이브러리로부터 선발된 클론이 어느 유전자형을 가지고 있는지는, 개별적으로 시퀀싱에 의해 염기 서열을 확인할 필요가 있는데, 장쇄 DNA가 되면 될수록 염기 서열의 확인에 시간이 걸리기 때문에, TEST가 율속 단계가 된다는 문제점이 있었다.

일본 특허 공개 제2004-129654호 공보(일본 특허 제4479199호)

Tsuge, K., et al., Nucleic Acids Res. 31, e133, 2003 Li MZ, Elledge SJ, Nature Methods 4:251-256, 2007 Engler, C. et al. PLoS ONE, 2008 Gibson, D. G., et al. Nat. Methods, 6, 343-345., 2009 de Kok, S. et al. ACS Synth. Biol., 2014 Gibson, D. G., et al. Proc. Nat.Acad. Sci. USA 6, 105, 20404-20409, 2008

이러한 상황 속에서, 본 발명은, 장쇄 DNA의 조합 라이브러리를 효율적으로 구축할 수 있으며, 또한, 율속 단계가 되는 염기 서열의 확인을 하지 않고도 신속하게 다음 DBTL 사이클을 위한 장쇄 DNA의 조합 라이브러리를 준비 가능한, 신규한 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

장쇄 DNA의 조합 라이브러리 구축을 효율적으로 행하기 위해서는, 상술한 바와 같이 다중 유전자 단편 집적 기술을 사용하는 것이 바람직한데, 유전자 집적 기술의 여하를 불문하고, 집적 대상의 유전자 단편이 과부족 없는 상태, 즉 각 유전자 단편의 몰 농도가 동일한 것이 중요하다. 그러나, 특히 10을 초과하는 것과 같은 많은 유전자 단편의 몰 농도를 동일한 몰 농도로 조정하는 것은 곤란하기 때문에, 유전자 집적 기술을 이용하여 고효율로 다수의 선택지로 이루어지는 조합 라이브러리를 구축하는 것은 곤란하였다.

통상, 유전자 집적을 행하기 위한 재료가 되는 유전자 단편의 준비는, 단편마다 하나씩 행할 필요가 있으며, 또한, 이러한 단편을 등몰 농도 통합할 때에는, DNA의 중량 농도를 측정하고, DNA 단편의 길이를 바탕으로 계산을 하여 첨가량을 정하는데, DNA 농도의 측정 오차나, DNA의 피펫팅의 오차 등으로부터, 정확하게 등몰 통합하는 것은 매우 곤란하였다. 한편, 한번 집적하여 플라스미드 상태가 된 집적체를 제한 효소로 절단하면 원래의 재료로 환원되는 경우는, 얻어진 재료가 이상적인 등몰 상태로 된다. 본 발명자들은, 실제로 이것을 사용하여 다시 집적을 행하면, 상술한 사람 손으로 DNA 단편을 통합하여 집적하는 경우와 비교하여 100배 이상 집적 효율이 향상되는 것을 발견하였다(Tsuge, NAR, 2003). 또한, 제한 효소로 절단하면 선택지 단편으로 분해되는 집적체의 경우는, 그 선택지 단편의 염기 서열이 동정되지 않아도, 실물의 DNA가 존재하면, 이것을 마찬가지로 준비된 다른 집적체 유래의 선택지 단편과 혼합함으로써 조합 라이브러리를 구축하는 것이 가능해진다. 본 발명자들은, 이 결과에 착상을 얻어 본 발명의 고효율적인 장쇄 DNA 조합 라이브러리 구축법을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토한 결과, 고초균의 플라스미드 형질 전환계를 이용한 유전자 집적법(OGAB법)에서, 조합 라이브러리의 집적에 사용하는 모든 DNA 단편의 몰 농도 비율이 가능한 한 1에 가깝도록 하기 위하여 상기 방법을 채용하였다. 구체적으로는, 조합화의 대상으로 되는 선택지 유전자 단편을 대충 연결한 종 플라스미드(seed plasmid)를 구축한다. 그리고, 다른 선택지 유전자 단편에 대해서도, 별도의 종 플라스미드를 구축함으로써, 선택지의 최대수와 동일한 수의 종 플라스미드를 준비한다. 각 종 플라스미드를 제한 효소로 절단함으로써, 일단 유전자 단편이 등몰로 혼합된 용액을 얻는다. 이 용액은, 다른 종 플라스미드와 혼합해도 등몰성이 유지된다. 그 후, 이러한 용액이 포함하는 각종 유전자 단편을 직선상으로 연결함으로써, 플라스미드 벡터 부분이 주기적으로 출현하는 의사 탠덤 반복(tandem repeat) 상태의 고분자 DNA를 얻고, 이것을 사용하여 고초균을 형질 전환한다. 고초균체 내에서 플라스미드 벡터 부분의 상동성을 이용하여 환상화함으로써 조합 라이브러리를 효율적으로 구축한다.

이 방법에 의하면, 조합 라이브러리의 구축에 필요한 등몰 농도의 유전자 단편을 매우 간편하게 또한 확실하게 준비할 수 있고, 라이브러리의 구축 규모를 종래에 없이 대규모로 할 수 있다고 하는 특징이 있다. 또한, 이 방법에 의하면, 얻어진 플라스미드의 유전자형 확인을 하지 않고도 다음 사이클의 장쇄 DNA의 조합 라이브러리를 구축 가능하다. 즉, 본 발명의 요지는 이하와 같다.

[1] 숙주 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA와, 단위 DNA가 연결된 삽입 DNA를 포함하는 삽입 DNA 유닛을, 적어도 하나 갖는 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법으로서,

(A) 특정한 연결 순서로 연결할 수 있는, 복수 종류의 단위 DNA를 연결시킨, 삽입 DNA 유닛을 포함하는 플라스미드를, OGAB법에 의해 복수 종류 조제하는 공정,

(B) 공정 (A)에서 조제한 복수 종류의 플라스미드를, 각각에게 적합한 제한 효소로 처리하여, 단위 DNA로 분해하고, 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 조제하는 공정, 및

(C) 공정 (B)에서 얻어진 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 사용하여, OGAB법에 의해 단위 DNA를 재집적시켜, 장쇄 DNA 단편을 조제하는 공정

을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.

[2] 공정 (B)에서 얻어지는 단위 DNA 혼합액에 있어서의, 모든 DNA 단편의 몰 농도 비율이 0.8 내지 1.2인 것을 특징으로 하는, [1]에 기재된 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.

[3] 공정 (A)에 있어서, 한가지 종류의 삽입 DNA 유닛이 포함하는 단위 DNA의 종류가, 3 내지 60종류인 것을 특징으로 하는, [1] 또는 [2]에 기재된 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.

[4] 공정 (B)에서 사용하는 제한 효소가 3종 이하인, [1] 내지 [3] 중 어느 것에 기재된 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.

[5] 상기 제한 효소가, 돌출 말단을 생성하는 제한 효소인, [1] 내지 [4] 중 어느 것에 기재된 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.

[6] [1] 내지 [5] 중 어느 것에 기재된 조제 방법에 의해 얻어진 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편을 포함하는 플라스미드.

[7] 숙주 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA와, 단위 DNA가 연결된 삽입 DNA를 포함하는 삽입 DNA 유닛을, 적어도 하나 갖는 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법으로서,

(B') [6]에 기재된 복수 종류의 플라스미드를, 각각에게 적합한 제한 효소로 처리하여, 단위 DNA로 분해하고, 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 조제하는 공정, 및

(C) 공정 (B')에서 얻어진 단위 DNA 혼합액을 사용하여, OGAB법에 의해 단위 DNA를 재집적시켜, 장쇄 DNA 단편을 조제하는 공정

을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.

[8] 얻어진 장쇄 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 복수 종류 선택하고, 공정 (B')에서의 플라스미드로서 재이용하는 것을 특징으로 하는, [7]에 기재된 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.

[9] [1] 내지 [5], [7], [8] 중 어느 것에 기재된 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법을 사용하는 키메라 플라스미드 라이브러리의 구축 방법.

본 발명에 의하면, 장쇄 DNA의 조합 라이브러리를 신속하며 효율적으로 구축하는 것이 가능해진다. 또한, 동일한 라이브러리로부터 선택된, 염기 서열을 확인하지 않은 복수의 플라스미드를, 새로운 키메라 라이브러리 구축을 위하여 재이용하는 것이 가능하다.

도 1은, 집적용 플라스미드 벡터 pGETS302-SfiI-pBR의 구조를 도시하는 도면이다.
도 2는, 삽입 유닛을 구성하는 단위 DNA의 상세 구조를 도시하는 도면이다.
도 3은, 이소부탄올을 고생산하기 위하여 디자인된 출아 효모의 인공적인 대사 경로를 도시하는 도면이다.
도 4는, 본 발명의 키메라 플라스미드 라이브러리의 구축 방법을 모식적으로 도시하는 도면이다.
도 5는, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 1회째의 키메라 플라스미드 라이브러리 중의 각 플라스미드 있어서의 단위 유전자의 방향과 이소부탄올 생산량을 도시하는 도면이다.
도 6은, 형질 전환에 사용한 플라스미드를 종 플라스미드로 하는, 새로운 조합 라이브러리의 구축 공정을 도시하는 도면이다.
도 7은, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 2회째의 키메라 플라스미드 라이브러리 중의 각 플라스미드에 있어서의 단위 유전자의 방향과 이소부탄올 생산량을 도시하는 도면이다.

이하, 본 발명에 대하여 상세하게 설명한다. 또한, 본 명세서에 있어서, 분자 생물학적 방법은 특별히 명기하지 않는 한 당업자에게 공지된 일반적 실험서에 기재된 방법 또는 그것에 준한 방법에 의해 행할 수 있다. 또한, 본 명세서 중에서 사용되는 용어는, 특별히 언급하지 않는 한, 당해 기술 분야에서 통상 사용되는 의미로 해석된다.

<미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법>

본 발명은, 장쇄 DNA의 조합 라이브러리를 효율적으로 구축할 수 있고, 얻어진 클론의 유전자형 확인을 하지 않고도 새로운 조합 라이브러리의 구축이 용이한, 신규 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 숙주 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA와, 단위 DNA가 연결된 삽입 DNA를 포함하는 삽입 DNA 유닛을, 적어도 하나 갖는 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법으로서,

(A) 특정한 연결 순서로 연결할 수 있는, 복수 종류의 단위 DNA를 연결시킨 삽입 DNA 유닛을 포함하는 플라스미드를 OGAB법에 의해 복수 종류 조제하는 공정,

(B) 공정 (A)에서 조제한 복수 종류의 플라스미드를, 각각에게 적합한 제한 효소로 처리하여, 단위 DNA로 분해하고, 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 조제하는 공정, 및

(C) 공정 (B)에서 얻어진 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 사용하여, OGAB법에 의해 단위 DNA를 재집적시켜, 장쇄 DNA 단편을 조제하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서는, 숙주 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA(플라스미드 벡터)와, 삽입 DNA를 포함하는 삽입 DNA 유닛을, 교대로 연결할 수 있는 구조를 갖는 복수의 단위 DNA로서 조제하고, 해당 단위 DNA를 연결하여, 삽입 DNA 유닛을 적어도 하나 가지며, 또한 동일한 단위 DNA를 적어도 2개 갖는 DNA 단편을 제작한 후에, 해당 DNA 단편과 숙주 미생물의 컴피턴트 세포(competent cell)와 공배양하고, 해당 미생물로부터 플라스미드 DNA를 회수함으로써 조합 라이브러리를 조제하고, 조합 라이브러리로부터 선발된 플라스미드 DNA를 새로운 라이브러리의 종 플라스미드로서 이용하는 것이 가능한 방법이다.

본 발명에 있어서, 삽입 DNA 유닛이란, 숙주 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA와 삽입 DNA를 포함하는 단위를 말한다. 또한, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편은, 삽입 DNA 유닛을 1개 이상 포함하고 있다. 또한, 삽입 DNA 유닛에는, 숙주 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA와 삽입 DNA 이외에도, 필요에 따라서 적당한 염기 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어 본 발명의 방법에 의해 삽입 DNA에 포함되는 유전자를 발현하기 위한 플라스미드를 제작하는 경우에는, 프로모터나 오퍼레이터, 액티베이터, 터미네이터와 같은 전사 번역을 제어하는 염기 서열을 포함해도 좋다. 효모를 숙주로 했을 경우의 프로모터로서, 구체적으로는, 해당계 등의 1차 대사 산물의 프로모터 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 숙주 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA란, 제작되는 DNA 단편으로 형질 전환될 수 있는 미생물 중에서 DNA의 복제가 이루어지는 것이면, 어떠한 것이어도 좋다. 본 발명의 숙주 미생물로서는, Bacillus속 세균이 사용되지만, 구체적인 미생물과, 해당 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA로서, 예를 들어 B. subtilis(고초균)의 경우는 θ형의 복제 기구를 갖는 것으로, 구체적으로는, pTB19(Imanaka, T., et al. J. Gen. Microbioi. 130, 1399-1408. (1984))나 pLS32(Tanaka, T and Ogra, M. FEBS Lett. 422, 243-246. (1998), pAMβ1(Swinfield, T. J., et al. Gene 87, 79-90. (1990)) 등의 플라스미드에 포함되는 복제 개시점 등의 서열을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 삽입 DNA란, 클로닝하고자 하는 DNA이며, 그 종류나 크기는 특별히 한정되지 않는다. DNA의 종류는, 원핵 생물, 진핵 생물, 바이러스 등의 천연 유래 서열뿐만 아니라, 인공 설계 서열 등 어느 것이어도 좋으며, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 일련의 대사 경로를 구성하는 유전자군이나, 숙주 게놈에 존재하는 유전자 발현의 불활성화를 목적으로 한 안티센스 RNA 유전자군이나, 대사 경로 유전자군과 안티센스 RNA군의 양쪽이 혼입된 것 등을 들 수 있다. 본 발명의 삽입 DNA는 단위 DNA가 연결된 구조를 갖는다.

본 발명에 있어서 단위 DNA란, 서로 그 순서를 유지한 채 반복 연결할 수 있는 구조를 가지고 있으며, 차례로 연결된 단위 DNA가, 1개의 삽입 DNA가 되는 DNA 단편을 구성한다. 단위 DNA 단편의 DNA쇄 길이는 특별히 제한되지 않는다. 또한, 서로 그 순서를 유지한 채 연결한다는 것은, 삽입 DNA 상에서 인접하는 서열을 갖는 단위 DNA가 그 순서 및 방향을 유지하여 결합하는 것을 말하며, 또한, 반복 연결한다는 것은, 삽입 DNA의 5' 말단의 염기 서열을 갖는 단위 DNA의 5' 말단과 삽입 DNA의 3' 말단의 염기 서열을 갖는 단위 DNA의 3' 말단이 결합하는 것을 말한다. 이러한 단위 DNA로서, 구체적으로는, 예를 들어 단편의 돌출 말단의 염기 서열 상보성을 이용하여 서로 순서를 유지한 채 반복 연결할 수 있는 것과 같은 말단을 갖는 것을 들 수 있다. 이 돌출의 구조는, 회분 구조(팔린드롬)가 아니라면, 5' 말단 돌출, 3' 말단 돌출의 돌출 형상 차이도 포함하여 특별히 제한은 없다. 단, 단위 DNA의 제작 시에 돌출 말단을 제한 효소의 소화에 의해 제작할 수 있는 것이 바람직하다. 제한 효소로서는, 특정한 서열을 인식하여 그 근방에 임의 서열의 돌출 말단을 제작 가능한 효소를 사용하면, 단위 DNA 단편의 돌출 말단을 각 연결 부위에서 다른 것으로 만들 수 있기 때문에 그 연결하는 순서가 유지된다. 이러한 제한 효소의 예로서는, 통상의 분자 생물학에 사용되는 제한 효소 이외에, 인공 제한 효소의 TALEN이나 ZNF, 혹은 CRISPR-Cpf1 등의 돌출 말단 정제 가능한 CRISPR 기술 관련 효소 등를 들 수 있지만, 바람직하게는 AarI, AlwNI, BbsI, BbvI, BcoDI, BfuAI, BglI, BsaI, BsaXI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI, BtgZI, DraIII, FokI, PflMI, SfaNI, SfiI 등과 같은 TypeII 제한 효소를 사용하는 것이 좋다.

돌출 말단 생성에 사용되는 제한 효소의 종류의 수는 하나의 단위 DNA 잘라내기에는, 1종류의 제한 효소에 의한 절단이 바람직하다. 반드시 모든 단위 DNA를 동일 종류의 제한 효소의 소화에 의해 얻을 필요는 없지만, 사용하는 제한 효소 종류의 총 수는 적은 것이 좋으며, 3종류 이하인 것이 바람직하고, 2종류 이하인 것이 보다 바람직하고, 1종류인 것이 더욱 바람직하다.

삽입 DNA 유닛을 구성하는 단위 DNA 중 1개 이상의 단위 DNA에 대해서는, 숙주 세포에서 유효한 복제 개시점을 포함할 필요가 있다. 그 이외의 단위 DNA에 대해서는, 대사 경로 클러스터, 생물의 연속된 게놈 서열의 일부 혹은 전부, 인공 유전자, 인공 유전자 회로 등, 연속한 염기 서열을 구성하는 요소이지만, 단독의 단위 DNA가 생물학적인 기능 단위와 일치해야 한다는 제약은 없다.

단위 DNA의 제작 방법으로서는, 본 발명의 단위 DNA를 제작할 수 있는 방법이라면 어떠한 것이어도 좋다. 예를 들어 주형 DNA 상의 염기 서열에 각 돌출 말단을 생성하는 제한 효소 인식 서열을 부가한 프라이머를 사용한 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭한 DNA 단편, 혹은, 미리 말단에 임의의 돌출 서열을 생성하도록 제한 효소 인식 서열을 도입시킨 화학 합성 DNA 단편 등을 플라스미드 벡터에 클로닝하여 염기 서열을 확인 후 사용한다. 각 단위 DNA는, 특정한 순서로 연결하여 최종적으로 취득하고자 하는 미생물 형질 전환용 DNA 단편이 되도록 설계된다. 목적으로 하는 삽입 DNA를 구성하기 위하여 연결되는 단위 DNA의 수(종류)로서는, 3 내지 60(종류)이며, 바람직하게는 5 내지 50(종류), 보다 바람직하게는 8 내지 25(종류), 더욱 바람직하게는, 10 내지 20(종류)이다.

이하에, 본 발명의 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법의 각 공정을 상세하게 설명한다.

[공정 (A)]

본 발명의 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법에서의 공정 (A)에 있어서는, 소위 종 플라스미드가 조제된다. 종 플라스미드는, 공정 (B) 및 공정 (C)를 고려하여, 집적체 구축 후에 단위 DNA 단편으로 분할 가능하도록, 각각의 설계에 맞추어 적절한 제한 효소 인식 서열이 단위 DNA의 경계, 혹은 근방에 도입되어 있는 구조일 필요가 있다. 제한 효소로서는, AarI, AlwNI, BbsI, BbvI, BcoDI, BfuAI, BglI, BsaI, BsaXI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, BspQI, BtgZI, DraIII, FokI, PflMI, SfaNI, SfiI 등과 같이 임의 서열의 돌출 말단을 제작 가능한 효소를 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 제한 효소 처리에 의해 얻어지는 복수의 돌출 서열은, 단일 종 플라스미드 내에서 유일한 서열이 되어 있을 필요가 있다. 또한, 종 플라스미드군은, 조합 라이브러리의 재조합 단위(대부분의 경우, 단위 DNA가 그 단위에 일치하지만, 경우에 따라 재조합 단위가 일부의 종 플라스미드에 있어서는, 복수의 단위 DNA로 이루어지는 경우가 있다.)에서 동일한 돌출 서열을, 동일한 쇄에, 동일한 순서로 가질 필요가 있다.

OGAB 종 플라스미드의 구축에 있어서는, 즉, 상술한 각 단위 DNA를 거의 등몰이 되도록 조정한 단위 DNA 혼합액 중, DNA 리가아제 등을 사용하여 연결(라이게이션)함으로써 미생물 형질 전환용 DNA 단편을 제작하는 것도 가능하지만, 상기의 각 단위 DNA 만이 유전자 집적의 출발 재료로 한정되는 것은 아니고, 최종적으로 상술한 바와 같이 각 단위 DNA로 분할 가능한 구조로 되어 있으면, 어떠한 집적 방법으로 준비된 집적체도 이용 가능하다. 여기서, 거의 등몰이란, 단위 DNA 혼합액에 있어서의, 모든 DNA 단편의 몰 농도 비율이 0.8 내지 1.2의 범위인 것, 바람직하게는 0.9 내지 1.1의 범위인 것, 보다 바람직하게는 0.95 내지 1.05의 범위인 것, 더욱 바람직하게는, 1.0인 것을 말한다. 또한, 단위 DNA 혼합액에 있어서의, 모든 DNA 단편의 몰 농도 비율이 상기 수치 범위 내가 되는 것을, 단위 DNA 혼합액에 포함되는 단위 DNA 농도의 최고값을 최저값으로 나눈 값이, 1.0 내지 1.5의 범위인 것, 1.0 내지 1.2의 범위인 것, 1.0 내지 1.1인 것, 1.0인 것으로 바꿔 말할 수도 있다.

본 공정에서 조제되는 종 플라스미드의 단위 DNA는, 유전자 클러스터, 유전자, 유전자 단편 등 어떤 것이어도 좋다.

단위 DNA의 연결 방법은 특별히 제한되지 않지만, 폴리에틸렌글리콜과 염의 존재 하에서 행하는 것이 바람직하다. 염으로서는, 1가의 알칼리 금속의 염이 바람직하다. 구체적으로는, 10%의 폴리에틸렌글리콜 6000과 250mM의 염화 나트륨을 포함하는 라이게이션 반응액으로 행하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 각 단위 DNA의 반응액 중의 농도는 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 각각 1fmol/μL 이상의 농도이며, 또한 등몰이다. 라이게이션의 효소, 반응 온도, 시간은 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 T4DNA 폴리머라아제로 37℃, 30분 이상이다.

본 발명의 미생물 형질 전환용 DNA 단편에 있어서의 숙주 미생물로서는, 자연 형질 전환능을 갖는 것이라면, 특별히 한정되지 않는다. 이러한 미생물로서는, DNA를 도입할 때에 단일쇄 DNA에 처리하여 도입하는 자연 형질 전환능을 갖는 것 등을 들 수 있다. 구체적으로는, Bacillus속 세균, Streptococcus속 세균, Haemophilus속 세균 및 Neisseria속 등을 들 수 있다. 또한, Bacillus속 세균으로서는, B.subtilis(고초균), B.megaterium (거대균), B.stearothermophilus (중도 고열균) 등을 들 수 있다. 이 중, 가장 바람직한 미생물로서는, 그 자연 형질 전환능 및 재조합능이 우수한 고초균을 들 수 있다.

미생물 세포를 컴피턴트 세포로 하는 방법은, 각각의 미생물에 적합한 공지된 방법을 선택할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 고초균의 경우에는, Anagnostopoulou, C. and Spizizen, J. J. Bacteriol., 81, 741-746(1961)에 기재된 방법을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 형질 전환의 방법도 각각의 미생물에 적합한 공지된 방법을 사용할 수 있다. 컴피턴트 세포에 부여하는 라이게이션 산물의 액량도 특별히 제한은 없다. 바람직하게는 컴피턴트 세포 배양액에 대하여 1/20 내지 등량이며, 보다 바람직하게는 절반량이다. 형질 전환체로부터 플라스미드를 정제하는 방법으로서도 공지된 방법을 사용할 수 있다.

상술한 방법에 의해 얻어진 플라스미드가 목적으로 하는 삽입 DNA를 가지고 있는 것은, 제한 효소 절단에 의해 발생하는 단편의 사이즈 패턴이나 PCR법, 염기 서열 결정법에 의해 확인할 수 있다. 또한, 삽입 DNA가 물질 생산 등의 기능을 갖는 경우는, 그 기능을 검출함으로써 확인하는 것이 가능하다.

조합 라이브러리 구축에서 사용하는 종 플라스미드의 조정은, 일반적인 환상 플라스미드의 정제법이라면 어떤 방법으로도 사용할 수 있지만, 바람직하게는 플라스미드 DNA 이외의 DNA 혼입의 우려가 없는 방법이 좋고, 구체적으로는 염화 세슘-에티듐 브로마이드 밀도 구배 초원심법이 바람직하다.

[공정 (B)]

본 공정은, 공정 (A)에서 조제한 복수 종류의 플라스미드(종 플라스미드)를, 각각에게 적합한 제한 효소로 처리하여, 단위 DNA로 분해하고, 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 조제하는 공정이다. 공정 (A)에서 조제한 복수 종류의 플라스미드(종 플라스미드)는, 고순도로 정제된 후, 단위 DNA로 분해된다. 단위 DNA로의 분해는, 공정 (A)에서의 설계에 맞추어 적절한 제한 효소를 선택할 수 있다.

돌출 말단 생성에 사용되는 제한 효소의 종류의 수는 1개의 단위 DNA의 잘라내기에는, 1종류의 제한 효소에 의한 절단이 바람직하다. 반드시 모든 단위 DNA를 동일 종류의 제한 효소의 소화에 의해 얻을 필요는 없지만, 사용하는 제한 효소 종류의 총 수는 적은 것이 좋으며, 3종류 이하인 것이 바람직하고, 2종류 이하인 것이 보다 바람직하고, 1종류인 것이 더욱 바람직하다.

본 공정에서 얻어지는 단위 DNA 혼합액은, 종 플라스미드가 매우 고순도로 정제되기 때문에, 플라스미드 DNA 이외의 DNA 단편이 존재하지 않도록 되어 있다. 조제한 장쇄 DNA를 제한 효소로 절단하고, 제한 효소를 제거함으로써, 모든 DNA 단편의 몰 농도 비율이 한없이 1에 근접한 DNA 단편 용액(단위 DNA 혼합액)을 얻을 수 있다.

[공정 (C)]

본 공정은, 공정 (B)에서 얻어진 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 사용하여, OGAB법에 의해 단위 DNA를 재집적시켜, 장쇄 DNA 단편을 조제하는 공정이다. 공정 (B)에서 얻어진, 모든 DNA 단편의 몰 농도 비율이 한없이 1에 근접한 DNA 단편 용액(단위 DNA 혼합액)을 출발 재료로 하여 유전자 집적법(OGAB법)을 행함으로써, 보다 효율적으로 유전자 집적을 행할 수 있다. 또한, 본 공정에서의 단위 DNA 혼합액을 사용하여, OGAB법에 의해 단위 DNA를 재집적시키는 방법에 대해서는, 공정 (A)에서의 설명을 적용할 수 있다.

본 발명은, 추가로, 숙주 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA와, 단위 DNA가 연결된 삽입 DNA를 포함하는 삽입 DNA 유닛을, 적어도 하나 갖는 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법으로서,

(B') 상술한 본 발명의 방법에 의해 조제된 복수 종류의 플라스미드를, 각각에게 적합한 제한 효소로 처리하여, 단위 DNA로 분해하고, 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 조제하는 공정, 및

(C) 공정 (B')에서 얻어진 단위 DNA 혼합액을 사용하여, OGAB법에 의해 단위 DNA를 재집적시켜, 장쇄 DNA 단편을 조제하는 공정

을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법도 포함된다.

상술한 본 발명의 방법에 의해 얻어진 장쇄 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 복수 종류 선택하여 공정 (B')에서의 플라스미드로서 재이용할 수 있다.

본 발명에는, 상술한 본 발명의 조제 방법에 의해 얻어진 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편을 포함하는 플라스미드도 포함된다. 또한, 본 발명의 조제 방법을 사용하는 키메라 플라스미드 라이브러리의 구축 방법도 포함된다.

실시예

이하의 실시예에서 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예에서 사용한 시약 등, 공통되는 시험 방법 등은 이하와 같다.

고초균의 숙주로서 RM125주(Uozumi, T., et al. Moi. Gen. Genet., 152, 65-69 (1977))와, 그 파생주인 BUSY9797주를 사용하였다. 고초균으로 복제 가능한 플라스미드 벡터로서는, pGET118(Kaneko, S., et al. Nucleic Acids Res. 31, e112 (2003))을 사용하였다. 항생 물질 카르베니실린은, 와코 쥰야꾸 고교사에서 구입하였다. 항생 물질 테트라사이클린은, 시그마사에서 구입하였다. 제한 효소 SfiI와 BspQI는 NEB사에서 구입하였다. T4 DNA Ligase는, 다카라 바이오사에서 구입하였다. 대장균의 플라스미드 구축용의 일반적인 라이게이션에는, Takara Ligation Kit (Mighty) (다카라 바이오사)를 사용하였다. 단위 DNA 조제용의 PCR 반응에는, 도요보사의 KOD plus polymerase를 사용하였다. 한편, 플라스미드에 클로닝된 DNA의 염기 서열 결정을 위한 콜로니 PCR에는, 다카라 바이오사제의 Ex-Tag HS를 사용하였다. pMD-19(simple)는, 다카라 바이오사에서 구입하였다. 환상 플라스미드 정제용 효소 Plasmid Safe는, EPICENTER사제의 것을 사용하였다. DNA 전기 영동용의 저융점 아가로오스 겔인, 2-Hydroxyethyl agarose는, 시그마사에서 구입하였다. 다른 일반적인 전기 영동용 아가로오스 겔은, 인비트로젠사의 UltraPure Agarose를 사용하였다. 페놀:클로로포름:이소아밀알코올 25:24:1과, TE 포화 페놀(8-퀴놀리놀 함유)은, 나카라이테스크사제의 것을 사용하였다. 리소자임은 와코 쥰야꾸 고교사에서 구입하였다. LB 배지의 배지 성분 및 한천은, 벡튼 디킨슨사제의 것을 사용하였다. IPTG(isopropyl s-D-thiogalactopyranoside)는, 와코 쥰야꾸 고교사제를 사용하였다. 다른 모든 배지 성분 및 생화학 시약은, 와코 쥰야꾸 고교사제의 것을 사용하였다.

특기 이외의 플라스미드의 구축은, 대장균 DH5α주, JM109주, TOP10주 중 어느 것을 사용하였다. 구축한 플라스미드의 대장균으로부터의 소량 정제는 퀴아젠사의 QIAprep Spin Miniprep Kit를, 대량 정제는 동사의 QIAfilter Midi Kit를 사용하였다. 효소 반응액으로부터의 DNA의 클린업에는, 퀴아젠사의 MinElute Reaction Cleanup Kit나, 동사의 QIAquick PCR purification Kit를 사용하였다. 통상의 아가로오스 겔 전기 영동에서 분리하여 얻어진 겔 블록을 정제하는 경우는, 퀴아젠사의 MinElute Gel Extraction Kit를 사용하였다. 초미량 분광 광도계는 Thermo사의 nano-drop 2000을 사용하였다. 염기 서열 결정에는, 어플라이드 바이오시스템즈사제의 형광 자동 시퀀서의 3130xl 제네틱 애널라이저를 사용하였다.

다른 일반적인 DNA의 조작에 대해서는, 표준 프로토콜(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989))에 따라 행하였다. OGAB법 등에 의한 고초균의 형질 전환과 플라스미드 추출은, 기존 법대로 행하였다(Tsuge, K., et al., Nucleic Acids Res. 31, e133. (2003)).

1. 삽입 DNA 유닛의 조제

(1) 집적용 플라스미드 벡터의 구축

집적용 플라스미드 벡터 pGETS302-SfiI-pBR은, 대장균의 pBR322의 복제 개시점과, 고초균에서 기능하는 복제 개시점 repA, 출아 효모로 복제 가능한 ARS4와 CEN6을 갖는 대장균-고초균-효모간 셔틀 플라스미드 벡터에서, pGETS109(Tsuge, et. al., Nucleic Acids Res., 31, e133. (2003))을 기반으로 다단계의 과정을 거쳐 구축된 플라스미드이다. 도 1에 그 구조를, 서열 번호 1에 염기 서열을 나타낸다. 집적 유전자의 클로닝 부위는, 2개의 SfiI 절단 부위 사이로 되어 있고, 집적 시에는 가장 큰 15kb의 SfiI 단편을 사용한다. 대장균에서의 선택은, 암피실린을 사용하였다. 본 플라스미드 5μg에, 멸균수를 첨가하여 전체를 40μl로 만든 후, 제한 효소에 부속되는 10ХNEB2.1 Buffer를 5μl와, 제한 효소 SfiI(NEB사) 5μl을 첨가하여 5℃, 2h 반응시켰다. 얻어진 액체를, 저융점 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 분리 후, 벡터 본체의 약 15kb의 단편을 겔로부터 잘라내고, 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하고, 20μl의 TE에 용해하고, 그 1μl를 덜어 초미량 분광 광도계에 의해 농도를 측정하였다.

(2) 단위 DNA 돌출 서열의 설계법

도 2에 나타내는 바와 같이, 1개의 삽입 유닛을 구성하는 단위 DNA는, 집적용 벡터 pGETS302를 포함하여 전부 14단편 존재한다. 출아 효모 중에서 이소부탄올 대사 경로에 관련되는 유전자군은, 전부 12개이고, 이들을 차례로 제1 내지 제12 단위 DNA로 정의한다. 출아 효모 중에서, 형질 전환용 선택 마커로서 작용하는, kanMX4를 제13 단위 DNA로, 집적 벡터를 제14 단위 DNA로 정의한다. 제1 내지 제14 단위 DNA는 숫자대로 연속하고, 제14와 제1단위 DNA가 연결되는 구조가 됨으로써, 1개의 삽입 유닛을 형성한다. 각 단위 DNA의 말단에는, 단편의 좌우로 각각에 단위 DNA의 번호별로 지정된 것에 고유의 3염기의 3' 말단 돌출 염기가 존재한다. 이 상보성에 의해 연결 상대가 지정되어 있다. 구체적으로는, 다음과 같은 구성이 된다. (제14 단위 DNA)-GTT-(제1 단위 DNA)-TGA-(제2 단위 DNA)-CGA-(제3 단위 DNA)-TGT-(제4 단위 DNA)-GAT-(제5 단위 DNA)-TTG-(제6 단위 DNA)-GTC-(제7 단위 DNA)-ATG-(제8 단위 DNA)-TGG-(제9 단위 DNA)-TAG-(제10 단위 DNA)-ACT-(제11 단위 DNA)-GTA-(제12 단위 DNA)-CTT-(제13 단위 DNA)-TCT-(제14 단위 DNA).

2. 출아 효모 이소부탄올 생산 유전자군의 유전자 발현량의 조절

(1) 출아 효모

출아 효모(Saccharomyces cerevisiae)는, 진핵의 미생물이며, 진핵 생물 모델 미생물로서 연구가 진행되고 있고, 게놈 서열이 완전히 밝혀져 있어, 여러가지 정보가 축적되어 있다. 출아 효모는 혐기 호흡으로서 알코올 발효를 행한다. 출아 효모는 맥주나 와인, 일본주 등의 발효에 옛부터 이용되고 있고, 에탄올 생산 능력이 높아 바이오 에탄올 생산의 숙주로서 널리 사용되어 왔다. 현재는, 에탄올 이외의 유용 물질 생산의 숙주로서도 공업적으로 널리 사용되고 있고, 탄소쇄 수가 3이상의 고급 알코올이나 각종 유기산에 첨가하여 색소나 향료, 서플리먼트 등의 부가 가치품의 생산에도 이용되고 있다. 진핵 생물인 출아 효모는, 원핵 생물의 박테리아와 달리 미토콘드리아나 핵 등의 세포 소기관을 갖는다. 또한, 통상 폴리시스트로닉한 발현 형식이 아니고 모노시스트로닉한 발현 형식을 취하기 때문에 1개의 유전자마다 1개의 프로모터가 필요하고, 예를 들어 12개의 유전자를 발현시키기 위하여는 12개의 프로모터가 필요하다.

(2) 이소부탄올 대사 경로 디자인

이소부탄올의 주된 용도는 유기 합성 용제, 페인트 제거제, 메타크릴산 i-부틸의 원료이다. 또한, 이소부탄올은 탈수함으로써 이소부틸렌으로 변환 가능하고, 에틸 tert-부틸에테르(ETBE) 등의 연료 혼합제나 바이오 제트 연료의 원료로서 이용할 수 있으며, 또한 이소부틸렌을 이소옥텐(디이소부틸렌)으로 변환함으로써, 여러 가지 폴리머의 원료로서도 이용 가능하다. 출아 효모는 원래 에탄올을 주된 생성물로서 생산하지만, 약간이지만 퓨젤 알코올로서 이소부탄올을 생산한다. 이소부탄올을 고생산하기 위하여 디자인한 출아 효모의 인공적인 대사 경로를 도 3에 나타낸다. 출아 효모 내의 L-발린 대사 경로 내의 2케토이소발레르산(2-keto-isovalerate)에 케토산 탈탄산 효소(KDC)와 알코올 탈수소 효소(ADH)를 코드하는 2개의 유전자(예를 들어 Lactococcus lactis 유래 kivd와 출아 효모 유래 ADH6)를 도입하면 이소부탄올의 생산량이 향상되기 때문에, 이것을 집적 대상에 첨가하였다. 그러나, 기질의 2케토이소발레르산이 원래 미토콘드리아 내에서 생산되는 것, 그리고 케톨산 환원 이성화 효소(ILV5)나 ADH6이 필요로 하는 NADPH가 부족되는 등의 복수의 원인에 의해 효율적인 이소부탄올 생산을 할 수 없다. 그래서, 미토콘드리아 내에서 이루어지는 피루브산으로부터 2케토이소발레르산까지의 경로(도 3에 이중선으로 표시된 대사 경로)를 구성하고 있는 아세토락트산 합성 효소(ILV2), 케톨산 환원 이성화 효소(ILV5), 디히드록시산 탈수 효소(ILV3)를 코드하는 3개의 유전자와, 미토콘드리아 내의 NADPH를 조정하기 위한 말산 효소(MAE1)의 총 4유전자(도 3에 이중 밑줄선으로 표시된 유전자) 발현의 증강을 목적으로 이것들을 집적 대상에 첨가하였다. 또한, 이러한 대사 경로를 세포질측에도 구성되도록, ilv2CEc, ilvDLl, alsLp 의 3유전자 및 세포질 내의 NADPH의 부족을 해소하기 위하여, 탄산 고정 효소(PYC2), 말산 탈수소 효소(MDH2), 말산 효소(MAE1)의 N말단의 미토콘드리아 이행 시그널을 제거한 sMAE1의 3유전자의 총 6유전자(도 3에 밑줄선으로 표시된 유전자)를 집적 대상에 첨가하였다. 이상에 기재한 12개의 유전자에는, 각각 효모 내에서 강력하게 발현하는 것이 가능한 1차 대사 경로의 프로모터와 터미네이터를 도입하였다.

(3) 종 플라스미드 1: 과잉 발현 유전자군 세트의 디자인

출아 효모 중에서 12개의 유전자를 발현할 수 있도록, 12종류의 프로모터 및 터미네이터를 사용한 발현 카세트를 설계하였다. 구체적으로는, ADH1, FBA1, HXT7, PDC1, PGK1, SED1, TDH1, TDH2, TDH3, TEF1, TEF2, TPI1의 프로모터와 터미네이터를 사용하여 12종류의 발현 카세트를 설계하였다(도 4의 유전자 ORF 상의 화살표가 프로모터 서열을, 핀이 터미네이터 서열을 의미한다.). 각각의 발현 카세트의 프로모터와 터미네이터 사이에는, 삽입되는 유전자의 개시 코돈(ATG)으로부터 종지 코돈(TAA)까지를 서브 클로닝할 수 있도록 BspQI 부위를 역방향으로 2개 배치한 서열 (…atgAGAAGAGCTCTTCAtaa…)을 부가하였다. PDC1 프로모터와 TDH2 프로모터에 대해서는 서열 중에 포함되는 BspQI 부위를 삭제하기 위하여, PDC1 프로모터는 -492 위치의 G를 C로, TDH2 프로모터는 -462 위치의 C를 G로, 각각 변이시킨 서열을 사용하였다. 프로모터와 터미네이터를 포함하는 12종류의 발현 카세트의 좌우 말단 서열은, SfiI에 의한 절단 후에 단위 DNA의 번호별로 지정된 고유의 3염기의 3' 말단 돌출 염기가 출현하도록 디자인한 제한 효소 부위(SfiI 부위)를 각각 부가하고, 상보성에 의해 연결 상대가 지정 되도록 서열을 설계하였다. 이러한 12종류의 프로모터와 터미네이터를 포함하는 발현 카세트는, pMA 혹은 pMK 벡터에 클로닝되도록 디자인하였다. 이어서, 출아 효모 중에서의 이소부탄올 대사 경로에 관계되는 12개의 유전자군으로서 ilvEc, ilvDLl, alsLp, kivd, ILV3, ILV5, ADH6, PYC2, ILV2, MDH2, maeBEc, sMAE1을 선정하고, 각각의 유전자의 개시 코돈은 ATG, 종지 코돈은 TAA로 통일되도록 서열을 개변하였다. 또한, 이들 유전자는 12종류의 발현 카세트 중 어느 것에도 서브 클로닝할 수 있도록, 양쪽 말단에 BspQI 부위를 배치한 서열(TAGGCTCTTCAatg…taaAGAAGAGCCTA)을 부가하도록 설계하였다(도 2). BspQI 부위를 양쪽 말단에 갖는 이러한 유전자는, pCR-BluntII-TOPO 벡터에 클로닝되도록 디자인하였다. 최종적으로, pMA 혹은 pMK에 클로닝된 ADH1, FBA1, HXT7, PDC1, PGK1, SED1, TDH1, TDH2, TDH3, TEF1, TEF2, TPI1의 프로모터와 터미네이터를 갖는 12종류의 발현 카세트의 BspQI 부위 각각에, ilvEc, ilvDLl, alsLp, kivd, ILV3, ILV5, ADH6, PYC2, ILV2, MDH2, maeBEc, sMAE1이 삽입되도록, 합계 12종류의 과잉 발현 카세트(ilvCEc-1st, ilvDLl-2nd, alsLp-3rd, kindEc-4th, ILV3-5th, ILV5-6th, ADH6-7th, PYC2-8th, ILV2-9th, MDH2-10th, maeBEc-11th, sMAE1-12th)를 디자인하였다(서열 번호 2-13). 또한, 출아 효모 내에 있어서, 약제에 의한 선택이 가능하도록, 제13번째의 단편으로서 KanMX 단편(kanMX4-13th)을 도입하였다(서열 번호 14).

(4) 종 플라스미드 2: 발현 억제 유전자군 세트의 디자인

(3) 종 플라스미드 1: 과잉 발현 유전자군 세트의 디자인을 답습하고, 동일한 프로모터 및 터미네이터 서열을 사용하고 있지만, 삽입하는 각 유전자의 ORF 단편은, 과잉 발현 유전자군 세트와 비교하여 반대 방향의 방향이 되도록 설계하였다. 구체적으로는 (3)에서 설계한, 각각의 발현 카세트의 프로모터와 터미네이터 사이에는, 삽입되는 유전자의 개시 코돈(ATG)으로부터 종지 코돈(TAA)까지를 서브 클로닝할 수 있도록 한 플라스미드를 BspQI로 절단하고, 여기에 새롭게 BspQI 부위를 역방향으로 2개 배치한 서열을 연결함으로써, 돌출 서열(…atgttaAGAAGAGCTCTTCAcattaa…의 밑줄부 서열)을 변경한 플라스미드를 준비하였다. 이러한 수순을 거쳐 제작된 발현 억제 카세트(ilvCEc-as-1st, ilvDLl-as-2nd, alsLp-as-3rd, kindEc-as-4th, ILV3-as-5th, ILV5-as-6th, ADH6-as-7th, PYC2-as-8th, ILV2-as-9th, MDH2-as-10th, maeBEc-as-11th, sMAE1-as-12th)의 염기 서열을, 서열 번호 15-26에 나타낸다. 단위 DNA의 결과적으로, 종 플라스미드 2의 단위 DNA는, 종 플라스미드 1의 단위 DNA와 비교하여 새롭게 도입한 돌출 서열의 6염기분이 길게 되어 있다. 또한, 약제 선택 마커의 KanMX에 대해서는, 종 플라스미드 1과 동일한 것을 사용하였다.

(5) 종 플라스미드의 구축

유전자(ORF 영역)에 대해서는, PCR법을 사용하여 출아 효모(YPH499주) 게놈으로부터 증폭하였다. 먼저, 상기에서 결정한 돌출 조합간의 DNA 서열을 증폭하기 위한 프라이머의 5' 말단에 상기에서 결정한 제한 효소 인식 부위를, 바람직한 돌출을 잘라내는 위치에 부가하고, 다시 5' 말단에 TAG의 서열을 부가한 프라이머를 사용하였다. 이러한 프라이머 세트를 사용하여, 출아 효모 게놈으로부터 지정 영역의 DNA 단편을 증폭하였다. PCR의 반응 조건은, 1 반응(50μl)에 대하여 5μl의 KOD Plus 10Хbuffer Ver.2, 3μl의 25mM MgSO₄, 5μl의 dNTP(2mM each), 1μl의 KOD Plus(1unit/μl), 48pg의 람다 파지 DNA(TOYOBO), 15pmol의 프라이머(F 프라이머와 R 프라이머 각각), 멸균수를 첨가하여 제작하고, GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystems사)에 의해, 이하의 프로그램에 의해 행하였다. 94℃, 2min, 인큐베이션 후, 98℃ 10s, 55℃ 30s, 68℃ 1min을 30사이클 행하고, 마지막으로 68℃ 7min 인큐베이션하였다.

증폭한 DNA 단편은, 0.7%의 저융점 아가로오스 겔(2-Hydroxyethyl Agarose TypeVII, 시그마사)로 1×TAE(Tris-Acetate-EDTA Buffer) 버퍼 존재 하에서, 범용 아가로오스 겔 전기 영동 장치(i-MyRun. N 핵산용 전기 영동 시스템, 코스모 바이오사)로, 100V(약 8V/cm)의 전압을 인가하고, 1h 영동함으로써, 플라스미드 벡터와 단위 DNA를 분리하였다. 이 영동 겔을, 1μg/ml의 브롬화 에티듐(시그마사)를 포함하는 1×TAE 버퍼 100ml로 30min 염색하고, 장파장의 자외선(366mn)으로 조사하여 가시화함으로써, PCR 산물의 목적 사이즈를 면도기로 잘라내 1.5ml 튜브에 회수하였다. 회수한 저융점 아가로오스 겔(약 300mg 정도)에, 1×TAE 버퍼를 첨가함으로써 전체 체적을 약 700μl로 하고, 이것을 65℃, 10min 항온함으로써, 겔을 용해하였다. 그 후, 등량의 TE 포화 페놀(나카라이테스크사)를 첨가하여, 잘 혼합함으로써 제한 효소를 실활시켰다. 원심 분리(20,000×g, 10min)에 의해 페놀상과 수상으로 분리하고, 수상(약 90μl)을 새로운 1.5ml 튜브에 회수하였다. 여기에 1-부탄올(와코 쥰야꾸 고교사)을 500μl 첨가하여 잘 혼합 후, 원심 분리(20,000×g, 1min)에 의해 분리하고, 수분을 포화한 1-부탄올을 제거하는 조작을 수상의 체적이 450μl 이하가 될 때까지 반복함으로써, 수상의 체적을 감소시켰다. 여기에, 3M 아세트산 칼륨-아세트산 완충액(pH 5.2)을 50μl와, 에탄올 900μl을 첨가하고, 원심 분리(20,000×g, 10min)함으로써, DNA를 침전하고, 이것을 70% 에탄올로 린스하고, 20μl의 TE (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0)에 용해하였다. 이 회수 DNA는, 사용할 때까지 -20℃에서 보존하였다.

얻어진 DNA 단편은, 이하에 나타내는 방법에 의해 TA 클로닝법에 의해 대장균 플라스미드 벡터 중에 클로닝하였다. DNA 단편 8μl에, TAKARA사의 PCR 반응용 효소 Ex-Taq에 부속되는 10×Ex-Taq Buffer 1μl에, 100mM dATP 0.5μl, Ex-Tag 0.5μl을 첨가하고, 65℃에서 10min 항온함으로써, DNA 단편의 3' 말단에 A의 돌출을 부가하였다. 이 DNA 단편 용액 1μl에, TAKARA사의 pMD19-Simple 1μl와 멸균수 3μl을 혼합 후, TAKATA Ligation(Mighty)Mix 5μl을 첨가하고, 16℃에서 30min 항온하였다. 이 라이게이션 용액의 5μl을 50μl의 대장균 DH5α의 케미컬 컴피턴트 세포에 첨가하고, 빙상에서 15min 항온 후, 42℃에서 30sec 열 쇼크를 주고, 2min 빙상에서 방치 후, LB 배지를 200μl 첨가하고, 37℃에서 1h 항온 후, 카르베니실린을 100μg/ml의 농도로 포함하는, 1.5% 한천을 포함하는 LB 플레이트에 도말하고, 37℃에서 밤새 배양함으로써 플라스미드의 형질 전환체를 얻었다.

얻어진 콜로니를, PCR용 주형 DNA 조제 시약(시카 지니어스 DNA 조제 시약, 간토 가가꾸)을 사용하여 조제하였다. 구체적으로는, 시약 키트 내의 시약 a와 시약 b를 1:10의 비율로 혼합한 용액을 2.5μl 준비하고, 여기에 플레이트 상의 콜로니를 이쑤시개로 소량 채취한 것을 현탁 후, 72℃, 6min 처리 후, 94℃, 3min 처리하였다. 얻어진 액체에, TAKARA Ex-Taq용 10×효소 2.5μl와 2.5mM dNTP 용액 2μl, 10pmol/μl의 M13F 프라이머 0.25μl과 10pmol/μl의 M13R 프라이머 0.25μl, 멸균수 17μl, Ex-TaqHS 0.5μl을 첨가하여, 94℃, 5min 인큐베이션 후, 98℃, 20sec, 55℃, 30sec, 72℃, 1min을 30사이클 행함으로써 DNA를 증폭하고, 이 PCR 산물의 염기 서열을 조사함으로써, 바람직한 서열과 완전히 일치하는지 여부를 조사하였다. 최종적으로 모든 클론으로부터 올바른 서열이 얻어졌다.

원하는 서열을 갖는 DNA 단편을 클로닝하는 플라스미드를 갖는 대장균 형질 전환체를 각각 2ml의 100μg/ml의 카르베니실린이 들어간 LB 배지에서 37℃, 120spm, 밤새 배양하고, 얻어진 균체를, QIAfilter Plasmid miniKit(퀴아젠사)를 사용하여, 매뉴얼에 따라 정제하였다. 얻어진 플라스미드를 BspQI로 절단하고, 전기 영동에 의한 사이즈 분획에 의해 ORF 영역을 회수하였다.

효모의 프로모터와 터미네이터를 BspQI 부위에서 연결한 DNA 단편을 SfiI 부위에서 자를 수 있도록 설계한 DNA의 합성(도 2의 과잉 발현용)은, 서모피셔사에 의뢰하였다. 이러한 DNA 단편은, 플라스미드 벡터 pAM 혹은 pMK에 클로닝된 형태로 납품되었다. 이 플라스미드를 BspQI로 절단하고, 상술한 ORF의 BspQI 단편을 연결한 것을 구축하여 종 플라스미드 1의 단위 DNA를 갖는 플라스미드로서 준비하였다. 이러한 단위 DNA 단편의 서열은, 서열 번호 2-13과 같다. 종 플라스미드 2용으로는, 상술한 pMA 혹은 pMK에 클로닝된 프로모터와 터미네이터를 BspQI 부위에서 연결한 DNA 단편을 BspQI로 절단하고, 링커 DNA를 도입함으로써, 도 2의 발현 억제용과 같이 새롭게 구축하였다. 이 플라스미드를 BspQI로 절단하고, 상술한 ORF의 BspQI 단편을 도입함으로써 구축하였다. 이러한 원하는 서열을 갖는 DNA 단편을 클로닝하는 플라스미드를 갖는 대장균 형질 전환체를 각각 2ml의 100μg/ml의 카르베니실린이 들어간 LB 배지에서 37℃, 120spm, 밤새 배양하고, 얻어진 균체를, QIAfilter Plasmid miniKit(퀴아젠사)를 사용하여, 매뉴얼에 따라 정제하였다. 얻어진 플라스미드의 10μl을 분취하고, 멸균수 30μl, 10×NEB buffer#2 5μl, SfiI제한 효소(NEB) 5μl을 첨가하고, 50℃, 2h 반응시킴으로써 단위 DNA 단편을 플라스미드 벡터로부터 분리하였다. 그것을 0.7%의 저융점 아가로오스 겔로, 1×TAE (버퍼 존재 하에서, 범용 아가로오스 겔 전기 영동 장치로, 50V(약 4V/cm)의 전압을 인가하고, 1h 영동함으로써, 플라스미드 벡터와 단위 DNA를 분리하였다. 이 영동 겔을, 1μg/ml의 브롬화 에티듐(시그마사)를 포함하는 1×TAE 버퍼 100ml로 30min 염색하고, 장파장의 자외선(366mn)으로 조사하여 가시화함으로써 3kb 부근을 면도기로 잘라내 1.5ml 튜브에 회수하였다. 회수한 저융점 아가로오스 겔(약 300mg 정도)은, 상술한 바와 같이 정제하고, 20μl의 TE에 용해하였다. 이와 같이 하여 조제한 단위 DN 플라스미드는, 시판되고 있는 Lambda phage genome DNA(TOYOBO)의 희석 계열을 기초로 하여 제작한 검량선을 사용하여, 핵산 형광 염료의 SYBR GreenII 형광 플레이트 리더에 의해 정량하였다.

(6) 유전자 집적

종 플라스미드 1의 집적에는 서열 번호 2-14의, 종 플라스미드 2의 집적에는 서열 번호 14-26의 각 단위 DNA와, 유전자 집적용 벡터의 pGETS302-SfiI(서열 번호 1)가 0.1foml 이상의 등몰을 포함하는 혼합 용액 10μl에 2×라이게이션 버퍼를 11μl 첨가하고, 전체를 37℃, 5min 동안 항온한 후, 1μl의 T4DNA 리가아제(Takara)를 첨가하고, 37℃에서 4h 항온하였다. 10μl을 덜어 전기 영동함으로써 라이게이션되어 있는 것을 확인 후, 이것을 10μl 새로운 튜브에 채취하고, 고초균 컴피턴트 세포를 100μl 첨가하고, 37℃에서 30min, 덕 로터로 회전 배양하였다. 그 후, 300μl의 LB 배지를 첨가하고, 37℃에서 1h, 덕 로터로 회전 배양하고, 그 후, 배양액을 10μg/ml의 테트라사이클린이 들어간 LB 플레이트에 펴고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 콜로니는, 과잉 발현과 유전자 발현 억제 중 어느 쪽의 구축으로부터도 100개의 형질 전환체가 얻어졌다. 플라스미드를 추출하여 제한 효소 절단 패턴을 조사함으로써 각각 1개씩 목적으로 하는 구조(도 4의 공정 (A)의 종 플라스미드)를 갖는 형질 전환체를 선택하였다.

(7) 종 플라스미드의 고순도 정제

염화 세슘-에티듐 브로마이드 밀도 구배 초원심법에 의해 고순도의 플라스미드 DNA를 조달하였다. 구체적으로는, LB 배지에 항생 물질(테트라사이클린)을 첨가한 것을 200ml 준비하고, 500ml의 삼각 플라스크에 100ml씩 넣어 37℃에서 밤새 배양하였다. 충분히 증식 후, 플라스미드의 카피 수를 증가시키기 위하여 1M의 IPTG을 각 플라스크에 100μl씩 첨가하고, 추가로 3시간 내지 12시간 정도 배양하였다. 배양 종료 후, 50ml씩 50ml 튜브(팔콘 2070) 4개에 분주하고, 5,000rpm 10min 원심하였다. 상청을 버리고, 균 펠릿을 보텍스에 의해 완전히 풀었다. 10mg/ml의 리소자임이 들어간 Sol.I용액(조성 50mM 글루코오스, 25mM Tris-CI(pH 8.0), 10mM EDTA)를 준비하고, 균이 들어간 튜브 4개에 각각 2.5ml씩 첨가하여 잘 혼합하였다. 이것을 37℃, 30min 인큐베이션하였다. 5,000rpm 10min 원심하고, 상청을 데칸트로 제거하고, 새롭게 리소자임이 들어 있지 않은 Sol.I를 4개의 튜브에 각각 2.5ml 첨가하고, 펠릿을 균일하게 현탁하였다. 신선한 Sol.II(조성 0.2N NaOH, 1% (w/v) 도데실 황산 나트륨)를 조제하고, 4개의 튜브에 각각 5ml씩 첨가하고, 천천히 혼합하여 투명하게 만들었다. Sol.III(조성 60ml 5M 아세트산 칼륨, 11.5ml 빙초산, 28.5ml 물)를 각 튜브에 3.75ml씩 첨가하고, 백탁 물질이 균등하게 분산될 수 있도록 어느 정도 강한 힘으로 혼합하였다. 5,000rpm 10min 원심하고, 상청을 피펫으로 빨아 들여 새로운 4개의 나사 덮개의 50ml 튜브(팔콘 2070)로 옮겼다. 각각의 튜브에 5ml의 페놀·클로로포름을 첨가하고, 격렬하게 혼합하였다. 5,000rpm 10min 원심하고, 상청을 피펫으로 빨아 들여 새로운 4개의 나사 덮개의 50ml 튜브(팔콘 2070)로 옮겼다. 100% 에탄올을 각각 25ml 첨가하여 혼합하고, 5,000rpm 10min 원심하였다. 상청을 제거하였다. 10ml의 TE에 10mg/ml의 RNaseA 용액을 10μl 첨가한 용액(최종 농도 10μg/ml)을 각 튜브에 2.5ml씩 첨가하여 침전을 용해하였다. 4개의 튜브의 액체를 1개로 통합하고, 37℃ 기상의 인큐베이터에서 30min 인큐베이션하였다. 인큐베이션 종료 후에 5ml의 페놀·클로로포름을 첨가하여 잘 혼합 후, 5,000rpm 10min 원심하였다. 상청을 새로운 50ml 튜브에 덜어 옮기고, Sol.III를 1ml 첨가 후, 100% 에탄올을 25ml 첨가하여 혼합하였다. 그 후, 5,000rpm 10min 원심하여 상청을 제거하였다. 침전에 5.4ml의 TE를 첨가하여 완전히 용해하였다. 이어서, 정확하게 칭량한 6.40g의 염화 세슘을 투입하여 완전히 용해하였다. 추가로, 1.3g/ml의 염화 세슘 용액(1.3g의 염화 세슘과 1ml의 물을 섞어서 제작한 용액으로, 체적 조제하지 않음)을 2.6ml 첨가하였다. 마지막으로, 10mg/ml의 에티듐 브로마이드 용액을 600μl 첨가하여 잘 혼합하였다. 초원심 튜브(베크만 362181)를 1개 준비하고, 초원심 튜브에 내용물을 옮겼다. 밸런스와의 무게 차이가 20mg 이내가 되도록, 물, 혹은 1.3g/ml 염화 세슘 용액(비중 약 1.5g/ml 정도)을 첨가하여 무게를 미세 조정하였다. 초원심 장치(베크만 콜터)로 이하의 조건에서 원심을 행하였다. 온도 18℃, 속도 50,000rpm, 가속도 Max, 감속도 Max로 15시간 이상 원심하였다. 원심 종료 후, 자외선(365nm) 관찰 하에서, 1ml의 시린지에, 바늘(21G×5/8”)을 세트한 것을 준비하고, ccc형의 플라스미드의 밴드에 꽂고, 플라스미드 용액을 회수하고, 15ml 튜브로 옮겼다. 여기에 Sol.III을 500μl 첨가하고, 다음에, 전체가 3ml이 되도록 물을 첨가하였다. 추가로, 9ml의 100% 에탄올을 첨가하였다. 5,000rpm 10min 원심하고, 상청을 제거하였다. 얻어진 침전에 700μl의 TE를 15ml 튜브에 첨가하고, DNA를 용해하였다. 이것을 1.5ml의 튜브에 옮기고, 600μl의 1-부탄올을 첨가하여 혼합하고, 15,000rpm으로 10s 정도 원심하고, 2층으로 분리하고, 상층의 부탄올층을 버렸다. 새롭게, 600μl의 1-부탄올을 첨가하여 혼합하고, 15,000rpm으로 10s 정도 원심하고, 2층으로 분리하고, 상층의 부탄올층을 버렸다. 이 조작을, 수층이 450μl 이하가 될 때까지 계속하였다. 50μl의 Sol.III를 첨가하고, 추가로 100% 에탄올을 900μl 첨가하였다. 15,000rpm으로 10min 원심하였다. 상청을 버리고, 침전을 70% 에탄올로 린스하였다. 침전을 22μl의 TE에 용해하였다.

(8) 종 플라스미드로부터의 단위 DNA의 생성

도 4의 공정 (B)의 단위 DNA의 조제는, 이하와 같이 행하였다. 초원심법에 의해 고순도로 정제한 종 플라스미드 300ng분을 분취하고, 멸균수로 40μl로 맞춘 후, 10ХNEBbuffer#2를 5μl와, 제한 효소 SfiI(NEB사)를 5μl 첨가하고, 37℃, 2h 반응시켰다. 반응액을 1μl 전기 영동하여 절단되어 있는 것을 확인하였다. 그 후, 2개의 종 플라스미드의 반응액을 통합하고, 450μl 페놀·클로로포름·이소아밀알코올(25:24:1) (나카라이테스크사)을 첨가하고, 혼합 후, 원심 분리(20,000×g, 10min)에 의해 페놀상과 수상으로 분리하고, 수상(약 900μl)을 새로운 1.5ml 튜브에 회수하였다. 여기에 1-부탄올(와코쥰야꾸 고교사)을 500μl 첨가하여 잘 혼합 후, 원심 분리(20,000×g, 1min)에 의해 분리하고, 수분을 포화한 1-부탄올을 제거하는 조작을 수상의 체적이 450μl 이하가 될 때까지 반복함으로써, 수상의 체적을 감소시켰다. 여기에, 3M 아세트산 칼륨-아세트산 완충액(pH5.2)을 50μl와, 에탄올 900μl을 첨가하고, 원심 분리 (20,000×g, 10min)함으로써 DNA를 침전하고, 이것을 70% 에탄올로 린스하고, 20μl의 TE에 용해하였다.

(9) 조합 라이브러리의 구축

도 4의 공정 (C)의 조합 라이브러리의 구축은, 이하와 같이 행하였다. (8)에서 얻어진 DNA 혼합 용액은, (6)에서 나타낸 유전자 집적법에 의해 집적하여 약 400개의 형질 전환체를 얻었다. 얻어진 형질 전환체로부터 랜덤하게 96주의 콜로니를 선택하고, 2ml의 10μg/ml의 테트라사이클린이 들어간 LB 배지에서 밤새 배양하고, 내부의 플라스미드 카피 수를 증폭하기 위하여 IPTG를 최종 농도 1mM이 되도록 첨가하고, 추가로 37℃에서 3h 배양하였다. 얻어진 균체로부터 플라스미드를 추출하였다. 이러한 추출한 플라스미드의 각각의 유전자의 방향을, 서열 번호 27-62에 나타내는 프라이머 세트를 사용하여 PCR법에 의해 결정하였다(도 5). 그 결과, 12유전자의 모든 요소가 갖추어져 있던 것은 75 클론이고, 21 클론은 단위 DNA의 부분적 결손 혹은 중복이 인정되었다. 75 클론 중 71종류의 다른 조합이 존재하며, 4클론에 대해서는 종류의 중복이 인정되었다.

(10) 조합 라이브러리의 효모로의 도입

(9)에서 얻어진 96개의 조합 라이브러리를 아세트산 리튬(LiAc)법을 사용하여 효모에 도입하였다. 구체적으로는, 모균주가 되는 S. cerevisiae YPH499주를 YPDA 배지(10g/L 건조 효모 추출물[나카라이테스크사제], 20g/L 펩톤[벡톤 디킨슨(BD Difco)사제], 20g/L 글루코오스, 40mg/L 아데닌 황산염) 5mL에 식균하고, 30℃, 150 opm으로 밤새 배양하였다. 배양액을 3,000rpm으로 5min 원심 분리하여 배지를 버린 후, 멸균 증류수 5mL로 균체 펠릿을 현탁하였다. 추가로, 3,000rpm으로 5min 원심 분리한 후, 상청을 버리고, TE/LiAc 용액 1.5mL(10ХTE 150μL, 10ХLiAc 150μL, 멸균 증류수 1,200μL)에 균체 펠릿을 현탁하였다. 균체 현탁액 100μL을 1.5mL 에펜도르프 튜브에 옮기고, 플라스미드 DNA(조합 라이브러리) 1 내지 5XμL과 Carrier DNA[다카라 바이오(클론테크)사제] 2μL을 첨가한 후, TE/LiAc/PEG 용액 600μL(10×TE 60μL, 10×LiAc 60μL, 50% PEG3350 용액 480μL)을 첨가하고, 10sec 볼텍스로 혼합하였다. 혼합액을 30℃에서 30min 인큐베이션한 후, 디메틸술폭시드(DMSO) 70μL을 첨가하여 전도혼화하고, 추가로 42℃에서 15min 인큐베이션하였다. 14,000rpm으로 5sec 원심 분리한 후, 상청을 완전히 제거하고, L-류신을 포함하지 않는 100×아미노산 스톡 용액 (4g/L 아데닌 황산염, 2g/L L-히스티딘, 4g/L L-트립토판, 2g/L 우라실, 3g/L L-리신) 250μL를 첨가하여 균체 펠릿을 현탁하고, 멸균 증류수 550μL을 추가한 후, 전량의 현탁액을 SD 배지 (6.7g/L yeast nitrogen base without amino acids(YNB) [벡톤 디킨슨(BD Difco)사제], 20g/L 글루코오스)의 한천 플레이트(배지에 20g/L 한천 분말을 첨가한다)에 펴고, 건조시킨 후에 30℃에서 3일간 인큐베이션하여 형질 전환체를 얻었다.

(11) 출아 효모에 있어서의 이소부탄올 생산성의 평가

얻어진 효모 형질 전환체의 콜로니를 SD 선택 배지(L-류신을 포함하지 않는 100Х아미노산 스톡 용액을 첨가한 SD 배지) 5mL에 식균하고, 30℃, 150 opm으로 3일간 배양하였다. 3,000rpm으로 5min 원심 분리하고 배지를 버린 후, 멸균 증류수 5mL로 균체 펠릿을 현탁하였다. 추가로 3,000rpm으로 5min 원심 분리하여 상청을 버린 후, 새로운 SD 선택 배지 5mL로 균체 펠릿을 현탁하고, 30℃, 150opm으로 48시간 배양하였다. 배양액을 3,000rpm으로 5min 원심 분리한 후, 상청을 회수하였다. 아세톤 45900μL에 회수한 배지 상청 5100μL을 첨가하여 볼텍스로 혼합하고, 12,000rpm으로 5min 원심 분리한 후, 상청을 회수하였다. 회수한 상청을 유리 바이알에 옮기고, 가스 크로마토그래피 질량 분석 장치(GCMS QP2010 Ultra [시마즈 세이사쿠쇼사제])로, DB-FFAP 칼럼[애질런트 테크놀로지사제]을 사용하여 배지 중에 포함되는 이소부탄올의 농도를 정량하였다. 그 결과, 도 5에 도시한 바와 같이, 클론 96의 146mg/L을 필두로 여러가지 이소부탄올 생산량을 나타내는 주가 얻어졌다. 그 중에는 과잉 발현과, 유전자 발현 억제의 종 플라스미드를 효모에 도입한 주의 이소부탄올 생산량(각각 29mg/L와 15mg/L)보다도 생산량이 많은 주가 얻어졌다.

(12) 라이브러리로부터의 우량 플라스미드의 선택과, 라이브러리의 재구축

이소부탄올 생산량이 120mg/ml 이상이 된, 클론 8, 42, 68, 96의 형질 전환에 사용한 플라스미드를 종 플라스미드로 하는, 새로운 조합 라이브러리를 구축하였다(도 6). 먼저, 상기 플라스미드를 갖는 고초균을 대량 배양하고, (7)에서 나타낸 초원심법에 의해 플라스미드를 추출하고, (8)에서 나타낸 방법에 의해 등몰 혼합한 단위 DNA를 준비하였다. 그 후 (6)에서 나타낸 유전 집적을 행함으로써, 약 200개의 형질 첨가로 이루어지는 2사이클째의 조합 라이브러리를 구축하였다. 여기서부터 랜덤하게 선택한 24 콜로니에 대하여 고초균으로부터 플라스미드를 추출하고, (10)에 나타내는 방법으로 개별적으로 효모에 도입하고, (11)에 나타내는 방법으로 이소부탄올 생산량을 측정하였다. 고초균으로부터 추출한 플라스미드에 대하여 별도 (9)에 기재된 방법에 의해 각 단위 DNA 내의 유전자의 방향을 동정하였다. 이러한 결과를 도 7에 나타낸다. 라이브러리는, 집적이 완전히 이루어지지 않은 클론 3과 12의 2개의 클론을 제외하는 22개의 클론에 대하여, 기대한 바와 같이, 4개의 종 플라스미드 중에서 공통으로 되어 있는 제6, 제9, 제11, 제12 단위 DNA가 공통으로 되어 있고, 그 밖의 단위 DNA에 대해서는, 대체로 종 플라스미드의 조성 비율을 반영한 형태가 되었다. 22개 중 다른 조합은 19종류 존재하고, 그 중 2종류는 종 플라스미드가 된 1회째의 라이브러리 클론 68과 96과 동일하였다. 이소부탄올 생산량에 대해서는, 클론 8, 4, 23, 13이, 각각 173, 171, 169, 164mg/1이 되고, 1회째의 라이브러리의 최고값 146mg/L보다도 높은 생산성을 나타내는 클론이 다수 얻어졌다.

<산업상 이용가능성>

본 발명에 따르면, 장쇄 DNA의 조합 라이브러리를 신속하며 효율적으로 구축하는 것이 가능해진다. 특히, 얻어진 플라스미드의 유전자형 확인을 하지 않아도 동일한 라이브러리로부터 선택된 복수의 플라스미드를, 새로운 키메라 라이브러리 구축을 위하여 재이용하는 것이 가능하기 때문에, 2회째 이후의 라이브러리의 구축을 신속하게 행할 수 있다는 특징을 갖는다.

SEQUENCE LISTING <110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KOBE UNIVERSITY <120> A method for constructing chimeric plasmid library <140> PCT/JP2020/013133 <141> 2020-03-24 <150> JP 2019-069798 <151> 2019-04-01 <160> 62 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Plasmid vector <400> 1 ggccttcttg gccaccccgg gccgtcgacg ctctccctta tgcgactcct gcattaggaa 60 gcagcccagt agtaggttga ggccgttgag caccgccgcc gcaaggaatg gtgcatgcaa 120 ggagatggcg cccaacagtc ccccggccac ggggcctgcc accataccca cgccgaaaca 180 agcgctcatg agcccgaagt ggcgagcccg atcttcccca tcggtgatgt cggcgatata 240 ggcgccagca accgcacctg tggcgccggt gatgccggcc acgatgcgtc cggcgtagag 300 gatccacagg acgggtgtgg tcgccatgat cgcgtagtcg atagtggctc caagtagcga 360 agcgagcagg actgggcggc ggccaaagcg gtcggacagt gctccgagaa cgggtgcgca 420 tagaaattgc atcaacgcat atagcgctag cagcacgcca tagtgactgg cgatgctgtc 480 ggaatggacg atatcccgca agaggcccgg cagtaccggc ataaccaagc ctatgcctac 540 agcatccagg gtgacggtgc cgaggatgac 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caacaaggca actctaggtt caataccaaa tcttctaacg gtttcagcag ccatcaaagt 960 aatttcagcc aattcttcag catctggttc atcgttaacg taagtatcag caatgaaggt 1020 gttaccagat ggcaacaaca aagcattcat agcaccagca gtatgaacac catctctata 1080 accgaaaacg ttcttgacaa cagagaagtg ttcatggtaa tcaccaacag taccacaaat 1140 catagcgtca gcttcacctc tttgaaccat gatggcacca ataacagttg ggttagaaat 1200 caaagctctt tgagcttgtt cttgagtgac acctcttctc ttcatgattt ggaagtattc 1260 ggtccagtat tctttgaatc ttgggtcaga ttcattgtta acgatttcga agtcaacacc 1320 ggccttgatt tgtaaaccta acttttggat tctcatttcg atgacgtttg gtctaccaat 1380 caaaattggc ttagccaaac ccaaggtaac taattcttga gtagcgtgta aaactctagc 1440 ttcttcacct tctggcaaaa caactctctt tggagccttt ctagcttgtg agaaaattgg 1500 cttcatgaac aagttggtct tgtaaacgaa ttcggtcaac ttgtcgatgt aaacatcgaa 1560 atcagcaatt ggtctagtag caacaccaga ttccatagca gctttagcaa cagctggagc 1620 aatcttaacg atcaatcttg gatcgaatgg ctttgggatg atatattctg gaccaaaaga 1680 caaatcttga tcaccataag cagatgcaac aacttctgat tgttcagcat gagccaattc 1740 agcaatagct ctaacagcag ccaacttcat ttcttcgtta atagcggtag caccaacatc 1800 caaagcacct ctaaaaatga atgggaagca caagacgttg ttaacttgat ttgggtaatc 1860 agatctaccg gtacagataa tagcgtctgg tctaacttct ttagccaatg gtggcaagat 1920 ttctggttct ggattagcta aagccaaaat cattggggct ctagccattt tcttaaccat 1980 ttcttgagtc aagacttttg gaccagaaca acccaagaaa atatcggcac cttcaataac 2040 atcatccaag gttctcttac catcatcaac aacagcataa gcagcttttg tttcagccat 2100 gttaggttct ctaccttggt agataacacc tttggaatcg caaacaacga tgttgtgctt 2160 ttgtaaaccc aaggcaacca acaaattcat acaagcaata gcagcagcac cagcaccaga 2220 aacaaccatt ctgacatcgg agatgttctt ttcaacaact ctcaaaccgt tcaaaatagc 2280 agcggtagaa ataatagcag taccatgttg atcatcgtgg aaaactggga tgttcattct 2340 ttctctcaac ttttgttcga tgtagaagca ttctggagcc ttaatatctt ccaagttaat 2400 accaccgaaa gtaggttcca aagcagcaac aacttcaatg aacttgtctg gatccaattc 2460 atcaacttcg atgtcgaaaa catcgatacc ggcgaacttt ttgaacaaaa cacctttacc 2520 ttccataact ggtttaccag ccaaagcacc aatattaccc aaacccaaaa cggcagtacc 2580 attagaaata acggcaacca aattacctct agcagtgtac ttgtaagcct tcaatggatc 2640 tttttcaatt tccaaacatg gagcagcaac acctggagaa taagccaaag ccaaatctct 2700 ttgggtagcc aatggttttg ttggagaaac ttggatctta cctggaactg gaaattcatg 2760 gaaatccaag gcagattgct tcaattgatc atccattaag agtaataatt attgcttcca 2820 tataatattt ttatatacct cttattttta tgtattagtt aattaagtat ttttatctat 2880 ctgcttatca ttttcttttc atataggggg ggttggtgtt ttcttgccca tcagattgat 2940 gtcctccaac tcggcactat tttacaaagg gtttttttgt aagagaagga gaagacagat 3000 actaaaccat acgttactcg aaacaaaaaa aaaaaaaatg gaaaaagctg ctatcaacaa 3060 aagacggcct catcaaacct aaagaaacca tgtcagcgtg gcctgtatgg cc 3112 <210> 26 <211> 2705 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression cassette <400> 26 ggcctgtatg gccctactta ttcccttcga gattatatct aggaacccat caggttggtg 60 gaagattacc cgttctaaga cttttcagct tcctctattg atgttacacc tggacacccc 120 ttttctggca tccagttttt aatcttcagt ggcatgtgag attctccgaa attaattaaa 180 gcaatcacac aattctctcg gataccacct cggttgaaac tgacaggtgg tttgttacgc 240 atgctaatgc aaaggagcct atataccttt ggctcggctg ctgtaacagg gaatataaag 300 ggcagcataa tttaggagtt tagtgaactt gcaacattta ctattttccc ttcttacgta 360 aatatttttc tttttaattc taaatcaatc tttttcaatt ttttgtttgt attcttttct 420 tgcttaaatc tataactaca aaaaacacat acataaacta aaaatgttac aattgattgg 480 tgtgaacgga tggatcgtgt tgaaccttaa tcattggtct gtaaactggt tcccacattt 540 gagccttaac ccattgcaag cattcgtcaa aatctcttgg aaccttaaca gtttcacctg 600 gagcaccacc tggaacttgt tcttgttcga ttctggcagt accttcttcc aaagcttgta 660 aaataacggc agttgccaat ctagcagagg tattagtaat ggtatccaaa cctggcaata 720 aacctggtct agaatcacct tctctcaatg gagacaattc agccaattga tcaacggcag 780 cagaaatcat cttgtcggta attgtagtag ctctagacaa aacagcaccc aaaccaatac 840 ctggaaagga gtagcagttg ttgttttcag agattctgta accatcaact ggtggaaatg 900 gagaaccagt agcaaccaaa gcattgttgt tagtccactt catcaaatca gctggaacag 960 cttcatgcaa tctagttggg ttagacaatg ggaagatgat aggtcttgga ttgtgcttat 1020 gcatttcttc aacgacatct tgtgtaaaag caccagcttg agtagaacaa ccaaccaaac 1080 aagtaggctt aacgttttcg acaacatcgt gcaatgatct agtgttaata ccagcccatt 1140 cagcatcaga tttagcgtaa acatgttgag ctggggtaga attagcttcg taggattgca 1200 atatcaaacc tcttctgtcc atcaagaaga tcttttttct ggcttcttct ttgtcgacac 1260 catgagtaac catgtggtta acgatttgat ctgcaatacc taaaccagca gaaccagcac 1320 catagatcaa gactctggta tctttcaaat ctctgttagt gtgcttcaat gcagcaatca 1380 aagaagccat aacaacagca ccagtacctt gaatgtcatc gttgaaggat ggcaattcgt 1440 atctgtactt ttctaataat cttctggcgt tcttaacacc gaaatcttcg aagtgtaaaa 1500 cagcggatgg ataaaccttc ttaacggcct tgatgaactt ttccaagaaa tcgtcgtatt 1560 gcttacctct gattctggag aacttgttac ccatgtacaa ttcatctctg gccaactttt 1620 tgttgtttgt accaacatcc aaacaaactg gcaaaactct acctggatga ataccaccac 1680 acaaggtcat caaagccaac ttagaaatag caattctgac accacctata ccttgatcac 1740 caatacccaa aataccttcg gagtcggaaa caacgatgta atcaacatcc ttatcaccac 1800 cataagtagc caatctacat tcaatggaat ctggttcggt gatatccaaa aagacacctt 1860 ctggttttct gaatctgtga gaataagcag caatagcatc accttcagtt ggagtgtaga 1920 tgattggaac caattctttg atgtgtcttc tgatcaaggc gaagtacaag accttgtttt 1980 gaactctcaa agaagtcatg aaatcgttct tggccaatgg agttttcaag tagcacaatt 2040 gcttgtagga tctttccaat tgttcatcca aagtgttaac ttgtggtggc aacaaagctt 2100 ccaagttgaa agcttctctt tcttcttgag tgaaagcaga acccttgttg aacaaaggtg 2160 agttcaataa ttggaaggat tccaatgggc attcaatagc accttcaaca gtcaatctag 2220 tagcatgtgg atgtggagct tcaaaaatct ttctggctct agaaccaact ggagtcttag 2280 taacttcttc atcggagtat ggcttttgga aggtgttttc tctagtagta gtagccttat 2340 gagatctggt gttagaagag tataatctgg attgttggat tggccacatt aagattaata 2400 taattatata aaaatattat cttcttttct ttatatctag tgttatgtaa aataaattga 2460 tgactacgga aagctttttt atattgtttc tttttcattc tgagccactt aaatttcgtg 2520 aatgttcttg taagggacgg tagatttaca agtgatacaa caaaaagcaa ggcgcttttt 2580 ctaataaaaa gaagaaaagc atttaacaat tgaacacctc tatatcaacg aagaatatta 2640 ctttgtctct aaatccttgt aaaatgtgta cgatctctat atgggttact caggcctctt 2700 tggcc 2705 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gtttgctgtc ttgctatcaa gtataaatag a 31 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 gatttaaacc ttgggcacca ca 22 <210> 29 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gatgatcgct atggttaagg ct 22 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ctaacggatt tctgcacttg at 22 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cgataccaac ttgggctttc t 21 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 gcatgctggt gatgttgct 19 <210> 33 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gccaatactt cacaatgttc gaatct 26 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cgatcaatct tggagacttt gga 23 <210> 35 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 gggctattgc agctgct 17 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 caaggctctt tcactctcct 20 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 gcgttcaatt cgttagcatt acca 24 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 gctgacaaag aatctagaca cttgt 25 <210> 39 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 cttgcataaa ttggtcaatg caagaaatac a 31 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 40 cttctttctt gaaaccagta gcataca 27 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 41 gttgttgtca ttagatatga aggtcca 27 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 42 gccctctttt gaactgtcat ataaatac 28 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 43 gatttgcttc aaacctctgg tagt 24 <210> 44 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 44 gatgggtggt attcatggta tgt 23 <210> 45 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 45 gacaatatat tttcacacaa tgagatttgt agt 33 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 46 caatgaatat cggaaccgca aaca 24 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 47 gctactttgg aagaaggtga ct 22 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 48 gtaggtttgg aagaatatat aaaggttgca 30 <210> 49 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 49 gggagtagat agcaatagtt ctca 24 <210> 50 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 50 gatcattaag ttgcaagcag ttggt 25 <210> 51 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 51 ctaataagta tataaagacg gtaggtattg attgt 35 <210> 52 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 52 gctggcaatg gagaagca 18 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 53 cgctgttcaa gctggtact 19 <210> 54 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 54 cgatgacctc ccattgatat ttaagt 26 <210> 55 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 55 cggatctatt ggattctttc aattggt 27 <210> 56 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 56 gtgatgaagt tgttaaggct aaaaatggt 29 <210> 57 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 57 catttttctt tctctctttc taatatataa attctcttgc 40 <210> 58 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 58 gcagcaacac ctggaga 17 <210> 59 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 59 gttgtcccat tctaattttg gttcttca 28 <210> 60 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 60 ggagtttagt gaacttgcaa catttact 28 <210> 61 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 61 ggagcttcaa aaatctttct ggct 24 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 62 ctttccaggt attggtttgg gt 22

Claims (9)

1. 숙주 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA와, 단위 DNA가 연결된 삽입 DNA를 포함하는 삽입 DNA 유닛을, 적어도 하나 갖는 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법으로서,
   (A) 특정한 연결 순서로 연결할 수 있는, 복수 종류의 단위 DNA를 연결시킨, 삽입 DNA 유닛을 포함하는 플라스미드를, OGAB법에 의해 복수 종류 조제하는 공정,
   (B) 공정 (A)에서 조제한 복수 종류의 플라스미드를, 각각에게 적합한 제한 효소로 처리하여, 단위 DNA로 분해하고, 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 조제하는 공정, 및
   (C) 공정 (B)에서 얻어진 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 사용하여, OGAB법에 의해 단위 DNA를 재집적시켜, 장쇄 DNA 단편을 조제하는 공정
   을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.
2. 제1항에 있어서, 공정 (B)에서 얻어지는 단위 DNA 혼합액에 있어서의, 모든 DNA 단편의 몰 농도 비율이 0.8 내지 1.2인 것을 특징으로 하는, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 공정 (A)에 있어서, 한가지 종류의 삽입 DNA 유닛이 포함하는 단위 DNA의 종류가, 3 내지 60종류인 것을 특징으로 하는, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 (B)에서 사용하는 제한 효소가 3종 이하인, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제한 효소가, 돌출 말단을 생성하는 제한 효소인, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 조제 방법에 의해 얻어진 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편을 포함하는 플라스미드.
7. 숙주 미생물 중에서 유효한 복제 개시점을 포함하는 DNA와, 단위 DNA가 연결된 삽입 DNA를 포함하는 삽입 DNA 유닛을, 적어도 하나 갖는 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법으로서,
   (B') 제6항에 기재된 복수 종류의 플라스미드를, 각각에게 적합한 제한 효소로 처리하여, 단위 DNA로 분해하고, 복수 종류의 단위 DNA 혼합액을 조제하는 공정, 및
   (C) 공정 (B')에서 얻어진 단위 DNA 혼합액을 사용하여, OGAB법에 의해 단위 DNA를 재집적시켜, 장쇄 DNA 단편을 조제하는 공정
   을 포함하는 것을 특징으로 하는, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.
8. 제7항에 있어서, 얻어진 장쇄 DNA 단편을 포함하는 플라스미드를 복수 종류 선택하고, 공정 (B')에 있어서의 플라스미드로서 재이용하는 것을 특징으로 하는, 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법.
9. 제1항 내지 제5항, 제7항, 및 제8항 중 어느 한 항에 기재된 미생물 세포 형질 전환용 DNA 단편의 조제 방법을 사용하는 키메라 플라스미드 라이브러리의 구축 방법.
   

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